[별표 1]

바이러스 및 원생동물 표준시험방법 (제3조 관련)

1. 바이러스 검사 분야

가. 목 적

이 시험방법은「수도법」제28조의2에 의한 바이러스의 분포실태조사를 실시함에 있어 검사결과의 정확과 통일을 기하기 위해 필요한 제반사항에 대하여 규정함을 목적으로 한다.

나. 배양액 및 시약

1) 시료채취과정

가) 2 % 티오황산나트륨(Na2S2O3)용액 - 티오황산나트륨 100 g을 증류수에 녹여 최종적으로 5 L의 보관용액을 제조하고 121 ℃에서 30분간 고압증기 멸균한다.

나) 염산(HCl)용액 - 0.1, 1, 그리고 5M의 염산용액을 각각 5 L, 1 L, 그리고 100 mL 만든다. 용액은 물시료의 pH를 조정하는데 사용하며 적어도 사용하기 24시간 이전에 준비한다.

2) 시료 전처리과정

가) 수산화나트륨(NaOH)용액 - 각각 4 g과 20 g의 수산화나트륨을 최종 부피 100 mL 의 증류수에 녹여 1 M 및 5 M 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

나) 소고기엑스 완충액 - 소고기엑스 V 분말(Difco No. 0115-17이나 동급 제품) 30 g과 글리신(glycine) 7.5 g (글리신의 최종농도 = 0.05M)을 1.9 L의 증류수에 녹여 1.5 % 의 소고기엑스 완충액을 준비한다. 1M 혹은 5M 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 9.5로 맞춘 다음, 증류수로 최종 부피 2 L가 되도록 조절한다. 121 ℃에서 15분간 고압증기 멸균하여 실온에서 사용한다. 소고기엑스 용액은 4 ℃에서 일주일간 혹은 –20 ℃에서 장기간 보관할 수 있다.

새로 들여오는 소고기엑스 V 분말은 유기침전 농축과정에 사용하기 전에 바이러스 회수에 적절한지 다음의 방법으로 검사한다. ① 1 L의 소고기엑스에 200 PFU/mL의 희석된 정도관리 시료를 1 mL 섞어 위에 설명된 대로 유기응집법과 배양성 바이러스 분석법으로 분석해본다. ② 희석되지 않은 시료와 1:5, 1:25로 희석된 시료를 각각의 양성대조군과 함께 분석한다. ③ 3회 수행했을 때 폴리오바이러스의 평균 회수율이 최소 50 % 에 도달해야 한다.

다) 인산1수소나트륨·7수화물(Na2HPO4․7H2O) - 0.15M

40.2 g의 인산1수소나트륨·7수화물을 최종 부피 1,000 mL의 증류수에 녹인 다음, 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 9.0-9.5 사이로 조절하고, 121 ℃에서 15 분간 고압증기 멸균한다.

3) 총 배양성 바이러스 분석과정

제조업체에 의해 명시된 시약의 보관 조건과 배양액의 만료기일을 엄격하게 지켜야 한다.

가) EDTA(Elthylene diamine tetra acetic acid)-트립신(trypsin) 용액(10 L)

30 g의 트립신(1:250) 혹은 25 g의 트립신(1:300)을 6 L 용량의 플라스크에 담긴 2 L의 증류수에 넣고 자석교반막대를 넣는다. 플라스크를 자력교반기(magnetic stirrer) 위에 놓고 트립신 용액을 빠르게 최소한 1시간 동안 섞는다. 이때 트립신 용액은 계속 불투명한 상태로 남아있게 된다. 20 L 용량의 투명한 내산성 플라스틱 용기에 교반막대를 넣고 4 L의 증류수를 넣는다. 플라스틱 용기를 교반기 위에 놓고 회오리를 일으킬 속도로 저으면서 아래의 시약을 첨가한다.

- 80 g 염화나트륨(NaCl), 12.5 g EDTA, 50 g 포도당(dextrose), 11.5 g 인산1수소나트륨․ 7수화물(Na2HPO4․7H2O), 2.0 g 염화칼륨(KCl), 2.0 g 인산2수소칼륨(KH2PO4)

각각의 시약들은 다음 시약을 넣기 전에 완전히 녹여야 할 필요는 없다. 플라스틱 용기에 4 L의 증류수를 더 첨가하고 모든 시약들이 완전히 녹을 때까지 섞는다. 위의 트립신 용액 2 L를 플라스틱 용기의 용액에 첨가하고 최소한 1시간 동안 저어준다. EDTA-트립신 용액의 pH를 7.5-7.7로 맞춘다. 멸균필터를 사용하여 용액을 여과하고 단단히 밀폐하여 4 ℃에 보관한다.

나) 최소 필수 영양 배양액(MEM/L-15) 10 L

(1) 행크스용액(Hanks' salts)과 L-글루타민이 포함된 이글스 최소 필수영양배양액(Eagle's minimum essential medium, MEM). 단, 탄산수소나트륨(NaHCO3)은 포함되지 않은 것을 사용한다.

(2) L-글루타민이 포함된 레보비츠 배양액(Leibovitz's L-15 medium, Life Technologies Product No. 430-1300이나 동등 제품). 20 L 용량의 플라스틱 용기에 교반막대와 4 L의 증류수를 넣는다. 플라스틱 용기를 교반기 위에 놓고 회오리를 일으킬 속도로 저으면서 5 L 단위의 L-15 배양액 내용물을 첨가한다. 배양액이 들어있던 용기를 200 mL의 증류수로 3번 세척하고 세척한 증류수도 플라스틱 용기에 부어 넣는다. 배양액이 균일하게 분산될 때까지 젓는다(L-15 배양액은 불균일하게 보일 수도 있으나 완전히 녹여야 할 필요는 없다). 위의 플라스틱 용기에 3 L의 증류수를 넣고 5 L 단위의 MEM 배양액 내용물을 첨가한다. 배양액이 들어있던 용기를 200 mL의 증류수로 3번 세척하고 세척한 증류수도 용기에 부어 넣는다. 800 mL의 증류수와 7.5 g의 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 넣고 60분간 더 섞어준다. MEM/L-15 배양액을 압력용기에 옮겨 담고 양압(positive pressure)을 사용하여 0.22 ㎛ 필터로 여과한다. 여과된 배양액을 BGM(Buffalo Green Monkey) 세포 배양에 적절한 부피로 나누어 담고(즉, 1 L 용량의 배양액 용기에 900 mL씩 담는다), 뚜껑으로 단단히 밀폐시켜 4 ℃에서 최대 2개월 동안 보관한다.

다) 트리판블루(Trypan blue) 용액 (100 mL)

이 시약은 살아 있는 BGM 세포의 수를 직접적으로 계수하는데 사용된다.  트리판블루를 제조하고 사용하는데 있어서 피부에 닿거나 흡입하지 않도록 주의한다(이 물질은 미국 환경보호청의 발암물질 후보 리스트에 등재되어 있다).  제조 및 사용 시에 고무장갑을 끼는 것이 좋다.

0.5 g의 트리판블루를 250 mL 플라스크에 담긴 100 mL의 증류수에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 흔들어준다. 위 용액을 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균 한다. 나사형 뚜껑이 있는 용기에 담아 실온에 보관한다.

라) 페니실린-스트렙토마이신 저장용액 [100 mL : 100,000 units/mL 페니실린과 100,000 ㎍/mL 스트렙토마이신]

10,000,000 U(units)의 페니실린 G와 10 g의 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 250 mL 플라스크에 담긴 100 mL의 증류수에 섞는다. 항생제가 완전히 용해될 때까지 교반기로 저어준다. 항생제를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 멸균한 다음, 나사형 뚜껑이 딸린 용기에 10 mL씩 담는다.

마) 테트라싸이클린(tetracycline) 저장용액 (50 mL)

1.25 g의 테트라싸이클린 염산염(hydrochloride)과 3.75 g의 아스코빅산을 50 mL의 증류수가 담긴 125 mL 용량의 플라스크에 넣는다. 항생제가 완전히 용해될 때까지 교반기로 섞는다. 항생제를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 멸균한 다음, 나사형 뚜껑이 딸린 용기에 5 mL씩 담는다.

바) 암포테리신 B (Amphotericin B, 푸지존 (fungizone)) 저장용액(25 mL)

0.125 g의 암포테리신 B(푸지존), 페니실린 G를 25 mL의 증류수가 담긴 50 mL 용량의 플라스크에 넣는다. 항생제가 완전히 용해될 때까지 교반기로 섞는다. 항생제를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 멸균한 다음, 나사형 뚜껑이 딸린 용기에 2.5 mL씩 나누어 담는다.

사) 성장용 배양액(Growth medium)

MEM/L-15 배양액에 10 % 소태아 혈청(fetal calf serum)과 항생제를 첨가하여 제조한다(100 mL의 혈청, 1 mL의 저장용 페니실린-스트렙토마이신, 0.5 mL의 저장용 테트라싸이클린, 0.2 mL의 저장용 푸지존을 900 mL의 MEM/L-15 배양액에 첨가한다).

세포배양액에 첨가하는 혈청으로는 멸균된 소태아(fetal calf), 면역글로불린이 제거된 소신생아(gammaglobulin-free newborn calf), 혹은 철이온이 보강된 송아지의 혈청을 사용하되 바이러스나 박테리오파지(bacteriophage), 마이코플라스마(mycoplasma) 등에 의한 오염이 없는 등급의 것이어야 한다.  혈청의 각 롯트(lot)는 구입하기 이전에 세포 성장과 세포독성에 대해 검사한다. 혈청은 –20 ℃에서 장기간 보관할 수 있으나 일단 혈청을 녹인 후에는, 병째로 56±1 ℃ 항온수조에서 30분간 불활성화(heat-inactivation)시켜 단기간만 4 ℃에 보관한다.

아) 유지용 배양액(Maintenance medium)

MEM/L-15 배양액에 항생제와 함께 2 % 혹은 5 % 소태아 혈청을 첨가하여 제조한다(20 혹은 50 mL의 혈청, 성장용 배양액와 동일한 양의 항생제들, 80 혹은 50 mL의 증류수를 첨가한다). 세포변성의 관찰 실험에서는 2 %의 혈청을 첨가한 유지용 배지를 사용한다. 성장용(growth) 및 유지용(maintenance) 배양액은 사용하는 날에 제조되어야 한다.

4) 세포독성물질의 최소화과정

가) 세척액

8.5 g 염화나트륨(NaCl)을 980 mL의 증류수에 녹인다. 이 용액을 고압증기 멸균하고 상온으로 식힌 후 20 mL의 소태아 혈청을 첨가하여 혼합한다. 세척액은 4 ℃에 3개월 동안 보관이 가능하며 –20 ℃에서는 장기간의 보관이 가능하다.

다. 기구 및 재료

1) 시료채취과정

가) 표준필터장치 조립용 부품(그림 1 참조)

표준필터장치(standard filter apparatus)는 전필터(prefilter), 탈염소화 또는 pH의 조정이 필요할 때 이외에는 모든 시료채취에 사용된다.

(1) 역류조절기(Backflow Regulator, BR) 1개

(2) 회전식 고정장치(Swivel Female insert with garden hose thread, SF) 1개

(3) 압력튜브(Braided Tubing, BT) 1/2" clear 3 조각

(4) 호스 클램프(Hose Clamp, HC1) 6개

(5) 호스 고정나사 1(Hose Fitting, HF) 1개 - nylon, 3/8" male NPT(National Pipe Thread) x 1/2" tubing ID

(6) 압력조절기(Pressure Regulator) 1개

(7) 이음관(PVC Nipple, PN) 1개 - 3/8" male NPT (263A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다)

(8) PVC T자 연결관 1개 - PVC TEE with 3/8" female NPT ports. 63A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다.

(9) 마모 감소 이음관(Reducing Bushing, RB1) 1개 - 3/8" NPT(M) x 1/4" NPT(F). 63A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다.

(10) 압력게이지 1개 – 0~30 PSI(pound per square inch). 263A regulator를 사용할 때는 이 부품을 1/4" gauge port에 연결한다.

(11) 어댑터(Reducing Adaptor, RA) 1개 - 1/2" female NPT x 3/8" male NPT

(12) 숫나사 신속 연결기 1(Male Quick Connect, MQ1) 1개 - 1/2" NPT. hose fittings과 braided tubing의 연결이 적절하면 quick connects를 사용하지 않아도 좋다.

(13) 암나사 신속 연결기 2(Female Quick Connects, FQ1) 2개 - 1/2" female NPT

(14) 감속이음관(Reducing Nipples, RN1) 2개 - 3/4" male NPT x 1/2" male NPT

(15) 카트리지 하우징(Cartridge Housing with wrench, CH) 1개

(16) 필터 카트리지 1개  - positively charged filter, ZetaPor Virosorb.

(17) 숫나사 신속 연결기 2(Male Quick Connect, MQ2) 1개 - 1/2" female NPT

(18) 호스 고정나사 2(Hose Fitting, HF2) 1개 - 1/2" male NPT x 1/2" tubing ID

(19) 유량계(Water Meter, WM) 1개 - 유량계는 수평의 위치에서 사용되어야 하며 추위에 의해 동파되지 않도록 잘 보호해야 한다. 실험자는 유량계의 눈금이 나타내는 계량 단위를 정확히 알아야 한다.

(1 gal= 0.1337 ft3 또는 3.7854 L; 1 ft3= 7.481 gal 또는 28.316 L)

(20) 호스고정나사 3(Hose Fitting, HF3) 1개 - 3/4" male NPT x 1/2" tubing ID

(21) 유량조절밸브(Flow Control Valve, FV) 1개

나) 전필터(prefilter) 모듈 조립용 부품 (그림 2 참조)

탁도가 75 NTU를 초과하거나 여하한 이유로 인해 시료의 최소량을 채취할 수 없을 경우에 표준필터장치의 앞부분에 설치하여 사용한다.

(1) 전필터카트리지(PC) 1개 – 10 ㎛ 폴리프로필렌

(2) 암나사 신속 연결기(female quick connect, FQ1) 1개

(3) 감속 이음관(reducing nipple, RN1) 2개

(4) 숫나사 신속연결기(male quick connect, MQ2) 1개

(5) 카트리지 하우징(cartridge housing, CH) 1개

다) 단일주입기 모듈 조립용 부품(그림 2 참조)

pH 저감이 요구되는 원수 또는 처리수와 탈염소화가 필요한 처리수를 위한 장치이다.

(1) 암나사 신속연결기(Female Quick Connects, FQ2) 2개 - 1/2" male NPT

(2) 숫나사 엘보(Male Elbows, ME) 4개  - 3/8" male NPT

(3) 감속 이음관(Reducing Nipples, RN2) 2개 - 3/8" male NPT x 1/2" male NPT

(4) 마모 감소이음관(Reducing Bushings, RB2) 2개 - 3/8" female NPT x 1/2" male NPT

(5) 유입관(In-Line Injectors, IN) 3개 - 계량펌프, metering pump와 적절한 connector로 injector를 대체할 수 있다.

(6) 호스 집게(hose clamp, HC) 3개

(7) 표준장치를 조립할 때와 마찬가지로 감소 어댑터(RA) 4개,  PVC T자관 (TE) 4개, 마모 감소이음관 1(RB1) 2개, 압력계(pressure gauge: PG) 2개, 암나사 신속 연결관 1(FQ1) 2개, 숫나사 신속 연결관 1(MQ1) 2개, 숫나사 신속 연결관 2(MQ2) 2개가 추가적으로 필요하다.

라) 기타

(1) 휴대용 pH 측정계

(2) 휴대용 온도 측정계

(3) 얼음팩

(4) 입구가 넓은 1 L 용량의 폴리프로필렌 병

(5) 휴대용 아이스(단열)박스

(6) 알루미늄 호일, 기록용지, 호스 연결집게, 수술용 장갑, 클램프 조절용 드라이버 혹은 플라이어, 유성펜.

(7) 30 PSI에서 11.4 L/min을 공급할 수 있는 화학약품내성 펌프와 적당한 connector(원수나 처리수를 채취하는데 필요한 적정한 수압이 발생되는 수도꼭지를 사용할 수 없을 경우, 또는 정도관리 시료를 조작할 경우에 사용한다). 펌프의 초기화는 펌프제조사의 권고에 따라 수행한다.

마) 장치의 조합

표준여과장치는 조절기(regulator)모듈, 필터하우징(filter housing)모듈, 배출기(discharge) 모듈로 구성되며 ‘모듈'이란 여러 부품이 모여 구성하는 하나의 기능단위를 말하는 것으로 필요한 경우 채수장치 전체로부터 간단한 조작으로 분리해낼 수 있어야 한다. 채수장치의 조립은 수중바이러스 검출 및 분석연구에 대해 국가로부터 지정받은 분석실험실에서 수행한다. 모든 비압착식 나사형 연결부위(threaded & non-compression fitting)에는 테프론 테이프를 사용하여야 한다.

(1) 조절기 모듈 - 그림 1에서와 같이, 역류조절기(BR)와 회전식 고정장치(SF)를 차례로 연결한다. 적당한 길이의 압력튜브(BT) 한 조각을 호스 클램프를 이용하여 암나사 회전식 연결관의 튜브 연결기(HC1)에 연결한다. 튜브의 다른 한쪽 끝은 3/8 x 1/2" 호스이음관(HF1)에 클램프로 연결한다. 호스 이음관을 돌려 압력조절기(PR)의 유입구에 연결한다. 압력조절기의 배출구는 PVC 이음관(PN)을 이용하여 PVC T자관(TE)과 연결한다. 압력계(PG)는 마모 감소이음관(RB)를 이용하여 PVC T자관의 꼭대기에 연결한다. 감속 어댑터(RA)를 PVC T자관의 마지막 남은 연결부위에 부착한다. 감속 어댑터에는 숫나사 신속 연결기(MQ1)를 부착한다.

(2) 필터하우징 모듈 – 감속 이음관(RN1)에 암나사 신속 연결기(FQ1)를 부착한다. 감속 이음관(RN)은 카트리지 하우징(CH)의 유입구에 연결한다. 다른 하나의 감속 이음관을 하우징의 배출구에 연결한다. 감속 어댑터에 숫나사 신속 연경기(MQ2)를 부착한다.

(3) 배출기 모듈 – 호스 고정기(HF2)에 암나사 신속 연결기(FQ1)를 부착한다. 적당한 길이의 압력호스를 호스 클램프(HC1)를 사용하여 호스 고정기에 연결한다. 관의 다른 한쪽 끝은 새 호스 클램프(HC1)를 사용하여 회전식 암나사 유입구에 부착한다. 회전식 암나사 유입구를 유량계(WM)의 유입구에 부착한다. 또 하나의 회전식 암나사 유입구를 유량계(WM)의 배출구에 부착하고 호스 클램프(HC1)를 사용하여 압력호스(BT) 한 조각과 연결한다. 관의 다른 한쪽 끝은 호스 클램프(HC1)를 사용하여 호스 고정기(HF3)에 부착한다. 호스 고정기를 돌려 유속조절밸브의 유입구에 끼워 넣는다. 배수구까지 충분한 길이의 튜브를 연결하기 위해 여분의 호스 고정기를 유속조절밸브에 부착할 수 있다. 배출기 모듈을 멸균할 필요는 없다.

(4) 신속 연결기(Quick connector)를 사용하여 필터하우징 모듈을 조절기 모듈과 연결한다. 연결된 조절기 및 필터하우징 모듈은 염소로 멸균하여야 한다. 바이러스용 양전하필터 카트리지(FC)는 전멸균하고 무균 조작하여 카트리지 하우징에 넣는다. 카트리지하우징의 덮개를 다시 덮고 카트리지하우징 렌치(wrench)를 사용하여 완전히 조인다. 하우징을 흔들어 필터가 빈틈없이 장착되었는지 확인한다. 제대로 장착된 필터는 흔들리지 않는다. 수송과정의 편의를 위해 조절기 모듈과 필터하우징 모듈을 분리해도 무방하다. 단, 모듈과 연결되는 모든 개구부는 멸균된 알루미늄 호일로 빈틈없이 싸주어야 한다.

(5) 전필터 모듈의 조립 - 그림 2와 같이, 암나사 신속 연결기(FQ1)를 감속 이음관(RN1)에 차례로 연결한다. 감속 이음관을 카트리지하우징(CH)의 유입구와 연결한다. 다른 하나의 감속 이음관은 하우징의 배출구에 연결한다. 숫나사 신속 연결기(MQ2)는 감속 어댑터에 부착한다.

조합된 장치는 염소로 멸균소독하고 미리 멸균소독된 폴리프로필렌 전필터 카트리지를 무균조작하여 하우징에 장착한다. 양 말단은 멸균된 알루미늄 호일로 덮는다. 전필터 모듈은 사용 전까지 깨끗한 장소에 보관한다.

(6) 단일 주입기(single injector) 모듈 - 그림 2와 같이 순서대로 각 부품을 조립한다. 감속 어댑터(RA)에 암나사 신속 연결기(FQ1)를 부착한다. 어댑터를 주입기(IN)의 유입구에 연결한다. 주입기의 배출구를 PVC 이음관(PN)를 경유하여 PVC T자관 (TE)에 연결한다. 마모 감소 이음관(RB1)을 사용하여 압력계(PG)를 PVC T자관의 꼭대기 부분과 연결한다. 감속 어댑터(RA) 다른 하나는 PVC T자관의 남은 연결부위에 부착한다. 감속 어댑터에는 숫나사 신속 연결기(MQ1)을 부착한다.

단일 및 이중 주입기 모듈을 염소로 멸균한다. 주입기의 개구부를 포함, 각 말단을 멸균된 알루미늄 호일로 씌운다. 주입기 연결관(Injector Tubing: IT)의 안쪽 및 바깥쪽 표면 모두 멸균한다. 조작 중에 오염시키지 않고도 양 말단을 떼어낼 수 있도록 연결관은 멸균된 플라스틱 주머니나 랩으로 싼다. 주입기 모듈은 사용 전까지 깨끗한 장소에 보관한다.

(7) 이중 주입기(double injector) 모듈 - 그림 2와 같이 순서대로 각 부품을 조립한다. 감속 어댑터(RA)에 암나사 신속 연결기(FQ2)를 부착함으로써 중심부분을 조립한다. 어댑터는 PVC T자관 (TE)의 상부 연결부에 연결한다. PVC T자관 연결부 중 하나에 숫나사 엘보(ME)를 부착한다. 다른 연결부에는 감속 이음관(RN2) 하나를 부착한다. 만약 신속 연결기 대신에 범용 볼형 조인트(union ball joint)를 사용할 경우에는 PVC 이음관을 나머지 하나의 연결부에 부착한다. 주입기(IN)의 유입구 방향을 숫나사 엘보(ME)에 연결한다. 주입기의 배출구에도 숫나사 엘보 하나를 부착한다. 숫나사 엘보(ME)에는 새 PVC T자관을 연결한다. 감속 이음관(RN2 또는 PVC 이음관)을 이 두 번째 PVC T자관의 다른 한쪽 끝에 연결한다. 마찬가지로 숫나사 신속 연결기(MQ2) 하나를 위의 감소 이음관에 부착한다(또는 두 번째 union ball joint의 한 부분을 PVC 이음관에 부착한다). 두 번째 PVC T자관의 상단 연결부(top connector)를 PVC 이음관을 이용하여 세 번째 PVC T자관에 연결한다. 마모 감속 이음관(RB1)을 사용하여 압력계를 세 번째 PVC T자관의 머리부분에 연결한다. 감속 어댑터(Reducing adaptor)는 세 번째 PVC T자관의 남은 연결부에 부착한다. 감속 어댑터에 숫나사 신속 연결기를 부착한다. 두 개의 숫나사 엘보(ME)를 두 번째 주입기의 유입구와 배출구에 각각 부착한다. 두 개의 마모 감소 이음관(RB2) (또는 union ball joint를 사용할 경우, 바닥부분)를 숫나사 엘보에 연결한다. 각 마모 감소 이음관에 암나사 신속 연결기(FQ1)를 연결한다. 흐름의 방향이 첫 번째 주입기와 동일하도록 두 번째 주입기의 위치를 조정한다(주입기상의 화살표가 모두 조립품의 압력계 방향을 향해야 한다). 조립품의 완성을 위해 2개의 암나사 신속 연결기를 주요 부분의 숫나사 신속 연결기와 연결한다(또는 union ball joint를 사용할 경우 union ball joints의 두 부분을 연결).

2) 시료전처리과정

가) 바이러스 탈리과정

(1) 압력계가 장치된 양압(positive pressure)의 공기 혹은 질소

(압력원이 실험실의 공기 호스나 펌프라면, 반드시 오일필터나 공기필터가 장착되어 있어야 한다.)

(2) 5-20 L 용량 압력용기(dispensing pressure vessels)

(3) 복합 전극을 사용하는 pH 측정기: 최소 0.1 pH 단위의 정밀도

(4) 나사형 클램프가 달린 멸균 가능한 압력호스(inner-braided tubing)

(5) 교반기(magnetic stirrer)와 교반막대(magnetic stir bar)

나) 유기응집 농축과정

(1) 냉장이 가능한 원심분리기 (2,500 - 10,000 × g)

(2) 나사형 뚜껑이 부착된 원심분리용 용기 (100 – 1000 mL 용량)

(3) 전필터가 장착된 1회용 카트리지 타입의 멸균용 필터 (0.22 ㎛)

판매용 필터가 막힐 정도의 시료는 멸균 필터를 많이 겹쳐서 여과에 사용할 수 있다. 0.22 ㎛ 필터를 유리섬유 전필터(fiber glass prefilter)와 여러 장 겹쳐서 멸균된 필터묶음을 만든다. 위쪽에 AP20 전단계필터를, 아래쪽엔 0.22 ㎛ 필터가 놓이도록 디스크필터 홀더에 쌓는다. 필터묶음은 각각 사용된 뒤에는 해체하여 0.22 ㎛ 필터에 이상이 없는지 검사한다. 필터에 흠이 있거나 파손된 필터로 여과한 배지는 새로운 필터로 재여과 한다.

(필터를 사용하기 직전에는 항상 pH 7.0-7.5의 소고기엑스 완충액 10-20 mL를 여과시킨다. 이 과정은 시료를 여과하는 사이에 필터에 바이러스가 흡착되는 것을 방지한다.)

3) 총 배양성 바이러스 분석과정

가) 무균작업대 (Laminar Flow Microbiological Safety Cabinet)

나) CO2 배양기 (36.5±1 ℃)

다) 피펫

라) 초자기구, 파이렉스 (저장용기들은 밀폐가 가능한 뚜껑이 부착되어 있어야 한다.)

마) 원형 필터(disc filter) 홀더 – 142 ㎜ 혹은 293 ㎜ 반경의 원반형 필터 지지대(양압형 필터 지지대)

바) 멸균용 필터묶음 – 0.22 ㎛ 미세공 필터 (Millipore Product No. GSWP 142 50 과 GSWP 293 25나 동등제품). 유리섬유 전필터(prefilter: Millipore AP15 142 50 혹은 AP15 293 25 그리고 AP20 142 50 혹은 AP20 293 25).

AP20 및 AP15 전필터와 0.22 ㎛ 멸균용 필터를 디스크 필터 홀더에 쌓는다. 가장 위쪽에는 AP20 전필터를, 가장 아래쪽에는 0.22 ㎛ 멸균용 필터를 쌓는다. 사용 후에는 항상 필터묶음을 해체하여 0.22 ㎛ 멸균용 필터가 완전한지를 확인한다. 파손된 필터로 여과된 배양액은 다른 필터로 다시 여과한다.

사) 바이러스용 양전하필터 카트리지 – 10인치 또는 5인치 바이러스용 양전하필터 (Cuno, Cat. No. 45144-01-1MDS 또는 Argonide, Cat. No. VS2.5-5나 동등 제품)를 장착할 수 있는 10인치 또는 5인치 카트리지

아) 배양용 캡슐(culture capsule) 필터

자) 세포배양 용기 - 파이렉스, 소다 혹은 플린트(납) 유리, 플라스틱 용기와 플라스크, 롤러 병(용기들은 투명한 유리나 플라스틱으로 만들어져 배양액을 바깥쪽에서 관찰할 수 있어야 하며 밀폐가 가능한 뚜껑이 있어야 한다. 플라스틱 용기는 세포들이 부착될 수 있도록 제조당시 적절한 처리가 된 것이어야 한다.)

차) 검은 고무 라이너(Liner)가 있는 나사형 뚜껑

카) 롤러 기구(저장용 배양세포의 유지를 위해 롤러 병이 사용될 때만 필요하다.)

타) 항온수조(56±1 ℃로 고정)

파) 광학현미경, 40 X, 100 X, 400 X 배율 렌즈

하) 도립광학현미경, 40 X, 100 X, 400 X 배율 렌즈

갸) 세포계수기(hemocytometer)

냐) 원뿔형(conical) 원심분리용 튜브 – 50 mL, 250 mL 용량

댜) 조직배양용 튜브 걸이(rack)

랴) 튜브를 연결할 수 있는 배출구가 있는 흡입기 타입의 병 – 2,000 mL 용량 (파이펫팅 기계를 사용하기 위한 것)

먀) 저장용 바이알(vials) - 2 mL용량 (-70 ℃에서 견딜 수 있는 것)

라. 실험과정

1) 시료채취과정

채취자는 반드시 멸균된 수술용 장갑을 착용해야 하며 시료가 바이러스에 오염될 수 있는 조건을 피해야한다. 장갑을 착용한 손이 사람의 피부나 오염되었을 수 있는 부품에 닿았을 경우 새 장갑으로 바꿔 착용해야 한다.

가) 채취할 수도꼭지 또는 양수펌프의 배출구를 열고 2-3분 혹은 꼭지를 통해 나오는 물에서 찌꺼기가 없어지거나 탁도가 균일해질 때까지 흘려보낸 후 꼭지를 잠근다.

나) 불꽃버너를 이용하여 수도꼭지나 배출구 부위를 가열하여 멸균한다.

다) 새 수술장갑을 끼고 조절기 모듈의 유입부 쪽 알루미늄 호일을 제거한 다음 수도꼭지 또는 배출구에 다음의 순서대로 연결한다.

(수도꼭지 - 조절기 모듈 - 배출기 모듈 – 1 L 용량 플라스틱 병)

라) 수도꼭지를 천천히 열어 수압이 30 PSI 정도가 되도록 한다. 만일 최고 수압이 30 PSI를 넘지 못하면 압력조절기를 최대압력까지 조절한다.

마) 이후 약 76 L 정도의 물을 흘려보낸 후 시료채취기록부에 시료번호, 채취위치, 채취자의 이름 등을 기록하고 플라스틱 병에 담긴 물시료의 pH, 온도, 탁도를 측정하여 기록한다.

바) 수도꼭지를 잠그고 시료가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) 원수시료의 채취에서 부가장치가 필요한 조건과 설치

(가) pH가 8이상일 때

- 단일주입기 모듈을 조절기 모듈과 배출기 모듈 사이에 연결한다.

- 멸균된 매스실린더에 0.1M 염산 용액을 채우고 단일주입기 모듈에 연결된 튜브의 말단을 염산 용액에 담근다.

- 수도꼭지를 열고 단일주입기의 우회수로(water bypass) 나사(상단의 큰 나사)를 이용하여 주입기의 압력을 조절기 압력보다 35 % 낮게 조정한다(예,  만일 조절기의 압력이 30 PSI일 때 주입기의 압력은 < 19 PSI).

- 1 L 용량 플라스틱 병에 담긴 물시료의 pH를 지속적으로 측정하면서 주입기의 미세조절나사를 조정해 시료가 pH 6.5-7.5로 유지되도록 염산 용액의 유입을 조정하고 변화가 없으면 우회수로나사를 고정한다.

- 주기적으로 시료의 pH가 6.5-7.5의 범위 이내인지 확인하고 바이러스시료채취기록부에 pH를 기록한 다음 수도꼭지를 잠근다.

(나) 탁도가 75 NTU 이상일 때

- 전필터 모듈을 다음의 순서대로 장착한다.

(조절기 모듈 - 전필터 모듈 - 필터 모듈 - 배출기 모듈)

(2) 정수시료의 채취에서 부가장치가 필요한 조건과 설치

(가) pH가 8 이상일 때

- pH 조절과 잔류염소의 제거를 위해 이중주입기 모듈을 다음의 순서대로 연결한다.

(조절기 모듈 - 이중주입기 모듈 - 배출기 모듈)

- 연결 후 수도꼭지를 열어놓은 상태로 각 주입기의 우회수로나사를 시계방향으로 끝까지 돌려 완전히 닫는다.

- 나사를 시계반대방향으로 반 바퀴씩 돌리면서 이중주입기의 압력이 조절기 압력보다 35 % 낮도록 조절한다.

- 멸균된 튜브로 주입기와 0.1 M 염산 용액이 담긴 매스실린더를 연결하고,  1 L 플라스틱 병에 담긴 물시료의 pH가 6.5-7.5가 되도록 조절한 후 pH를 시료채취기록부에 기록한다.

- 이중주입기의 나머지 한쪽 튜브는 2 % 티오황산나트륨용액이 담긴 다른 매스실린더에 넣고 2 % 티오황산나트륨 용액을 물 1 gal 당 10 mL가 주입되도록 다음 식을 이용하여 주입율을 조정하고 눈으로 계속 감시한다.

유속 (L/min)	×	티오황산나트륨 10 mL	=	티오황산나트륨 주입율 (mL/min)
		수량(L)

(나) pH가 8 이하일 때

- 잔류염소 제거를 위해 단일주입기를 연결하여 위와 같이 물 약 4 L(1 gal)당 2 % 티오황산나트륨 용액 10 mL가 주입되도록 한다.

사) 바이러스 시료채취기록부에 시료채취일, 시작 시간, 유량계의 처음 수치를 기록한다.

아) 필터하우징 모듈의 알루미늄 호일을 벗겨내고 배출기 모듈 앞에 연결한다.

(조절기 모듈 - 전필터 혹은 주입기 모듈 - 필터하우징 모듈 - 배출기 모듈)

자) 천천히 물을 흐르게 하면서 필터하우징 상단의 감압단추을 눌러 필터하우징 내부의 공기가 완전히 빠지도록 한 후 감압단추를 놓고 수도꼭지를 완전히 연다.

차) 조절기의 압력은 30 PSI 이하, 주입기의 압력은 조절기 압력보다 35 % 낮게 조정하고 원수는 200-300 L, 처리수는 1,500-1,800 L를 통과시킨 후 수도꼭지를 잠근다.

카) 바이러스 시료채취기록부에 시료채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치를 기록한다. 주입된 염산용액 및 티오황산나트륨 용액의 양이 전체 채취량에는 영향을 미치지 않는 것으로 간주한다. 시료채취과정 동안 시료에 이상이 발견되지 않는지 지속적으로 주의를 기울이고 필터가 막히거나 염산 및 티오황산나트륨 용액 등의 첨가로 인해 흐름이 변화할 수 있음에 유의한다.

타) 새 수술장갑을 끼고 수도꼭지로부터 시료채취기구를 떼어낸다.

파) 시료채취기구로부터 필터 모듈을 분리한다. 필터하우징을 거꾸로 뒤집어 남은 물을 버린 후 바로 세워서 필터하우징과 연결된 양끝의 개구부를 멸균된 알루미늄 호일로 싼다. 전필터 장치를 사용했을 경우 동일한 방법으로 취급한다.

하) 필터하우징을 플라스틱 백에 넣어 아이스박스에 담고 아이스팩으로 덮어 냉장상태(냉동되어서는 안 된다)로 만들어 준 후 즉시 바이러스 분석실험실로 보낸다.

2) 시료의 전처리 과정

가) 내부정도관리 및 수행평가시료

내부정도관리시료는 음성정도관리시료 1개와 양성정도관리시료 1개로 구성되어 연 2회 이상의 자체적인 정도관리에 사용되며, 그 자료를 보관한다. 측정능력평가 시료는 검사기관 지정신청과 지정 후 지도점검 시에 이용된다.

(1) 내부정도관리시료

(가) 음성정도관리시료: 표준필터장치에 멸균된 바이러스용 양전하필터 카트리지를 장착한다.

(나) 양성정도관리시료: 멸균된 폴리프로필렌 용기에 증류수 40 L를 넣고 약 200 PFU(Plaque Forming Unit)/mL 농도의 약독화 폴리오바이러스 정도관리용 저장용액 1 mL을 첨가한다. 잘 섞은 물을 펌프를 이용하여 바이러스용 양전하필터가 들어 있는 표준필터장치를 통과시킨다. 다음에 설명된 ‘탈리’, ‘유기응집’ 및 ‘총 배양성 바이러스분석법’에 따라 바이러스용 양전하필터를 처리 및 분석한다.

(2) 수행평가시료

역가를 밝히지 않은 약독화 폴리오바이러스를 바이러스용 양전하필터 카트리지에 심어 제공되는 수행평가시료는 본 시험방법의 탈리, 유기응집, 총 배양성 바이러스분석법 및 시료와 함께 공지된 사항에 따라서 처리 및 분석한다.

나) 바이러스 탈리과정

필터카트리지는 냉장된 상태로 분석실험실에 도착하여야 하며 냉동되어서는 안된다. 도착조건은 시료채취기록부에 기록되어야 한다. 냉장된 상태로 도착한 필터는 시료채취 시작시간으로부터 72시간 이내에 탈리과정을 시작해야 한다.

(1) 바이러스용 양전하필터가 들어 있는 필터하우징의 유입구와 배출구를 튜브로 연결하고 유입구는 공기나 질소압력원에, 배출구는 멸균된 폴리프로필렌 또는 유리 비이커에 다음의 순서대로 각각 연결한다.

(2 L 용량 비이커 - 튜브 - (배출구)필터하우징(유입구) - 튜브 - (배출구)멸균된 압력용기(유입구) - 오일필터가 장착된 튜브 – 압력원(양압))

(2) 적당한 압력을 주어 필터하우징 내부의 남은 물을 완전히 제거한 다음 필터하우징의 감압밸브(vent/relief valve)를 열어 압력을 풀어준다.

(3) 압력용기의 뚜껑을 열고 미리 데운 1.5 % 소고기엑스 완충액(pH9.5) 1 L를 넣고 뚜껑을 닫은 후 감압밸브를 닫는다.

압력용기를 사용하는 대신, ① 멸균된 튜브가 장착된 연동펌프(peristaltic pump)를 사용하여 소고기엑스 완충액을 카트리지 하우징으로 밀어 넣거나 또는, ② 필터하우징(하우징의 내벽과 필터카트리지 바깥 면 사이의 공간)에 직접 부어 넣은 후 양압을 이용하여 완충액이 필터를 통과하도록 해도 무방하다.

(4) 필터하우징의 감압단추를 누른 상태로 천천히 압력을 가하여 필터하우징 내부의 공기를 빼내면서 소고기엑스 완충액이 필터하우징 내에 완전히 차도록 한 다음 감압단추를 통해 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 뗀다.  필터하우징의 감압단추를 조작할 때와 흘러넘친 소고기엑스 완충액을 닦을 때는 수술장갑을 착용하고 소독용 요오드 가제를 사용한다.

(5) 압력을 끄고 1분간 기다려 바이러스용 양전하필터에 완충액을 충분히 접촉시킨다.

(6) 다시 적절한 압력을 주어 완충액이 서서히 필터를 통과하도록 하고 통과한 완충액은 멸균된 비이커에 수집한다.  압력용기의 배출구 튜브를 통해 공기가 필터하우징에 유입되기 시작하면 필터하우징을 들어 올려 뒤집어서 소고기엑스 완충액이 완전히 빠지도록 한다.

(7) 비이커에 수집된 소고기엑스 완충액을 압력용기에 다시 옮겨 담고 3)-6) 단계의 과정을 반복한다.

(8) 1 M 염산 용액으로 최종 탈리용액의 pH를 7.0-7.5 사이로 조절하고 부피를 기록한다.

(가) 기록보관용 시료를 준비하지 않을 경우에는 부피를 측정하여 바이러스시료채취기록부의 최종 탈리 용량(Eluated Volume Recovered, EVR)에 기록한다.

ATSV = EVR

(*보정된 시료량, ATSV = Adjusted Total Sample Volume)

(나) 기록보관용으로 EVR x 0.1의 부피를 제하여 별도의 용기에 넣고 최종 탈리 용량으로 기록한 후 –70 ℃에 냉동시켜 책임분석자가 관리하는 실험실에 보관한다(보관기한은 시료의 바이러스 분석이 끝난 후 1년으로 한다).

ATSV = EVR x 0.9

탈리된 시료는 유기응집 단계까지 4 ℃에서 24시간까지 보관할 수 있으며 또는 유기응집을 즉시 시행하기 어려울 때에는 –70 ℃에서 장기간의 보관이 가능하다. 냉동된 시료는 37 ℃에서 빠르게 해동시킨다.

다) 유기응집 농축과정

다음의 제반 과정에서 용액을 젓거나 섞을 때 필요이상으로 저어 거품이 생기지 않도록 한다(바이러스를 불활성화시킬 가능성이 있다).

(1) 소고기엑스 탈리액이 담긴 비이커에 교반막대를 넣고 교반기로 잘 섞는다.

(2) 소고기엑스 탈리액에 pH 전극을 담그고 1M 염산 용액으로 서서히 pH를 3.5±0.1로 맞춘 다음 30분 이상 천천히 섞는다. 침전물이 생성될 것이다. 만약 pH가 3.4 이하로 떨어지면, 1M 수산화나트륨을 가하여 3.5±0.1을 유지시킨다. 어떤 종류의 바이러스는 pH 3.4 이하에서 불활성화 될 수도 있다. pH 측정기는 pH 4와 7에서 표준화되어 있어야 한다. 전극은 각 측정 전후에 미리 멸균되어야 한다.

(3) 침전물이 생기면 소고기엑스 탈리액을 원심분리용 용기에 옮겨 담아 원심분리한다(2,500 x g, 15분, 4 ℃).

(4) 원심분리 후, 상층액을 따라버린 다음 원심분리용 용기에 교반막대를 넣어 바닥의 침전물을 0.15M 인산1수소나트륨용액 30 mL(pH 9.0-9.5)로 녹여 완전히 재부유 시킨다. 소고기엑스 탈리액을 나누어 원심분리한 경우, 재부유하여 합친 총 부피가 30 mL가 넘지 않도록 한다. 침전물이 잘 녹지 않으면 pH 7.0-7.5의 인산1수소나트륨으로 먼저 완전히 녹인 후 다시 pH를 9.0-9.5로 조정하고 다음 단계로 들어가기 전 10분 정도 방치한다.

(5) 교반막대를 꺼내고 재부유된 용액을 다시 원심분리 한다.

(4,000-10,000 x G, 10분, 4 ℃)

(6) 침전물은 버리고 상층액을 모아 pH를 7.0-7.5로 맞춘다.

(7) 미생물오염을 방지하기 위해 50 mL 주사기를 이용하여 상층액을 멸균용 필터로 여과한다.  사전에 10-20 mL의 1.5 % 소고기엑스 완충액(pH 7.0-7.5)을 멸균용 필터에 통과시켜 시료 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지한다.

(8) 최종농축시료량(FCSV=final concentrated sample volume)을 바이러스 분석시료 전처리기록부에 기록하고 원 분석량(D=volume of original water sample assayed; 원수=100 L, 정수=1000 L)을 바이러스 분석시료 전처리 기록부에 기록하여 분석시료량(S=assay sample volume)을 다음과 같이 산출한다. 분석시료량(S)은 원수 100 L, 정수 1000 L를 대표하는 최종농축 시료량이다.

D

S  =  □□□□□□  ×  FCSV

ATSV

(9) 최종농축시료의 분할시료(subsample)는 다음과 같이 준비한다.

(가) 제1분할시료(subsample 1)를 분석시료량의 0.55배로 준비한다.

(나) 제2분할시료(subsample 2)를 분석시료량의 0.67배로 준비한다.

(다) 내부정도관리시료와 수행평가시료는 각각 동일한 양을 2개로 나누어 준비한다 (S=FCSV X 0.4). 시료가 24시간 이내에 분석에 사용될 경우는 4 ℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 –70 ℃에 보관한다.

3) 총 배양성 바이러스 분석과정

가) 시료접종 및 세포변성(cytopathic effect: CPE)의 발생

BGM 세포를 분양 받아 계대수 117-250사이에서 사용하도록 한다. 최고의 민감도를 유지하기 위해 세포를 배양용기에 심은 후 3-6일이 지난 세포를 사용한다(싱싱한 세포의 80-90 %가 단층을 이루며 자란다). 7일 이상 된 세포는 폐기한다.

(1) 배양용기의 배양액을 버리고 완충액이나 혈청이 없는 유지용 배양액(maintenance medium, 0.06 mL/cm2 이상)으로 세포표면을 씻고 버린다.

(2) 접종량은 분석시료량(Assay Sample Volume)을 20으로 나누어 0.04 mL/cm2 보다 작도록 조절하여 결정한다(접종량이 0.04 mL/cm2를 넘을 경우에는 보다 큰 배양용기를 사용한다).

(3) 접종량을 BGM세포에 접종하고 바이러스 시료전처리기록부에 날짜와 함께 기록한다.

나) 총 배양성 바이러스 분석대조군

세포에 접종되는 모든 분할시료마다 양성대조군 및 음성대조군도 접종하여 함께 배양한다.

(1) 음성대조군 : 접종량과 동일한 양의 인산나트륨용액(sodium phosphate, pH7.0-7.5)을 접종한다.

(2) 양성대조군 : 약독화 폴리오바이러스(attenuated poliovirus type 3)를 접종량과 동일한 양의 인산나트륨용액(pH7.0-7.5)에 희석하여 최종농도가 ‘20 PFU/접종량’이 되도록 하여 접종한다. 음성대조군에서 세포변성이 나타나면 그 원인이 규명될 때까지 실험을 중단한다. 양성대조군에서 세포변성이 나타나지 않으면 그 원인이 규명될 때까지 실험을 중단한다.

다) 시료의 접종

접종할 시료는 실험 바로 전에 녹인다. 일단 녹인 시료는 4 ℃에 4시간 이상 두지 않는다. 소량의 시료를 세포독성의 대조군으로 접종실험 수 일전에 접종할 수 있다.

(1) 제1분할시료를 녹여(냉동 보관된 상태라면) 접종량을 10개의 배양세포에 접종한다. 배양기에서 80-120분간 배양세포에 시료를 흡착시키되 15-20분 간격으로 배양용기를 좌우로 가볍게 기울여 시료가 골고루 세포에 흡착되도록 한다. 흡착과정동안 접종시료의 양이 세포표면을 충분히 덮지 못해 건조해짐으로 인해 세포가 손상될 염려가 있기 때문이다.

(2) 유지용 배양액을 넣고 36.5 ℃ 배양기에서 배양한다. 25 cm2 플라스크를 사용할 경우 10 mL씩 첨가한다. 배양액은 미리 36.5 ℃로 데워서 사용하고 배양 중 4-7일 마다 갈아준다. 배양액을 첨가할 때 용기 내 세포층이 방해되지 않도록 세포가 부착되어 있는 맞은편으로 배양액을 조심스럽게 흘려 넣는다.

(3) 현미경하에서 세포변성을 관찰한다. (1, 2, 3일째, 그 이후부터는 2일 간격으로 총 2주 동안 관찰)

(4) 접종된 배양세포의 75 %이상이 세포변성을 보이는 배양세포용기를 양성으로 판정하고 배양세포를 용기와 함께 –70 ℃에 얼린다. 나머지 배양세포용기도 14일 후에는 모두 용기와 함께 –70 ℃에 얼린다.

(5) 얼린 시료를 모두 다시 녹이고 세포변성을 나타내거나 세균오염가능성을 보이는 배양세포용기의 배양 상층액 중 10 % 정도를 0.22 ㎛ 멸균용 필터에 여과한 후 새로운 배양세포에 다시 접종한다(위 1-5의 과정 반복). 이때 음성으로 나타난 세포배양용기도 포함한다. 세포독성이 나타나지 않고 7일 동안 배양기간에 제1분할시료가 접종된 배양세포 10개 중 3개 이상이 음성이면 제2분할시료를 다시 접종량에 따라 10개의 배양세포에 접종하고, 8개 이상 양성이면 제2분할시료를 희석하지 않은 농축시료 원액 및 1:5, 1:25의 비율로 희석된 희석시료를 각 10개씩 접종한다. 1:25의 희석시료 중 남은 시료를 냉동시켜 두었다가 모두 양성으로 나타나면 다시 5배수씩 더 희석하여 반복 접종한다. 시료 100 L당 500 MPN이상 나타날 경우 25배 이상의 희석시료를 검사하여야 한다. 희석수에서 최소한 1개의 음성이 나타날 때까지 희석한다.

(6) 1, 2차 검사 모두에서 양성으로 나타난 시료를 최종양성으로 판정하고 1차 검사에서 음성이었으나 2차에서 양성으로 나타난 경우에는 3차 검사를 수행 한다.

세포병변효과가 확정된 배양세포를 연구용 목적으로나 임의의 동정연구 등을 위해 –70 ℃에 보관할 수 있다.

(7) 제1분할시료에서 세포독성이 나타날 경우 아래의 세포독성감소방법을 거쳐 수행한다. 세포독성이 감소하였으면 제2분할시료를 독성을 제거하여 농축시료 원액 및 5배수, 25배수의 희석시료를 10개씩의 배양세포에 접종하여 배양한다.

라) 정도관리 및 수행평가시료의 접종

각 정도관리시료 및 수행평가시료는 제1분할 시료의 원액과 1:5, 1:25 비율로 희석한 시료를 10개씩 배양세포에 접종한다. 제2분할시료는 예비용으로 보관한다.

4) 세포독성물질의 최소화과정

이 과정은 시료의 계수수치를 감소시키므로 확실한 세포독성이 있을 경우만 시행한다.  세포독성은 접종초기에 매일 관찰한다. 일반적으로 양성대조군 반응이 나타나기 전에 세포독성이 나타난다.

가) 흡착과정 후에 접종한 시료를 수거하여 –70 ℃에 보관하고 대신 0.25 mL/cm2의  미리 데운 세척액(약 6 mL)을 첨가한다. 후에 세포독성물질이 성공적으로 감소된 것이 확인되면 버린다. 세척액을 주입할 때 세포가 자라고 있는 세포층이 손상되지 않도록 맞은편으로 천천히 흘려 넣는다.

나) 최소 2차례 이상 세포배양용기를 가볍게 흔들어 세포를 잘 씻어준 후 세척액을 조심스럽게 따라낸다.

다) 배양세포에 다시 유지용 배양액을 넣고 36.5 ℃에서 배양하면서 양성 및 음성대조군과 비교하면서 세포독성을 관찰한다.

라) 만일 세포독성이 제거되지 않으면 (1)항에서 보관한 시료를 2배, 4배 희석하고 배양세포의 수를 2배, 4배 늘여서 실험과정을 수행 한다.

어떤 시료들은 세척과정 없이 농축시료의 희석만으로도 세포독성이 충분히 감소될 수 있다. 다른 한편으로는, 세포독성이 나타나는 첫 단계에서 배양액을 바꿔주어 더 이상의 세포독성이 진전되지 않도록 할 수도 있다.

마. 바이러스 정량

1) 세포변성 양성 및 음성으로 나타난 배양용기의 수를 바이러스 세포배양기록부에 기록한다.

2) 바이러스세포배양기록부에 기록된 배양용기의 수를 바이러스 정량산정기록부에 옮겨서 MPN/mL(Mm)과 상하 95% 신뢰한계(Lower and upper 95 % confidence Limit = CLlm, CLum)를 산출한다. 정량용 계산프로그램은 바이러스 최적확수 계산 프로그램(MPNV : computer program, USEPA)을 사용한다.

3) 정량용 계산프로그램으로 산출된 값을 원수 및 정수량으로 환산한 바이러스의 최적확수값(ml)과 95 % 신뢰한계값(CLu, CLl)을 다음과 같이 산정한다.

가) 100 L(원수) 혹은 1000 L(정수)의 바이러스 최적확수(Most Probable Number: MPN) = ml

100 Mm S

ml =  □□□□□□□□□□□□□□□

D

나) 100 L(원수) 혹은 1000 L(정수)의 바이러스 상한 95 % 신뢰한계 = CLu

100 L(원수) 혹은 1000 L(정수)의 바이러스 하한 95 % 신뢰한계 = CLl

100 CLlm S

CLl =  □□□□□□□□□□□□□□□

D

100 CLum S

CLu =  □□□□□□□□□□□□□□□

D

4) 정도관리시료 및 수행평가시료에 대한 MPN값도 계산한다.

바. 기 타

이 시험공정에 소개된 모든 부품, 조립완제품, 장비, 기구, 배양액 및 시약들은 동일한 기능과 조성의 국내외 타제조사 부품이나 조립완제품으로 대체할 수 있다.  모든 기구, 시약 및 항생제, 증류수는 세포배양에 적합한 등급을 사용하여야 한다.

그림 1. 표준필터장치.

그림 2. 표준여과장치에 부착되는 추가 모듈.

그림 3. 총배양성 바이러스 시험 흐름도.

2. 원생동물검사 분야

가. 목 적

이 시험방법은「수도법」제28조의2에 의한 지아디아(Giardia) 포낭과 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 난포낭의 분포실태조사를 실시함에 있어 검사결과의 정확과 통일을 기하기 위해 필요한 제반사항에 대하여 규정함을 목적으로 한다.

나. 시약 및 표준용액

1) pH 조정용 시약

가) 수산화나트륨 용액

1.0N 및 6.0N의 수산화나트륨용액을 준비한다.

나) 염산 용액

0.1N, 1.0N 및 6.0N의 염산용액을 준비한다.

다) 이 시험방법은 작은 pH의 변화에도 커다란 영향을 받을 수 있으므로, 가급적이면 완성품을 사용한다.

2) 시료채취 및 여과과정

가) 2 % 티오황산나트륨 용액

티오황산나트륨을 정제수에 녹여 고압증기 멸균한 후 1 - 10 ℃에서 보관한다.

나) 정제수

포낭, 난포낭, 자기성 광물질 등 본 시험방법에 영향을 주는 물질이 포함되지 않는 물이어야 한다.

3) 시료의 추출 및 농축과정

가) 캡슐필터용 추출완충용액

(1) 로레쓰-12(Laureth-12) 용액

Fisher cat. no. NC9253856, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

로레쓰-12 10 g을 초음파 또는 열판을 이용하여 약 90 mL의 정제수에 용해시킨 다음, 정제수로 최종부피를 100 mL로 맞추어 10 % 용액을 만든다. 10 % 용액을 멸균된 바이알에 10 mL씩 분주하여 실온 또는 냉동 보관한다. 10 % 로레쓰-12 용액은 실온에서는 2개월, 20 ℃이하에서는 1년까지 보관할 수 있다.

(2) 1M 트리스(Tris) 용액

Fisher cat. no. BP152 또는 동급 제품을 사용할 수 있다. 또한 제품화된 Tris(Sigma T2194 또는 동급제품)를 사용할 수 있다.

트리스 121.1 g을 약 700 mL의 정제수에 녹이고 6.0N 염산 또는 6.0N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 맞춘 다음, 정제수로 최종부피가 1000 mL가 되도록 한다. 제조된 트리스 용액을 미리 멸균 처리된 0.2 μm 필터를 사용하여 여과멸균하고 실온에서 보관한다.

(3) 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산디나트륨․2수화물(Ethylenediamine tetraacetic

acid disodium salt dihydrate) 용액

Fisher cat. no. S311 또는 동급 제품을 사용할 수 있다. 또한 제품화된 EDTA(Sigma E7889 또는 동급 제품)를 사용할 수 있다.

에틸렌디아민테트라아세트산디나트륨․2수화물 186.1 g을 약 800 mL에 용해시킨 후, 6.0N 염산 또는 6.0N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 8.0으로 맞춘 다음, 정제수로 최종부피가 1000 mL가 되게 조정하고, 1.0N 염산 또는 1.0N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 8.0으로 재조정한다.

(4) 소포제(Antifoam A)

Sigma Chemical Co. cat. no. 10794, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

(5) 캡슐필터용 추출완충용액

바이알에 담긴 10 % 로레쓰-12 용액 10 mL를 정제수를 사용하여 여러 번 헹구어 비이커에 옮긴다. 여기에 1M 트리스 용액 10 mL, 0.5M EDTA 용액 2 mL, 소포제 150 μL를 가한 후 정제수를 추가하여 최종부피를 1000 mL로 맞춘다. 캡슐필터용 추출완충용액은 사용 시 조제한다.

나) 멤브레인 디스크필터용 추출완충용액

염화나트륨 8.0 g, 인산2수소칼륨 0.2 g, 인산1수소나트륨․12수화물 2.9 g, 염화칼륨 0.2 g, 황산도데실나트륨 1 g, 트윈 80(Tween 80) 1 mL, 소포제 100 μL를 정제수 약 750 mL에 용해시킨 후 pH를 7.4로 맞춘 다음, 정제수로 최종부피가 1000 mL가 되게 조정한다. 멤브레인 디스크필터용 추출완충용액은 사용 시 조제한다.

Sigma Chemical Co., cat. no. P1754, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다

4) (난)포낭의 분리과정

가) 면역자기분리용 시약

DynabeadsⓇ GC-Combo, Dynal cat. no. 730.12 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

면역자기분리용 시약은 1–10 ℃에서 냉장 보관하며 동결되지 않도록 한다. 동결되었거나 유효기간이 지난 시약은 폐기한다.

5) (난)포낭의 염색과정

가) 메틸알코올

고순도 메틸알코올을 사용한다.

나) 직접염색(Direct labeling) 시약

MeriFluorⓇ Cryptosporidium /Giardia, Meridian Diagnostics cat. no. 250050 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Aqua-GloTM G/C Direct FL, Waterborne, Inc. cat. no. A100FLK 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Crypt-a-GloTM and Giardi-a-GloTM, Waterborne, Inc. cat. nos. A400FLK and A300FLK 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Easy StainTM C&G, BTF Pty Limited 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

다) 인산완충용액(Phosphate buffered saline, PBS)

시판완충용액을 사용하거나, 다음과 같이 조제하여 사용할 수 있다. 염화나트륨 8.0 g, 인산2수소칼륨 0.2 g, 인산1수소나트륨(무수화물) 1.15 g, 염화칼륨 0.2 g을 정제수 약 750 mL에 용해시킨 후, pH를 7.4로 맞춘 다음, 정제수로 최종부피가 1000 mL가 되게 조정하고 0.2 μm 필터를 사용하여 여과멸균하거나 고압증기 멸균하여 사용할 수 있다.

pH 7.4를 준비한다. 실온 또는 4 ℃에서 보관하며 동결되지 않도록 한다. 이물질 또는 생장물이 검출되거나 6개월이 지난 용액은 폐기한다.

라) DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색시약

Sigma Chemical Co. cat. no. D9542, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

(1) DAPI 저장용액

DAPI 2 mg을 고순도 메틸알코올 1 mL에 용해시키고 1 - 10℃의 암소에 냉장보관하며 동결되지 않도록 한다.

(2) DAPI 염색용액

DAPI 저장용액 10 μL를 인산완충용액 50 mL에 녹여 1:5000의 희석액을 만든다. DAPI 염색용액은 염색할 때마다 조제하여 사용한다. DAPI 염색 상태가 희미하거나 확산되는 것이 발견되면 염색용액의 농도를 증가시킬 수 있다. 사용이 끝난 잔여용액은 폐기한다.

마) 마운팅메디움(Mounting medium)

직접염색시약에 포함된 마운팅메디움을 사용할 수 있으며, 또는 DABCO (1,4-Diazabicyclo octane)/글리세린 마운팅메디움(2 %)을 다음과 같이 조제하여 사용할 수 있다. 글리세린과 인산완충용액을 6 : 4의 비율로 섞어 글리세린/인산완충용액의 혼합액을 만든다. DABCO 2 g을 따뜻한 글리세린/인산완충용액의 혼합액 약 95 mL에 완전히 용해시킨 후 최종부피를 100 mL로 하여 사용한다.

MeriFluorⓇ Cryptosporidium /Giardia, Meridian Diagnostics cat. no. 250050 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Aqua-GloTM G/C Direct FL, Waterborne, Inc. cat. no. A100FLK, cat. no. M101 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Easy StainTM C&G, BTF Pty Limited 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Sigma Chemical Co. cat. no. D27802, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

6) 정도관리

가) 정도관리용 (난)포낭 표준용액

EasySeed™(BTF Pty Limited) 또는 AccuSpikeTM–IR(Waterborne, Inc.) 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

표준용액을 직접 조제할 경우, 실험결과의 통계학적 신뢰성이 낮으므로, 실험실에 흘림세포계측기(Flow cytometer)가 구비되지 않은 경우 반드시 제조업체에서 시판하는 표준용액을 구매하여 사용하여야 한다. 표준용액은 사용 전까지 1–10 ℃에서 저장하되 얼리면 안 된다.

다. 기구 및 재료

1) 기본 장비 및 재료

가) 냉장 운반 컨테이너

나) 교반막대

다) 교반기

라) 볼텍스 믹서

마) pH 측정기

바) 화학저울

정밀도가 0.1 mg이고, 최소 10 mg까지 읽을 수 있어야 한다.

사) 피펫

5 mL, 10 mL 및 25 mL 용량의 유리 또는 플라스틱 재질의 피펫과 1회용 파스퇴르 피펫을 사용한다.

아) 마이크로피펫 및 마이크로피펫 팁

0 - 10 μL, 10 - 100 μL 및 100–1000 μL 용량의 마이크로피펫과 규격에 맞는 마이크로피펫 팁을 사용한다.

자) 비이커

25 mL, 50 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL 및 2000 mL 용량의 유리 또는 플라스틱 재질을 사용한다.

차) 미세원심분리관(Microcentrifuge tube)

1.5 mL 용량의 플라스틱 재질을 사용한다.

2) 시료채취 및 여과과정

가) 원수시료 채취통(10 L)

하단에 배수꼭지가 장착되어 있고, 최소 1 L 간격의 눈금이 그려져 있어야 한다. 필요시 일회용 10 L 저밀도 폴리에틸렌(Low density polyethylene, LDPE) 병을 사용한다.

나) 시료여과를 위한 장비

원수시료의 여과를 위한 캡슐필터와 정수시료의 여과를 위한 멤브레인 여과장치 또는 HV 캡슐필터(High Volume Capsule Filter)를 사용하여야 한다.

(1) 캡슐필터(Capsule Filter)

Envirochek™(Pall Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI, Envirochek Sampling Capsule, product 12110), 또는 동급 제품을 사용할 수 있으며, Envirochek™은 재사용할 수 없다.

(2) HV 캡슐필터(High Volume Capsule Filter)

Envirochek™ HV(Pall Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI, Envirochek Sampling Capsule, product 12099), 또는 동급 제품을 사용할 수 있으며, Envirochek™ HV는 재사용할 수 없다.

(3) 멤브레인 여과 장치

(가) 지름 142 mm의 멤브레인 여과 장치 및 그에 적합한 규격의 멤브레인 필터를 사용한다. 단, 필터의 공경은 2 μm를 초과해서는 안 된다.

Micro-filtration systems, pleasanton CA, KS142/302000 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

Nuclepore polycarbonate track-etch membrane no. 112112 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

(나) 마개달린 시료컵(125 mL)

다) 시료여과에 필요한 부속 장치

(1) 배관

Tygon formula R-3603, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

내벽에 (난)포낭이 쉽게 부착되지 않으며, 연동 펌프의 사용에 의한 음압에 배관의 직경이 수축되지 않고, 고압증기멸균에 내구성을 갖는 유리, 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE), 고밀도 폴리에틸렌(High density polyethylene, HDPE) 등의 재질로 만든 배관을 사용한다.

(2) 정량 또는 연동펌프

0.4 - 4 L/min의 유속을 조절할 수 있어야 한다.

(3) 유량계

3) 시료의 추출 및 농축 과정

가) 캡슐필터용 팔 달린 진탕기(Wrist-action shaker)

Lab-Line model 3589, VWR Scientific cat. no. 57039-055, Lab-Line Model 3587-4, VWR Scientific cat. no. 57039-045, 또는 Fisher cat. no. 14260-11 및 Fisher cat. no. 14260-13, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

나) 라텍스장갑

분말가루가 없는 것을 사용하여야 한다.

다) 메스실린더

10 mL, 100 mL, 또는 1000 mL 용량으로 고압증기 멸균이 가능하여야 한다.

라) 초음파 세척기

마) 농축장치

(1) 원심분리기

원심분리기는 15 - 250 mL 원심분리관을 수용할 수 있고, 1500 × G를 달성할 수 있어야 하며, 반드시 원심관 지지 장치(Swing Bucket Rotor)를 사용하여야 한다.

(2) 원심분리관

15 mL, 50 mL, 175 mL 또는 250 mL 용량으로서 눈금이 그려져 있어야 한다.

(3) 흡인장치(Aspirator 또는 진공펌프)

4) (난)포낭의 분리과정

가) 리톤시험관

Dynal L10, cat. no. 74003, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

60×10 mm의 자기포획면(flat-sided magnetic capture area)을 가진 16×125 mm의 리톤형 시험관(Leighton-type tube)을 사용한다.

나) 회전혼합기(Rotating mixer)

Dynal® Sample Mixer, cat. no. 94701, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

다) 리톤시험관용 자기입자농축기

Dynal® MPC®-1, cat. no. 12001D 또는 MPC®-6, cat. no. 12002D 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

라) 미세원심분리관용 자기입자농축기

Dynal® MPC®-S, cat. no. A13346 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

5) (난)포낭의 염색과정

가) 웰슬라이드

Dynal® Spot-On well slides, Invitrogen, cat. no. 740.04 또는 Meridian cat. no. R2206 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

나) 커버글라스

6) (난)포낭 현미경 관찰

가) 현미경 시스템

(1) 형광/미분간섭대비(Epifluorescence/Differential Interference Contrast) 현미경 20배(N.A.=0.5), 40배(N.A.=0.75) 및 100배(N.A.=1.5)의 대물렌즈를 가진 현미경을 사용한다.

Zeiss™　Axioskop, Nikon™ Eclipse E600, Olympus™　BH, 또는 동급 제품을 사용할 수 있다.

(2) 면역형광필터(Excitation/Band-pass Filters for Immuno Fluorescence Assay)

현미경에는 면역형광염색 관찰을 위하여 450–490 nm 여기필터(Exciter Filter), 510 nm 이색성 광선분리거울(Dichroic beam-splitting mirror), 515 - 520 nm 불투과 또는 억제필터(Barrier or Suppression Filter)가 장착되어야 한다.

(3) DAPI형광필터(Excitation/band-pass Filters for DAPI)

현미경에는 DAPI형광염색 관찰을 위하여 340 - 380 nm 여기필터, 400 nm 이색성 광선분리거울, 420 nm 불투과 또는 억제필터가 장착되어야 한다.

(4) 마이크로미터

현미경 관찰 시 (난)포낭의 크기를 측정할 수 있어야 하며, 화상분석시스템으로 대치될 수도 있다.

(5) 사진기

형광현미경에 부착되어 현미경으로 관찰된 상을 촬영할 수 있어야 한다.

라. 시료의 보관 및 처리기간

1) 시료는 가능한 한 신속히 처리되어야 한다.

2) 당일 시료처리를 완료할 수 없는 경우 시료 채취 또는 여과, 시료의 슬라이드 적용, 염색 직후에 시료처리가 다음과 같이 지체될 수 있다.

가) 시료의 추출은 시료채취 또는 여과가 완료된 이후, 96시간 이내에 완료되어야 한다. 단, 지체 시 시료는 1-10 ℃에서 냉장보관 되어야 한다.

나) 추출, 농축 그리고 면역자기분리과정은 완료 시까지 연속하여 진행하여야 한다.

다) 시료의 염색은 슬라이드 적용 후 72시간 이내에 완료되어야 한다.

라) 현미경 관찰과 확정은 염색이 완료된 후 즉시 실시하되 7일 이내에 완료되어야 한다. 단 염색이 희미해지는 것이 발견되는 경우 시료의 보관시간을 단축하여야 한다.

마. 실험과정

1) 시료채취 및 여과과정

가) 시료채취자는 반드시 1회용 장갑을 착용해야 하며 시료가 원생동물에 의해 오염될 수 있는 조건을 피해야 한다. 장갑을 착용한 손이 오염되었을 수 있는 부품이나 부위에 닿았을 경우 새 장갑으로 바꾸어 착용하여야 한다.

나) 원수시료는 채취지점에서 10 L를 채취하여 실험실로 운반하여 여과하는 것을 원칙으로 한다.

다) 실험실로 운반된 원수시료는 캡슐필터를 사용하여 여과하여야 한다. 단, 시료채취 지점에 전원이 공급되거나 오염가능성이 없다고 판단되는 등 조건이 갖추어진 경우, 채취지점에서 시료를 여과할 수 있다.

라) 정수시료는 채취지점에서 멤브레인 여과장치 또는 HV 캡슐필터를 사용하여 100 L를 여과하고 필터를 실험실로 운반한다.

마) 모든 시료는 채취한 당일 실험실로 냉장상태로 운반하여야 하며, 이후의 실험과정에 들어가기 전까지 1-10 ℃ 하에 보관하여야 한다. 실험자는 시료를 받은 후 접수번호, 접수일, 접수자, 도착 시 시료온도와 시료의 조건, 시료 보관위치와 보관온도를 원생동물 시험일지에 기록하여야 하며, 이 때 시료의 온도가 20 ℃를 초과하거나 동결상태인 경우 시료를 다시 채취하도록 한다.

바) 캡슐필터에 의한 원수 여과

(1) 시료가 들어있는 채취통의 배수꼭지부분과 캡슐필터의 유입구를 배관으로 연결하고, 유출구에서 폐액통으로 연결된 배관의 중간부분에 정량 및 연동펌프가 설치되어지도록 여과장치를 연결한다(그림 1).

그림 1. 캡슐필터를 이용한 시료여과장치의 모식도.

(2) 채취통의 배수꼭지를 열어 시료를 통과시켜 캡슐필터 내에 시료를 채운다. 이 때 캡슐필터에 장착된 공기밸브를 열어야 하며 캡슐필터 내에 공기가 모두 없어지면 공기밸브를 닫는다. 시료가 공기밸브를 통하여 새어나오지 않도록 한다.

(3) 펌프를 서서히 작동시켜 여과를 시작한다. 유속이 2 L/min 이하가 되도록 한다.

(4) 시료가 모두 여과되면, 펌프를 끄고 채취통에 정제수 1 L를 가한 후 채수통 벽을 세척하여 그 세척액을 다시 여과한다.

(5) 여과가 끝나면, 캡슐필터의 유입구와 유출구를 여과장치에서 분리한 후, 유입구와 유출구를 모두 봉한다.

(6) 시료의 여과 시작시간과 종료시간, 사용된 필터의 종류와 로트번호, 여과된 시료의 양 그리고 기타 특이 사항을 원생동물 시험일지에 기록하여야 한다.

사) HV캡슐필터에 의한 정수 여과

(1) HV캡슐필터를 채취하고자 하는 수도꼭지에 연결하고 후단에 유량계를 장착한다. 필요시 필터 전단으로 2 % 티오황산나트륨용액이 연속 유입되도록 할 수 있다.

(2) 수도꼭지를 틀어 유속이 2 L/min 이하가 되도록 조절한다. 필요시 필터 전단에 유속 조절계를 설치하거나 전단 또는 후단에 펌프를 연결하여 유속을 조절할 수 있다.

(3) 시료 100 L가 모두 여과되면 수도꼭지를 잠그고 필터의 유입구를 수도꼭지로부터 분리한 후 유입구와 유출구를 모두 봉한다.

(4) 시료의 여과 시작시간과 종료시간, 사용된 필터의 종류와 로트번호, 여과된 시료량 그리고 기타 특이사항을 원생동물 시험일지에 기록하여야 한다.

아) 멤브레인 여과장치에 의한 정수 여과

(1) 멤브레인 여과장치의 조립

멤브레인 여과장치는 조립순서에 따라 3개의 지지각, 하부판 및 유출피팅, 하부유출판, 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE)으로 표면처리된 막지지판, PTFE 재질의 가스켓, 상부판 및 공기밸브, 분사판 그리고 유입피팅으로 구성되어 있다.

(가) 멤브레인 여과장치의 모든 구성품을 깨끗이 세척하고 건조시킨다.

고압증기 멸균을 할 경우 막 지지판이 훼손될 수 있다.

(나) 3개의 지지각, 하부판 및 배출피팅, 하부배출판 그리고 PTFE로 표면처리된 막지지판의 순서로 조립한다. 막지지판은 PTFE로 표면처리된 면이 위로 향하도록 한다.

(다) 분사판과 가스켓을 끼운 상부판을 하부판에 맞추어 올려놓는다.

필터는 가스켓보다 커서 전체를 덮을 정도여야 한다. 가스켓이나 너트가 훼손되지 않도록 주의하여야 한다.

(2) 유속 조절

멤브레인 필터를 제외한 여과장치를 채취하고자 하는 수도꼭지에 직접 연결하고, 후단에 유량계를 장착한다. 수도꼭지를 틀어 유속이 2 L/min 이하가 되도록 수도꼭지의 수압을 조절한다. 필요시 펌프를 연결하여 속도를 조절한다. 그리고 최소 20 L 이상의 수돗물을 흘려 세척한다.

(3) 여과

(가) 상부판을 들어올리고, 핀셋을 사용하여 막 지지판 위에 멤브레인 필터를 반짝이는 면이 위로 향하도록 중앙에 평평하게 놓는다.

(나) 상부판을 하부판에 올려놓고 연결 너트를 조인다.

수도꼭지의 수압은 그대로 유지시킨다. 이를 위하여 수도꼭지와 유입피팅 사이의 배관에 T형 피팅을 삽입하고 클램프를 이용하여 필터가 들어있는 멤브레인 여과장치를 장착하는 동안 물을 배수시킨다.

(다) 시료를 여과한다. 필요시, 여과장치 전단으로 2 % 티오황산나트륨용액이 연속 유입되도록 할 수 있다. 공기밸브를 열어 멤브레인 여과장치 속의 공기를 모두 제거한다. 이때 멤브레인 여과장치를 여러 방향으로 기울여야 잔여공기가 모두 배출된다.

(라) 시료가 모두 여과되면, 수도꼭지를 잠근다.

(4) 필터의 회수 및 여과장치 분해

(가) 유출구 끝을 분해한다. 이때 역류로 인한 (난)포낭의 손실을 막기 위해 유입피팅이 유출 피팅 보다 높도록 한다.

(나) 펌프를 사용하여 필터 위에 남아있는 물을 모두 배수시킨다.

(다) 연결너트를 풀어 상부판을 들어낸다. 이때 필터와 막 지지판이 가스켓에 붙지 않도록 한다.

(라) 끝이 무딘 핀셋을 사용하여 (난)포낭이 손실되지 않도록 필터를 접은 후   125 mL의 깨끗한 시료컵에 넣는다.

(마) 상부판을 시료컵에 가까이 대고 미리 준비한 2 % 티오황산나트륨 용액으로 세척한다. 티오황산나트륨 용액은 시료컵 속의 필터가 잠기는 데 필요한 최소의 양을 사용한다. 이를 위하여 분사병이나 세척병 등을 사용할 수 있다.

(바) 탁도가 높아 100 L 수돗물의 여과에 두 장 이상의 필터가 소요되는 경우, (3)(가)부터 (4)(라)까지의 과정을 반복한다.

(사) 시료의 여과가 끝나면 시료의 여과 시작시간과 종료시간, 사용된 필터의 종류와 로트번호, 여과된 시료의 양 그리고 기타 특이 사항을 원생동물 시험일지에 기록하여야 한다.

2) 시료추출과정

가) 캡슐필터 또는 HV 캡슐필터 여과시료의 추출

(1) 기구의 설치 및 준비

(가) 캡슐필터용 팔 달린 진탕기에 캡슐필터 또는 HV 캡슐필터가 바닥과 수평으로 놓이도록 클램프를 수직으로 장착한다.

(나) 당일 처리할 모든 시료에 동일한 추출완충용액을 사용할 수 있도록 충분한 양을 준비한다. 통상 한 시료 당 약 300 mL의 추출완충용액이 필요하다.

(2) 시료의 추출

(가) 적절한 도구를 사용하여 필터를 수직으로 세우고 유입구 뚜껑을 연 후 추출완충용액을 주입한다. 주입량은 약 125 mL 정도로서, 캡슐 내부의 필터가 추출완충용액에 잠기어야 한다. 주입 후 유입구 뚜껑을 닫는다.

(나) 캡슐필터용 팔 달린 진탕기의 클램프에 공기밸브가 위로 향하도록(시계 12시 방향) 필터를 장착하고, 진탕기를 약 900 rpm 또는 최고 속도로 작동시켜 필터를 5분 동안 진탕한다.

(다) 진탕기에서 필터를 떼어내고, 유입구 뚜껑을 연 후 내용물을 250 mL 원심분리관에 옮긴다. 이 때 윗부분에 위치한 유출구 뚜껑도 같이 열어준다.

(라) 다시 필터에 추출완충용액을 (가)와 같이 충분히 주입한 후 뚜껑을 닫는다.

(마) 진탕기에 장착하되, 공기밸브가 시계 4시 방향으로 놓이도록 하고 5분 동안 진탕한다.

(바) 필터의 공기밸브가 시계 8시 방향으로 놓이도록 하고 다시 5분 동안 진탕한다.

(사) 진탕기에서 필터를 떼어내고, 유입구 뚜껑을 연 후 내용물을 원심분리관에 옮긴다. 윗부분에 위치한 유출구 뚜껑도 같이 열어준다.

(아) 분사병 또는 세척병을 사용하여 정제수나 추출완충용액으로 캡슐 내벽을 충분히 씻은 후, 필터를 원심분리관 위에 거꾸로 세워놓고 가능한 한 많은 양의 추출물이 옮겨지도록 한다. 마찬가지로 윗부분에 위치한 유출구 뚜껑도 같이 열어준다.

나) 멤브레인필터 여과시료의 추출

(1) 당일 처리할 모든 시료에 동일한 추출완충용액을 사용할 수 있도록 충분한 양을 준비한다. 통상 한 시료 당 100 mL의 추출완충용액이 필요하다.

(2) 시료의 추출

(가) 시료컵에 적당량의 추출완충용액을 첨가한다.

(나) 라텍스장갑을 착용한 손으로 필터를 잡고 엄지와 검지손가락으로 필터를 주물러 가능한 한 많은 물질들이 떨어지도록 문지른다. 필터를 펴고 안쪽에 있는 물질들이 떨어지도록 손가락으로 필터를 살짝 긁어내린다. 이러한 동작을 2분 동안 계속한다.

(다) 필터가 들어있는 시료컵을 초음파세척기에 반쯤 넣어 1-2분 동안 초음파 처리한다. 일회용 피펫을 사용해 필터가 용액 표면 위로 나오지 않도록 눌러준다.

(라) (나)의 과정을 다시 실시한 후 필터를 제외한 여액을 원심분리관에 넣는다.

(마) 필터를 쥐어짜서 모든 여액이 원심분리관에 옮겨지도록 한다. 시료컵을 약간의 추출완충용액으로 세척하고 그 여액 역시 원심분리관에 넣는다.

3) 시료의 농축 및 분리과정

가) 원심분리관에 담긴 여과추출액을 1500 × G에서 15분 동안 원심분리 한다.

나) 원심분리결과 총 농축물의 부피가 0.5 mL 이하인 경우에는 다음 과정을 따른다.

(1) 흡인장치(Aaspirator)를 사용하여 농축물이 흡인되지 않도록 원심분리관의 중앙에서 조심스럽게 상등액을 뽑아내어 최종 5 mL까지 남긴다.

(2) 농축물이 들어있는 원심분리관을 10-15초 동안 강하게 흔들어 농축물을 완전히 재부유 시킨다.

(3) 거품이 생성된 경우에는 원심분리관을 부드럽게 회전시켜 거품을 감소시킨다.

(4) 총 농축물의 부피, 재부유된 시료의 부피를 시험일지에 기록한다.

(5) 면역자기분리과정을 실시한다.

다) 원심분리결과 총 농축물의 부피가 0.5 mL를 초과하는 경우에는 다음 과정을 따른다.

(1) 농축물 0.5 mL당 액량이 5 mL가 남도록 상등액을 흡인한다. 예를 들면, 총 농축물의 부피가 1.2 mL인 경우에는 총 15 mL가 남도록 상등액을 흡인한다.

(2) 농축물의 부피가 0.5 mL 이하가 되도록 여러 개의 시료(subsample)로 나눈다.

이때 필요한 시료의 수는 다)의 총 농축물의 부피를 0.5 mL로 나누고 가까운 정수로 올림하여 결정한다. 예를 들어, 총 농축물의 부피가 1.2 mL이면 필요한 시료의 수는 3개이다.

(3) 나뉘어진 시료가 들어있는 원심분리관을 10-15초간 강하게 흔들어 농축물을 완전히 재부유 시킨다.

(4) 거품이 생성된 경우에는 원심분리관을 부드럽게 회전시켜 거품을 감소시킨다.

(5) 총 농축물의 부피, 재부유된 시료의 부피, 나눈 시료의 수, 나눈 시료의 부피를 시험일지에 기록한다.

(6) 면역자기분리과정을 실시한다.

4) 면역자기분리과정

본 과정은 (난)포낭을 기타 물질로부터 분리하는 과정으로서 면역자기분리(Immuno- magnetic separation, IMS)방법을 사용한다.

가) 면역자기분리용 시약의 준비

(1) 면역자기분리과정은 15-25 ℃가 유지되는 실험실에서 수행되어야 하며, 냉장보관된 모든 면역자기분리용 시약 역시 실험 전 미리 같은 조건에 맞추어야 한다.

(2) 면역자기분리용 시약에 포함된 10X SL-buffer-A를 정제수로 10배 희석하여 1X SL-buffer-A로 만든다. 10X SL-buffer-A는 냉장보관 시 결정이 생성되므로 실험 전 상온에서 결정을 없애고 희석하여야 한다.

나) 자기체(Beads)와 (난)포낭의 결합과정

(1) 리톤시험관에 면역자기분리용 시약에 포함된 10X SL-buffer-A 1 mL와 10X SL-buffer-B 1 mL를 넣는다.

(2) 3)나) 또는 3)다)의 농축된 시료 또는 재부유된 시료를 10X SL-buffer-A와 10X SL-buffer-B가 들어있는 리톤시험관에 옮긴다. 정제수로 원심분리관 내벽을 세척하여 가능한 모든 물질을 옮겨야 하며, 리톤시험관 내 용액의 최종 부피가 12 mL가 되도록 한다. 시료를 옮기기 전 리톤시험관에 12 mL 되는 곳을 미리 표시할 수 있다.

(3) 면역자기분리용 시약에 포함된 anti-Cryptosporidium 및 anti-Giardia 자기체 용액을 각각 100 μL씩 취하여 시료와 SL-buffer가 들어있는 리톤시험관에 첨가한다. 이때 anti-Cryptosporidium 자기체와 anti-Giardia 자기체가 각각 들어있는 플라스틱 용기는 사용 전 10초 동안 강하게 흔들어 자기체가 완전히 부유하여 바닥에 남아있지 않도록 하여야 한다.

(4) 리톤시험관을 밀봉한 후 회전혼합기에 장착하고 약 18 rpm으로 최소 1시간 동안 실온에서 회전시킨다.

(5) 리톤시험관을 회전혼합기에서 분리하여 평평한 면이 리톤시험관용 자기입자농축기의 자석부분에 닿도록 끼운다. 리톤시험관의 평평한 면이 아래로 향하도록 리톤시험관용 자기입자농축기를 손에 들고 90° 각도(MPC®-6은 180°)로 기울이는 방식으로 부드럽게 흔들어 준다. 대략 초당 1번씩 기울이는 동작을 2분 동안 계속한다. 이 과정은 자기력이 있는 저중량 물질이 자기체에 부착하는 것을 방지하기 위한 것이다. 따라서 만약 시료의 흔들기를 10초 이상 지체하였다면 자기입자농축기에서 리톤시험관을 제거하고 부드럽게 흔들어 내용물을 재부유시키고, (5)의 과정을 처음부터 다시 수행하는 것이 좋다.

(6) 리톤시험관을 리톤시험관용 자기입자농축기로부터 떼지 않은 상태에서 마개를 열고 리톤시험관에 들어있는 상등액을 모두 적절한 용기로 옮긴다. 이때 자기입자농축기의 자기면이 위로 가도록 한다.

(7) 자기입자농축기에서 리톤시험관을 분리하고 1X SL-buffer-A 1 mL를 조심스럽게 넣은 후 리톤시험관을 부드럽게 흔들어 시험관내 모든 물질이 1X SL-buffer-A 속에 재부유 되도록 한다.

(8) 자석띠가 장착된 미세원심분리관용 자기입자농축기에 1.5 mL 미세원심분리관을 미리 끼워놓고, 여기에 자기체가 재부유된 용액 전량을 옮긴다.

(9) 1X SL-buffer-A 0.5 mL를 리톤시험관에 넣고, (7)(8)의 과정을 반복한 후 리톤시험관을 똑바로 세워 정치시킨 후 바닥에 모인 용액을 모두 1.5 mL 미세원심분리관으로 옮긴다.

(10) 미세원심분리관용 자기입자농축기에 자기체가 재부유된 용액이 담긴 미세원심분리관을 끼운 채 초당 1회의 속도로 1분 동안 180° 각도로 부드럽게 흔들어준다. 이 과정의 결과, 미세원심분리관이 자기입자농축기와 접촉한 부분에 갈색점이 생성된다.

(11) 미세원심분리관의 상등액을 신속히 흡인, 제거한다. 처리해야 할 시료가 두 개 이상인 경우에는 각 미세원심분리관마다 180° 회전을 세 번 실시한 후 상등액을 제거한다. 상등액을 제거할 때에 자석부위 근처의 미세원심분리관 벽에 부착되어있는 갈색점을 훼손하면 안 된다. 미세원심분리관을 흔들거나 미세원심분리관용 자기입자농축기에서 탈착하여도 안 된다.

다) 자기체와 (난)포낭 결합체의 해체과정

(1) 미세원심분리관용 자기입자농축기에서 자석띠를 분리한다.

(2) 미세원심분리관에 0.1N 염산 50 μL를 첨가하고, 50초 이상 격렬하게 교반한 후 자석띠를 뺀 미세원심분리관용 자기입자농축기에 끼우고 최소 10분 동안 정치한다.

격렬하게 교반하되 미세원심분리관의 마개 및 벽면에 시료가 튀지 않도록 조심해야 한다.

(3) 미세원심분리관을 다시 30초 이상 격렬하게 교반한다.

(4) 자석띠를 부착한 미세원심분리관용 자기입자농축기에 미세원심분리관을 다시 끼우고 10초 이상 정치한다.

(5) 웰슬라이드의 웰에 1.0N 수산화나트륨 5 μL를 넣는다. 웰슬라이드는 15-20 ℃의 실온에서 미리 준비한다.

(6) 자석띠를 부착한 미세원심분리관용 자기입자농축기에 미세원심분리관을 끼워둔 채, 내부의 모든 용액을 1.0N 수산화나트륨 5 μL가 있는 웰슬라이드의 웰로 옮긴다. 이 때 미세원심분리관에 붙어있는 자기체를 건드려서는 안 된다.

(7) 웰슬라이드에 있는 시료를 공기 중에서 완전 건조시킨다.

염색과정에서 (난)포낭의 손실을 방지하기 위해 완전히 건조하여 시료를 웰슬라이드에 고정시켜야 한다.

(8) 자기체나 미세원심분리관을 버리지 말고, (1) - (7) 과정을 다시 반복한다.

5) 시료의 염색과정

가) 양성대조군(Positive control)과 음성대조군(Nagative control)을 준비한다.

(1) 양성대조군은 웰슬라이드의 웰 중심부에 (난)포낭이 각각 200-400개씩 함유되도록 고르게 도말하거나 직접염색시약을 사용하는 경우 그 사용법에 따라 준비한다.

(2) 음성대조군으로 인산완충용액 50 μL를 웰슬라이드의 웰에 고르게 도말하거나 직접염색시약을 사용하는 경우 그 사용방법에 따른다.

(3) 양성 및 음성 대조군이 도말된 슬라이드를 공기 중에서 완전 건조시킨다.

나) 양성대조군, 음성대조군 및 시료의 슬라이드가 완전히 건조되면 고순도 메틸알코올 50 μL를 웰슬라이드의 웰에 첨가한다.

다) 알코올이 완전히 마르면 사용하는 직접염색시약의 염색방법에 따라 염색한다.

라) 웰슬라이드를 빛이 차단된 습기챔버(humid chamber)에 넣고 실온에서 약 30분 동안 정치한다. 습기챔버는 플라스틱 밀폐용기에 젖은 종이타올을 깔고 그 위에 슬라이드를 올려 놓은 형태를 말하며, 유리재질의 페트리디쉬를 사용하여도 된다.

마) 슬라이드를 깨끗한 타올 위에 비스듬히 기울여놓고 마이크로피펫을 사용하여 과잉의 검출시약(detection reagent)을 조심스럽게 제거하되 시료를 건드리지 않도록 조심한다.

바) 웰슬라이드의 웰에 세정완충액을 시료가 모두 잠기도록 첨가하고 마)의 과정과 같이 세정완충액을 제거한다.

사용한 직접염색키트에 포함된 세정완충액(wash buffer)을 사용할 수 있다.

사) DAPI 염색용액 50 μL를 각 웰에 첨가하고, 1분 이상 실온에서 정치한 후 슬라이드를 깨끗한 타올 위에 비스듬히 기울여놓고 마이크로피펫을 사용하여 과잉의 DAPI 염색용액을 조심스럽게 제거하되 시료를 건드리지 않도록 조심한다.

아) 바)의 과정을 수행한다.

자) 마운팅메디움 한 방울을 웰 중앙에 떨어뜨린다.

차) 커버글라스로 웰슬라이드의 웰을 덮은 후 가장자리를 아주 부드럽게 누른다. 마운팅메디움 내에 공기방울이 생기지 않도록 주의한다. 커버글라스 주변의 과잉의 마운팅메디움을 티슈로 닦아낸 후 매니큐어로 테두리를 봉한다.

카) 염색이 완료된 일시를 시험일지에 기록한다. 즉시 관찰이 어려울 경우 암실의 냉장상태(1–10 ℃)에서 보관한다.

6) (난)포낭의 검출 및 계수과정

가) 현미경관찰

(1) (난)포낭은 현미경 관찰에 의한 면역형광검사(Immunofluorescence assay, IFA), DAPI염색검사 그리고 미분간섭대비(Differential interference contrast, DIC) 관찰을 통해 확인되어야 한다.

(2) 양성대조군에 대한 면역형광검사와 DAPI염색검사를 실시하여 (난)포낭이 나)와 다)의 판정기준과 같이 확인하기에 적절한 형광성이 관찰되며, 음성대조군에 대한 면역형광검사와 DAPI염색검사를 실시하여 (난)포낭이 발견되지 않을 경우 시료를 주사관찰 할 수 있다. 확인된 (난)포낭의 관찰결과는 최소 1000배의 총배율에서 찍은 면역형광검사, DAPI염색검사 그리고 미분간섭대비(DIC) 관찰 사진을 크립토스포리디움 난포낭 및 지아디아 포낭에 대해 각각 보관한다.

(3) 시료에 대한 현미경 관찰은 체계적으로 이루어져야 한다. 그림 2와 같이 웰슬라이드 웰의 옆에서 옆으로 또는 위에서 아래로 지그재그 방식으로 주사관찰 하여야 한다.

그림 2. 웰슬라이드의 주사관찰 방법.

나) 지아디아 포낭의 판정

(1) 최소 400배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 면역형광검사를 통하여 테두리가 초록색으로 밝게 빛나는 길이 8-18 μm, 폭 5–15 μm 정도의 타원형이나 원형물체가 확인되면 계속해서 DAPI 염색검사와 미분간섭대비(DIC)관찰을 한다.

(2) 최소 400배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 DAPI 염색검사를 통하여 물체의 내부에 2-4개의 밝고 선명한 하늘색 핵이 있거나, 물체의 내부 염색이 외부보다 짙은 하늘색을 띄는 경우 DAPI 양성, 뚜렷한 핵이 없으며 초록색 테두리의 내부염색이 옅은 경우는 DAPI 음성으로 구분한다.

(3) 최소 1000배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 미분간섭대비(DIC) 관찰을 통하여 지아디아 포낭에 비정형적인 것(예를 들면, 돌출물, 가지, 부가물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한두개의 핵, 결정체나 포자 등)이 없어야 한다. 비정형적인 구조가 관찰되지 않으며 (1)과 (2)의 기준을 만족하는 물체는 미분간섭대비(DIC) 관찰결과에 따라 다음의 세 가지로 구분한다.

(가) 속이 빈 지아디아 포낭

(나) 무정형의 구조를 가진 지아디아 포낭

(다) 핵이 2-4개 이거나, 내부구조(핵, 중심체, 축삭돌기) 중 두 가지 이상을 가진 지아디아 포낭

다) 크립토스포리디움 난포낭의 판정

(1) 최소 400배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 면역형광검사를 통하여 테두리가 초록색으로 밝게 빛나는 직경 4-6 μm, 타원형이나 원형 물체가 확인되면 계속해서 DAPI 염색검사와 미분간섭대비(DIC)관찰을 한다.

(2) 최소 400배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 DAPI 염색검사를 통하여 물체의 내부에 1-4개의 밝고 선명한 하늘색 핵이 있거나, 물체의 내부 염색이 외부보다 짙은 하늘색을 띄는 경우 DAPI 양성, 뚜렷한 핵이 없으며 초록색 테두리의 내부염색이 옅은 경우는 DAPI 음성으로 구분한다.

(3) 최소 1000배의 총배율을 갖는 현미경에 의한 미분간섭대비(DIC) 관찰을 통하여 크립토스포리디움 난포낭에 비정형적인 것(예들 들면, 돌출물, 가지, 부가물, 구멍, 세포 전체를 차지하는 한 두개의 핵, 결정체나 포자 등)이 없어야 한다. 비정형적인 구조가 관찰되지 않으며 (1)과 (2)의 기준을 만족하는 물체는 미분간섭대비(DIC) 관찰결과에 따라 다음의 세 가지로 구분한다.

(가) 속이 빈 크립토스포리디움 난포낭

(나) 무정형의 구조를 가진 크립토스포리디움 난포낭

(다) 내부구조(1-4개의 스포로조이트)를 가진 크립토스포리디움 난포낭

라) 판정 결과 기록

(1) (난)포낭의 최종 판정은 반드시 분석책임자의 확정을 받아야 한다.

(2) 관찰된 물체는 크립토스포리디움 및 지아디아 검사결과 기록서에 형태, 크기, DAPI 염색결과, 미분간섭대비(DIC) 관찰결과를 기록한다.

(3) 관찰된 (난)포낭은 모두 면역형광염색결과, DAPI 염색결과, 미분간섭대비(DIC)관찰결과가 포함되도록 사진 또는 그림 파일로 보관한다.

바. 정도관리

본 방법을 사용하는 실험실은 (난)포낭의 검사에 대한 정도보증 프로그램을 수행하여야 한다. 정도보증 프로그램은 본 방법을 수행할 검사능력이 확보되었는지를 증명하기 위한 검사 개시 이전의 초기수행평가와 검사 개시 이후 실험결과의 질을 보증하기 위한 중도수행평가로 구성되어야 한다. 초기수행평가와 중도수행평가의 결과는 표 1~2의 수행평가 허용기준을 만족하여야 한다.

1) 초기수행평가

초기수행평가는 본 방법을 수행할 검사능력이 확보되었는지를 평가하기 위한 것으로 다음의 절차를 준수하여야 한다.

가) 원수검사를 위한 초기수행평가는 4개의 접종 정제수시료와 1개의 음성시료 그리고 4개의 접종 현장시료가 검사되어야 한다. 단, 접종 현장시료는 접종하지 않은 현장시료와 동시에 검사되어야 한다.

나) 정수검사를 위한 초기수행평가는 4개의 접종 정제수시료와 1개의 음성시료가 검사되어야 한다. 단, 접종 현장시료와 접종하지 않은 현장시료에 대한 검사는 생략한다.

다) 접종 정제수시료와 접종 현장시료는 각각 정제수와 현장시료 10 L에 정도관리용(난)포낭 표준용액을 접종하여 조제한다.

라) 검사는 본 시험방법에 따라 실시하되 4개의 접종 정제수시료와 음성시료를 우선 검사한다. 음성시료는 접종하지 않은 정제수시료를 의미한다.

마) 각 접종 정제수시료의 검사에 대한 회수율(R)을 다음의 식을 사용하여 계산하고 평균 회수율과 그 상대표준편차(Relative Standard Deviation, RSD)를 구한다. 상대표준편차는 표준편차를 평균 회수율로 나눈 후 100을 곱하여 구한다.

[eqn: R=100` TIMES ` {N} over {T}]

R = 회수율(%)

N = 회수된 (난)포낭의 수

T = 접종된 (난)포낭의 수

바) 계산된 평균회수율과 그 상대표준편차를 표 1과 표 2의 수행평가 허용기준과 비교한다.

사) 허용기준을 만족할 경우 4개의 접종 현장시료를 1개의 접종하지 않은 현장시료와 함께 검사하고, 각 접종된 현장시료의 검사결과에 대하여 다음 식을 사용하여 회수율(R)을 계산한다.

[eqn: R=100` TIMES ` {Nsp-Ns} over {T}]

R = 회수율(%)

Nsp = 접종 현장시료에서 회수된 (난)포낭의 수

Ns = 미접종 현장시료에서 검출된 (난)포낭의 수

T = 접종된 (난)포낭의 수

아) 계산된 평균회수율과 그 상대표준편차를 표 1과 표 2의 수행평가 허용기준과 비교한다.

자) 허용기준을 만족할 경우에만 공식적인 분석을 실시할 수 있다.

차) 초기수행평가에 관한 모든 사항은 반드시 기록하여 5년간 보관하여야 한다.

2) 중도수행평가

중도수행평가는 일상적인 분석이 모든 기준을 만족하고 있는지 평가하기 위한 것으로서 다음의 절차를 준수하여야 한다.

가) 중도수행평가는 기관별로 실시하되, 매 분기 1회 이상 또는 매 분기 검사시료 수가 20개를 초과하는 경우 20개 시료마다 실시한다.

나) 원수는 1개의 접종 정제수시료, 1개의 음성시료 그리고 1개의 접종 현장시료를 검사한다. 단, 접종 현장시료는 접종하지 않은 현장시료와 동시에 검사한다.

다) 정수는 1개의 접종 정제수시료, 1개의 음성시료를 검사한다. 단, 접종 현장시료와 접종하지 않은 현장시료 검사는 생략한다.

라) 접종 정제수시료와 접종 현장시료는 각각 정제수와 현장시료 10 L에 정도관리용(난)포낭 표준용액을 접종하여 조제한다.

마) 검사는 본 시험방법에 따라 실시한다.

바) 각 검사에 대한 회수율(R)을 계산하고 표 1과 표 2의 수행평가 허용기준과 비교한다.

사) 허용기준을 만족하지 못한 경우, 원인을 규명하고 문제를 해결한 후에 중도수행평가를 재실시 한다.

아) 중도수행평가에 관한 모든 사항은 반드시 기록하여 5년간 보관하여야 한다.

표 1. 크립토스포리디움 수행평가 허용기준

수행평가	접종 정제수시료	접종 현장시료	음성시료
초기수행평가 평균 회수율(%) 정밀도(상대표준편차, RSD)	24 - 100 최대 55	13 - 111 최대 61	음성
중도수행평가 회수율(%)	11 - 100	13 - 111	음성

표 2. 지아디아 수행평가 허용기준

수행평가	접종 정제수시료	접종 현장시료	음성시료
초기수행평가 평균 회수율(%) 정밀도(상대표준편차, RSD)	24 - 100 최대 49	15 - 118 최대 30	음성
중도수행평가 회수율(%)	14 - 100	15 - 118	음성

3) 마이크로피펫과 현미경의 보정

가) 마이크로피펫은 연 1회 이상 제조업체에 보내거나 매뉴얼에 제시된 방법에 따라 보정되어야 한다.

나) 현미경은 매뉴얼에 제시된 방법에 따라 또는 전문가에 의해 유지․관리되고 정기적으로 보정되어야 한다. 현미경 관찰에 앞서 퀠러조명법(Köhler illumination)에 따른 현미경 조절을 실시한다.

(1) 퀠러조명법

(가) 준비된 슬라이드를 현미경 대물대 위에 놓고 원하는 배율의 대물렌즈로 이동시킨 다음 광원을 켜고 조동 및 미동나사를 사용하여 표본상의 초점을 맞춘다.

(나) 현미경 본체 하단에 위치한 광원 조리개(Radiant field diaphragm)와 집광장치의 개구 조리개(Aperture diaphragm)를 모두 연다. 현미경 아래에 있는 광원 조리개를 투과된 빛의 반점이 최소로 될 때까지 닫는다.

(다) 집광장치 전단의 왼쪽과 오른쪽에 있는 중심조절나사(Centering screw)를 조절하여 작은 반점을 시야의 중앙으로 옮긴다.

(라) 홍채조리개(Iris field diaphragm)의 가장자리가 선명한지를 관찰하여, 선명하지 않을 경우에는 집광장치의 초점조절장치로 집광장치 높이를 변경시켜 초점을 보다 뚜렷하게 맞출 수 있다. 밝은 원의 가장자리가 시야에서 사라질 때까지 광원조리개를 연다.

(2) 형광 수은램프의 사용시간을 일지에 기록하여 관리하며, 50 W 램프는 가급적 100시간을 넘지 않도록 하고, 100 W 램프는 가급적 200시간을 넘지 않도록 한다.

사. 기타 사항

1) 오염 방지

가) 이 방법에 사용되는 용액과 시약들은 적절히 재사용되거나 관리되어 환경에 위해를 주지 않아야 한다.

나) 용액과 시약들은 실험에 필요한 양만을 조제함으로써 사용기한을 넘겨 폐기되는 양이 최소화되어야 한다.

2) 폐기물 처리

가) 살아있는 (난)포낭이 부착되거나 함유되었을 가능성이 있는 시료, 시약, 기구 등은 폐기 전에 반드시 멸균처리 되어야 한다.

나) 폐기물은 적절히 처리되어야 한다.

3) 본 실험방법에 소개된 모든 부품, 조립완제품, 장비, 기구, 시약들은 동일한 기능과 조성의 국내․외 다른 제조사 부품이나 조립완제품으로 대체할 수 있다.