[별표 1]

수출입 동물 및 축산물의 전염병 세부 검사방법

Ⅰ. 세균성 전염병

1. 브루셀라병 (Brucellosis)

◦ 로즈벵갈응집반응법

◦ 평판응집반응법

◦ 시험관응집반응법

◦ 효소면역법

◦ 보체결합반응법

◦ 정액응집반응검사법

2. 결핵병 (Tuberculosis)

◦ 투베르쿨린 피내반응법

3. 요네병 (Johne's Disease)

◦ 효소면역법

◦ 보체결합반응법

4. 렙토스피라병 (Letospirosis)

◦ 현미경응집반응법

5. 소생식기캠필로박터감염증(Bovine Genital Campylobacteriosis)

◦ 원인체동정

6. 말전염성자궁염 (Contagious Equine Metritis)

◦ 원인체동정

◦ 카드응집반응법

7. 비저 (Glanders)

◦ 보체결합반응법

8. 말파라티푸스 (Equine Paratyphoid)

◦ 평판응집반응법

◦ 시험관응집반응법

9. 탄저 (Anthrax)

◦ 원인체동정

◦ 아스코리검사법

10. 돼지 위축성비염 (Atrophic Rhinitis)

◦ 원인체동정

11. 추백리 (Pullorum Disease)

◦ 원인체동정

◦ 급속혈청응집반응법

◦ 시험관응집반응법

◦ 미세응집반응법

12. 닭마이코플라즈마병 (Avian Mycoplasmosis)

◦ 급속혈청응집반응법

◦ 혈구응집억제반응법

13. 가금티푸스 (Fowl Typhoid)

◦ 원인체동정

◦ 급속혈청응집반응법

◦ 시험관응집반응법

◦ 미세응집반응법

14. 가금콜레라(Fowl Cholera)

◦ 원인체동정

15. 살모넬라균감염증 (Salmonellosis)

◦ 원인체동정

16. 기타검사법

◦ API 20E 검사법

◦ Catalase 검사법

◦ Oxidase 검사법

◦ 그람염색법

◦ Ziehl-Neelsen's 염색법

◦ 운동성검사법

◦ Cryobank를 이용한 세균보존법

◦ Vitek system을 이용한 세균동정법

Ⅱ. 바이러스성 전염병

1. 블루텅병 (Bluetongue)

◦ 효소면역법

2. 소백혈병 (Bovine Viral Leukosis)

◦ 면역확산법

◦ 효소면역법

3. 수포성구내염 (Vesicular Stomatitis)

◦ 효소면역법

◦ 바이러스중화시험

4. 말전염성빈혈 (Equine Infectious Anemia)

◦ 면역확산법

5. 말전염성동맥염 (Equine Infectious Arteritis)

◦ 바이러스중화시험

◦ 말정액 항원검사

6. 돼지오제스키병 (Aujeszky's Disease)

◦ 바이러스중화시험

◦ 효소면역법

◦ 원인체동정

7. 돼지생식기호흡기증후군 (Porcine Reproductive and Rrespiratory Syndrome)

◦ 효소면역법

◦ 간접형광항체법

8. 돼지 인플루엔자 (Swine influenza)

◦ 항원․항체검사

◦ 돼지정액 항원검사

9. 메디-비스나 (Maedi-Visna)

◦ 면역확산법

◦ 효소면역법

10. 뉴캣슬병 (Newcastle Disease)

◦ 혈구응집억제반응법

◦ 원인체동정

11. 닭전염성기관염 (Avian Infectious Bronchitis)

◦ 혈구응집억제반응법

12. 닭전염성F낭병 (Infectious Bursal Disease)

◦ 면역확산법 (QIA)

13. 닭전염성후두기관염 (Infectious Laryngotrachitis)

◦ 면역확산법

◦ 효소면역법

◦ 바이러스중화시험

14. 닭뇌척수염 (Avian Encephalomyelitis)

◦ 면역확산법

◦ 효소면역법

15. 조류인플루엔자 (Avian Infleuenza)

◦ 원인체동정

◦ 면역확산법

16. 마렉병 (Marek Disease)

◦ 면역확산법

17. 광견병 항체가검사 (Rabies Antibody titer test)

◦ 형광항체바이러스중화시험

Ⅲ. 기생충성 전염병

1. 말파이로플라즈마병 (Equine Piroplasmosis)

◦ 효소면역반응

◦ 형광항체법

2. 구역 (Dourine)

◦ 보체결합반응법

◦ 형광항체법

3. 아나플라즈마병 (Anaplasmosis)

◦ 혈액도말표본검사

◦ 효소면역법

◦ 보체결합반응법

◦ 카드응집반응법

4. 바베시아병 (Babesiosis)

◦ 형광항체법

◦ 혈액도말표본검사

5. 타이레리아병 (Theileriosis)

◦ 혈액도말표본검사

6. 트리코모나스 감염증 (Trichomoniasis)

◦ 원인체동정

Ⅳ. 꿀벌 질병

1. 부저병 (Foulbrood Disease)

◦ 원인체동정

◦ 홀스트씨 우유검사

2. 석고병 (Stone Disease) 및 백묵병 (Chalkbrood Disease)

◦ 원인체동정

3. 낭충봉아부패병 (Sacbrood Disease)

◦ 항원검사

4. 기생성 응애류 (Parasitic Mites)

◦ 원인체동정

브루셀라병 Brucellosis
	로즈벵갈응집반응법 Rose bengal test
			대성미생물, 영국 VLA

1. 진단액 : Brucella abortus 1119-3 배양균 부유 액에 색소를 가한 붉은 장미색의 농후한 균액

2. 냉장고에 보존해둔 가검혈청과 진단액을 꺼내어 실온에 30분～1시간 방치

(이때 진단액은 사용할 분량만큼만 내놓고 나머지는 신속히 냉장고에 다시 넣는다. 진단액을 너무 자주 꺼내어 실온에 장시간 방치하면 빠르게 변질되어 못쓰게 되니 특히 조심)

3. 검사용 평판에 진단액 30㎕씩 분주한다.

4. 가검혈청 30㎕를 진단액 옆에 섞이지 않도록 분주한다.

5. 위 두 가지를 유리막대로 혼합한다..

6. 타이머를 4분으로 조정하고 4분 동안 잘 흔들어서 반응시킨 후에 즉시 응집상을 판정한다.

7. 판독 : 평판을 기울여 보면서 읽으면 판독이 쉬움 (광원이 좋아야 함).

8. 어떤 경우에는 반응이 신속히 일어나고, 다른 경우에는 4분이 종료되어야 일어남.

9. 실험결과     -  :  응집 없음

+  :  응집 (응집정도에 관계없이)

10. 대조 : 이미 알고 있는 양성혈청과 음성혈청을 매 검사 시 대조군으로 사용

브루셀라병 Brucellosis
	평판응집반응법 Buffered plate agglutination test
			QIA

1. 진단액 : Brucella abortus 1119-3 배양균 부유 액에 크리스탈 바이올렛과 브릴리언트 그린을 가한 농후한 균액

2. 검사방법

- 평판용 진단액과 가검혈청은 실온에 1시간 정도 방치한 후 사용한다.

가) 유리판에 가검혈청 및 진단액 분주 (0.2㎖ 피펫 사용)

가검혈청(㎖)	0.08	0.04	0.02	0.01
진단액 (㎖)	0.03	0.03	0.03	0.03
희 석 배 수	1/25	1/50	1/100	1/200

나) 유리막대로 잘 혼합한다.

다) 결과판정

- 혼합 후 타이머를 8분에 맞춰 4분후에 4회 회전시키고, 8분후에 4회 회전하면서 응집 상을 판정한다.

가검희석혈청				판 정
1/25	1/50	1/100	1/200	비예방접종우	관인예방접종우
- ± + + + + + + +	- - - ± + + + + +	- - - - - ± + + +	- - - - - - - ± +	음 성 〃 〃 의양성 〃 〃 양 성 〃 〃	음 성 〃 〃 〃 〃 의양성 〃 〃 양 성

※ 주의사항 :  1. 사용 전 충분히 흔들 것

2. 얼리지 말 것

브루셀라병 Brucellosis
	시험관응집반응법 Serum agglutination test
			QIA

1. 진단액 : 본 진단액은 Brucella abortus 1119-3 배양균을 사용 전에 0.5% 석탄산이 가해진 생리적 식염수로 1:100으로 희석한 균부유액을 사용한다.

2. 진단액 제조

가. 0.5% phenol saline 조제

NaCl	0.85ｇ

Phenol	0.5㎖

D. W.	99.5㎖

나. 진단액 준비 : 반드시 사용 12시간 전에 제조해둔 것이 좋음 ⇐ 4℃에서 60일간 사용 가능

진단액(원액)	1㎖

0.5% phenol saline	99㎖

3. 검사방법

가. 다음 방법 중 선택하여 4부 시험관에 가검혈청 및 진단액을 분주한다.

(방법 1)

가검혈청(㎖)	0.08	0.04	0.02	0.01	0.005
진단액 (㎖)	2	2	2	2	2
희 석 배 수	1/25	1/50	1/100	1/200	1/400

(방법 2)

가검혈청(㎖)	0.16	2	2	2	2
진단액 (㎖)	4	2	2	2	2	2
희 석 배 수	1/25	1/50	1/100	1/200	1/400

나. 잘 혼합하여 37.5℃ 배양기 내에서 48시간 작용시킨 후 판정한다.

(응집여부 관찰)

다. 결과판정

가검희석혈청				판 정
1/25	1/50	1/100	1/200	비예방접종우	관인예방접종우
- ± + + + + + + +	- - - ± + + + + +	- - - - - ± + + +	- - - - - - - ± +	음 성 〃 〃 의양성 〃 〃 양 성 〃 〃	음 성 〃 〃 〃 〃 의양성 〃 〃 양 성

※ 주의사항 :  1. 사용 전 충분히 흔들 것

2. 얼리지 말 것

※  USDA Tube Agglutination Test

(시험관 응집반응법 검사용 탁도 대조)

시험관번호	1	2	3	4	5
Phenol saline(㎖)	2	1.5	1	0.5	0
100×희석항원(㎖)	0	0.5	1	1.5	2

Mix하여 37.5℃에서 48시간 시료와 같이 감작하여

시료판정 시 대조용으로 사용

% Agglutination	100	75	50	25	0

브루셀라병 Brucellosis
	시험관응집반응법 Serum agglutination test
			영국 VLA

1. 진단액 : 영국 수의연구소(VLA)에서 생산된 항원 사용

(반드시 항원은 지시대로 희석 사용 ⇐ Phenol saline에 10배 희석)

2. 생리식염수 제조하여 실온보관

◦ NaCl	8.5g	4.25g	0.85g

◦ D.W.	1000㎖	500㎖	100㎖

3. Phenol saline(진단액 희석용)용액을 제조하여 실온보관 ⇐ USDA용액 사용

◦ Phenol	5g(㎖)	2.5g(㎖)	0.5g(㎖)

◦ 생리식염수	1000㎖	500㎖	100㎖

4. 항원을 희석하여(반드시 항원은 phenol saline에 10배 희석) 4℃에 보관

영국 VLA항원 1㎖+Phenol saline 9㎖	⇐ 10두분 검사량

5. 시험관 응집반응검사 실시

시험관번호 구 분	1	2	3	4
Phenol saline (㎖)	0.8	0.5	0.5	0.5	0.5㎖ 버림
가검혈청 (㎖)	0.2	0.5	0.5	0.5
	Vortex mix
Working 항원 (㎖)	0.5	0.5	0.5	0.5
	Vortex mix
최종 혈청 희석 배수	10	20	40	80

6. 시험관 응집반응법 검사용 탁도 대조군 제조

시험관번호 구 분	1	2	3	4	5
Phenol saline (㎖)	1	0.75	0.5	0.25	0
항원(㎖) (희석항원 2㎖+Phenol S.2㎖)	0	0.25	0.5	0.75	1
응 집 %	100	75	50	25	0
결 과 기 록	4+	3+	2+	1+	0

7. 5번 및 6번 시험관을 37℃ 인큐베이터에서 19～21시간 반응

8. 결과판독 : 결과는 표준탁도군과 대조하여 반드시 각 희석혈청배수에서 4+, 3+, 2+, 1+, 0으로 기록하여 다음 장의 도표에서 IU/㎖를 결정하여 최종 부루세라병 감염유무 판정

4+ : 100% 응집

3+ : 75% 응집

2+ : 50% 응집

1+ : 25% 응집

0  : 응집형성 없음

※ 양성판정 : 30IU(1:20 2+) 이상

VLA연구소 시험관 응집반응 검사 판독 후 IU/㎖ 계산 도표�□

최종혈청희석배수	응집판독	IU/㎖	비고
1:10	+ ++ +++ ++++	12.5 15 18 21
1:20	+ ++ +++ ++++	25.5 31 36 42
1:40	+ ++ +++ ++++	51.5 61.5 72 84
1:80	+ ++ +++ ++++	102.5 123 144 168

※ 사용된 표준항원은 Isabs의 650배 희석시 50% 응집 보여줌

브루셀라병 Brucellosis
	효소면역법 Brucella-Ab C-ELISA
			스웨덴 Svanova

※ 야외감염 개체와 백신접종 개체와의 감별진단

1. 제품정보

Species	Bovine, ovine, caprine, porcine
Samples	Serum and plasma
Type	Competitive ELISA based on s-LPS antigen, detects B. abortus, B. melitiensis and B. suis

2. 시약준비

가. PBS-Tween Buffer :

PBS-Tween Buffer 제조 :

D.W. 475㎖+PBS-Tween Solution 20× 25㎖

⇓

철저하게 섞는다

나. mAB Solution :

mAB Solutionr 제조 :

동결건조 된 mAB +Sample Dilution Buffer 6㎖

⇓

부드럽게 섞는다(Vortex mixer는 사용금지)

3. 검사방법

가. 모든 시약은 사용하기 전 실온에 둔다.

나. 시약과 대조혈청의 희석(1:10)

가검(대조) 혈청 희석

희석액 180㎕+가검(대조)혈청 20㎕

다. Worksheet 작성

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11		12
A	CC	CC	6	6	14	14	22	22	30	30	38	38
B	NC	NC	7	7	15	15	23	23	31	31	39	39
C	WPC	WPC	8	8	16	16	24	24	32	32	40	40
D	시료 1	시료 1	9	9	17	17	25	25	33	33	41	41
E	2	2	10	10	18	18	26	26	34	34	42	42
F	3	3	11	11	19	19	27	27	35	35	43	43
G	4	4	12	12	20	20	28	28	36	36	44	44
H	5	5	13	13	21	21	29	29	37	37	45	45

※ CC : Conjugate Control,	NC : Negative control

WPC : Weak positive control,	PC : Positive control

라. 희석된 가검(대조) 혈청 50㎕ 첨가

※ Conjugate control well에는 희석액 50㎕ 첨가

마. 모든 well에 mAb-solution 50㎕ 첨가

※ mAb-solution은 가검(대조)혈청을 넣고 10분 이내에 분주

바. 플레이트를 봉입하고 5분 동안 철저하게 섞는다.

사. 실온(+18-25℃)에서 30분간 배양

아. PBS-Tween Buffer을 이용하여 4번 씻는다.

자. Plate의 모든 well에 Conjugate용액 각 100㎕씩 첨가하여 plate 봉입

차. 실온(+18-25℃)에서 30분간 배양

카. PBS-Tween Buffer을 이용하여 4번 씻는다.

타. 모든 well에 Substrate Solution 100㎕ 첨가15. 실온(+18-25℃)에서 10분간 배양

파. Stop Solution 50㎕ 첨가하고 철저히 섞는다.

하. ELISA reader 450㎚ filter에서 판독

※ Stop Solution 첨가 후 15분 이내에 측정

4. 결과계산

◦ PI(percent inhibition) = 100 -	(Mean OD sample/control × 100)
	Mean OD conjugate control Cc

※ 예시 : PI(percent inhibition) = 100 -	0.300 ×100	= 70.9 %
	1.030

5. 결과의 유효성

◦ OD Cc : 0.75 - 2.0

◦ PI Positive Control : 80 - 100

◦ PI Weak Positive Control : 30 - 70

◦ PI Negative Control : (-10)- 15

※ 위의 수치가 나오지 않으면 재 실험

5. 결과 판독

◦ 음성 : PI〈 30%

◦ 양성 : PI ≥ 30%

브루셀라병 Brucellosis
	효소면역법 Brucella-Ab Indirect-ELISA
			스웨덴 Svanova

1. 제품정보

Species	Bovine
Samples	Serum/ plasma, individual and pools of ≤ 10, Milk, individual and pools of ≤100
Type	Indirect ELISA captures antibodies to B. abortus and B. melitensis.

2. 시약준비

가. PBS-Tween Buffer :

PBS-Tween Buffer 제조 :

D.W. 475㎖+PBS-Tween Solution 20× 25㎖

⇓

철저하게 섞는다

나. Anti-Bovine HRP IgG conjugate:

Anti-Bovine HRP conjugate 제조 :

동결건조 된 HRP conjugate + PBS-Tween Buffer 11.5㎖

⇓

1분 정도 정치한 후 잘 섞는다.

3. 검사방법

가. 모든 시약은 사용하기 전 실온에 둔다.

나. Sample dilution buffer를 100㎕씩 플레이트의 각 well에 분주한다.

다. 양성/음성 대조군, 샘플혈청을 4㎕씩 플레트의 해당 well에 분주한다.

라. 상기 플레이트를 흔들어서 잘 섞이게 한 후 37℃에서 1시간 반응시킨다.

마. PBS-Tween Buffer을 이용하여 3번 세척한다.

바. HRP conjugate를 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시킨다.

사. PBS-Tween Buffer을 이용하여 3번 세척한다.

아. Substrate solution을 100㎕씩 분주한 후 실온에서 10분간 반응시킨다.             이때 직사광선을 피해 어두운 장소에 둔다.

자. Stop solution을 50㎕씩 분주한다.

차. ELISA reader기 450nm에서 결과를 읽는다.

4. 결과계산

◦ PP(percent positivity values) =	(Mean OD sample or Neg C	× 100
	Mean OD positive control

5. 결과의 유효성

◦ OD Positive Control > 1

◦ OD Negative Control < 10

6. 결과 판독

- Individual serum의 경우

◦ 음성 : PP〈 40 %

◦ 양성 : PP ≥ 40 %

브루셀라병 Brucellosis
	보체결합반응 Complement fixation test
			영국 VLA

1. VBS Stock 제조

A. Barbital stock solution

○ Barbiturate acid	2.88g

○ D.W.	250㎖

- 상기 시약을 열을 가하여(Hot plate) 완전히 용해시킨 후, 냉각시킴.

B. Barbital sodium stock solution

○ Sodium chloride (NaCl)	4.25g

○ Sodium barbiturate	1.88g

○ Magnesium sulphate	1.02g

○ Calcium chloride	0.15g

○ D.W.	750㎖

< Working VBS Solution >

- 상기 A와 B 용액을 혼합하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 검사 직전 0.04% gelatin 용액으로 5X 희석하여 시험에 사용한다.

○ VBS stock solution	100㎖

○ 0.04% gelatin solution	400㎖

C. 0.04% Gelatin solution

○ Bacto gelatin	0.4g

○ D.W.	20㎖

- 60℃에서 완전 용해한 다음, D.W. 80㎖ 첨가 혼합하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 VBS Stock 용액의 희석액으로 사용한다.

- 0.04% gelatin 용액은 2주간 냉장고에 보관가능.

2. Hemolysin Titration

가. Hemolysin 10X 및 15X 희석액 제조

○ 10X ⇒ Hemolysin 100㎕(0.1㎖) + VBS 900㎕(0.9㎖)

○ 15X ⇒ Hemolysin 100㎕(0.1㎖) + VBS 1,400㎕(1.4㎖)

↓

○ 1,000X ⇒ 상기 10X 희석액 10㎕ + VBS 990㎕

○ 1,500X ⇒ 상기 15X 희석액 10㎕ + VBS 990㎕

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
희석배수	1,000	2,000	4,000	8,000	16,000	32,000	64,000
A
B
C
D
E
F
G
H
희석배수	1,5000	3,000	6,000	12,000	24,000	48,000	96,000

나. 마이크로플레이트의 2번에서 7번까지 열의 전 well에 VBS 25㎕씩 분주한다.

다. 마이크로플레이트의 1번과 2번 열의 A～D well에 Hemolysin 1,000X 희석액을 25㎕씩 분주한다.

라. 마이크로플레이트의 1번과 2번 열의 E～H well에 Hemolysin 1,500X 희석액을 25㎕씩 분주한다.

마. 2번 열에서 7번 열까지 25㎕씩 계단희석한 다음, 마지막에서는 25㎕을 버림.

( Hemolysin 희석배수는 1,000X～96,000X 까지 희석됨.)

바. 7번 열까지의 전체 well에 3% 혈구를 25㎕씩 분주한다.

사. 실온에서 30분간 감작시킨다.(마이크로플레이트의 Mixer에서 shaking 시킴)

아. 모든 well에 VBS 50㎕씩 분주하여 혼합시킨다.

자. 모든 well에 10X 희석된 보체를 25㎕씩 분주하여 혼합시킨다.

10X 희석 보체 ⇒ 보체원액 1㎖ + VBS 9㎖

차. 37℃에서 30분간 plate를 감작시킨다. (처음 10분간 shaking)

카. 완전히 용혈된 well의 hemolysin 최소희석배수를 찾아낸다.

(1 Unit of MHD)

※ 본 시험에서는 5 Unit를 사용함.

만약, 1 MHD가 1/4,000 이라면,

5 MHD = 1/4,000 × 5/1 = 1/800 (1㎖ Hemolysin + 799㎖ VBS)

3. Complement Titration

가. 10X 희석 보체를 제조한다. (1㎖ 보체 원액 + 9㎖ VBS)

나. 다음과 같이 보체 희석을 제조한다.

최종 희석 배수	10X 희석된 보체량 (㎖)	VBS 량 (㎖)
1/20	1	1
1/25	1	1.5
1/30	1	2
1/25	1	2.5
1/40	1	3

다. Plate 1～5번 열까지의 B～D 및 F～H 행의 well에 VBS 25㎕씩 분주한다.

라. 각각의 희석된 보체를 아래와 같이 25㎕씩 분주한다.

보체 20X 희석액 ⇒ 1번 열의 A, B 및 E, F 행

보체 25X 희석액 ⇒ 2번 열의       〃

보체 30X 희석액 ⇒ 3번 열의       〃

보체 35X 희석액 ⇒ 4번 열의       〃
보체 40X 희석액 ⇒ 5번 열의       〃

마. B에서 D까지 25㎕씩 계단희석하여 마지막 well에서 25㎕ 버린다.

바. F에서 H까지 25㎕씩 계단희석하여 마지막 well에서 25㎕ 버린다.

	1	2	3	4	5
A	1/20	1/25	1/30	1/35	1/40	Antigen
B	1/40	1/50	1/60	1/70	1/80
C	1/80	1/100	1/120	1/140	1/160
D	1/160	1/200	1/240	1/280	1/320
E	1/20	1/25	1/30	1/35	1/40	VBS
F	1/40	1/50	1/60	1/70	1/80
G	1/80	1/100	1/120	1/140	1/160
H	1/160	1/200	1/240	1/280	1/320

사. 모든 well에 VBS 25㎕씩 분주한다.

아. 5번 열까지의 A～D well에 10X 희석한 항원을 25㎕씩 분주한다.

자. 5번 열까지의 E～H well에 VBS를 25㎕씩 분주한다.

차. 37℃에서 30분간 감작시킨다. (처음 10분간 Shaking)

카. Hemolytic system 용액 제조 (Hemolysin titration에서 결정되어져 있음.)

타. 모든 well에 Hemolytic system 5025㎕씩 분주한다.

파. 37℃에서 30분간 감작시킨다. (처음 10분간 Shaking)

하. 완전 용혈된 지점을 찾아낸다.

(1 Unit or 1 MHD)

만약, 1 MHD가 1/60 이었다면 본 시험에 사용되는 보체의 역가는 5/4MHD

⇒ 1/60 × 5/4 = 1/48 (보체 1㎖ + VBS 47㎖)

4. Main Test

가. 마이크로플레이트에 VBS 200㎕ +검사용 시료 혈청 200㎕를 희석하여 각 동물에 따라 다음과 같이 비동화 시킨다.

○ 소 : 58℃ 50분

○ 돼지, 면양 : 60℃ 30분

나. Plate의 A～C 및 E～G well에 VBS 25㎕씩 분주한다.

다. Plate의 D와 C 및 H와 G well에 2배 희석하여 비동화시킨 가검혈청을 25㎕씩 분주한다.

라. C well에서 25㎕씩 A well까지 계단희석한다.

G well에서 25㎕씩 E well까지 계단희석한다.

(D,H ⇒ 2X ; C,G ⇒ 4X ; B,F ⇒ 8X ; E,A ⇒ 16X ; D, H 줄은 AC control)

마. AC control 줄에는 VBS 25㎕ 씩 분주한다.

바. AC control 줄을 제외한 모든 well에 희석된 항원을 25㎕씩 분주한다.

사. 모든 well에 5/4 Unit 보체를 25㎕씩 분주한다.

아. 37℃에서 30분간 감작시킨다. (처음 10분간 Shaking)

자. H.S 제조 ; Hemolysin titration에서 결정되어 있음.

차. H.S를 50㎕씩 분주한다.

카. 37℃에서 30분간 감작시킨다. (처음 10분간 Shaking)

타. 결과 판정

※ 양성판정기준 : 20IU(희석배수 4배에 50%용혈) 이상

브루셀라병 Brucellosis
	정액응집반응검사법 Rose bengal test
			대성미생물, 영국 VLA

1. 진단액 : Brucella abortus 1119-3 배양균 부유 액에 색소를 가한 붉은 장미색의 농후한 균액

2. 냉장고에 보존해둔 가검혈청과 진단액을 꺼내어 실온에 30분～1시간 방치

(이때 진단액은 사용할 분량만큼만 내놓고 나머지는 신속히 냉장고에 다시 넣는다. 진단액을 너무 자주 꺼내어 실온에 장시간 방치하면 빠르게 변질되어 못쓰게 되니 특히 조심)

3. 검사용 평판에 진단액 30㎕씩 분주한다.

4. 가검혈청 30㎕를 진단액 옆에 섞이지 않도록 분주한다.

5. 위 두 가지를 유리막대로 혼합한다.

6. 타이머를 4분으로 조정하고 4분 동안 잘 흔들어서 반응시킨 후에 즉시 응집상을 판정한다.

7. 판독 : 평판을 기울여 보면서 읽으면 판독이 쉬움 (광원이 좋아야 함).

8. 어떤 경우에는 반응이 신속히 일어나고, 다른 경우에는 4분이 종료되어야 일어남.

9. 실험결과     -  :  응집 없음

+  :  응집 (응집정도에 관계없이)

10. 대조 : 이미 알고 있는 양성혈청과 음성혈청을 매 검사 시 대조군으로 사용

결핵병 Tuberculosis
투베르쿨린 피내반응법	Purified Protein Derivative Tuberculin
			QIA

이 진단액은 우결핵균의 배양액을 살균처리하고, 그 여과액을 화학적으로 처리한 정제 항원액이다.

1. 성상 : 무색투명한 액체로서 이물이나 침전물이 없다.

2. 효능 : 소와 유산양의 결핵병 진단을 위한 피내반응용 항원으로 사용한다.

3. 용법 및 용량

◦ 미근부의 추벽부를 알콜면으로 충분히 소독한 후 피내에 0.1㎖씩 정확히 주사.

◦ 소에는 원액을, 유산양에는 50%액을 사용.

◦ 주사 후 48～72시간에 주사부위의 종창을 조사.

4. 판정

◦ 양성 : 주사부위의 종창차가 5㎜ 이상, 주사부위가 경결 또는 괴사를 동반.

◦ 음성 : 종창차가 3㎜ 이하, 경결을 동반하지 않은 것.

◦ 의양성 : 종창차가 3㎜～5㎜ 이하, 양성이나 음성으로 판정하기 곤란한 것.

5. 보존방법 : 2～5℃의 냉암소에 보관한다.

※ 주의사항

- 정확히 미근부 추벽 피내에 주사하여야 한다.

- 사용전에 잘 흔들어준다.

- 주사부위는 알콜면으로 소독한 후 완전히 건조한 다음 주사한다.

- 쓰다 남은 진단액은 잡균의 오염이나 효력이 상실된 우려가 있으므로 사용하지 않는다.

- 동결되었던 진단액은 효력이 없으므로 사용하지 않는다.

- 재검사를 할 때에는 적어도 30일 이상의 간격을 두어야 한다.

※ PPD-T 진단액의 구체적인 내용은 결핵병 및 부루세라병 방역실시요령(농림부고시 제2004-35호, 2004.5.27)을 참고하여 사용

요네병 Johne's Disease
효소면역법	Enzyme-linked Immunosorbent Assay
			미국 IDEXX

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온(18-26℃)에 꺼내놓는다.

나. 양성/음성 대조군, 샘플혈청을 Dilution Buffer N.12로 1:20 희석한 후

18-26℃에서 15분-2시간 반응시킨다.

※ Dilution Buffer N.12에는 Mycobacterium phlei extract가 포함되어있어

unspecific antibodies가 결합하게 된다.

다. 상기 용액을 항원이 코팅되어있는 plate의 각 well에 100㎕씩 분주한 후

실온(18-26℃)에서 45분 또는 2-8℃에서 overnight(16-24 hours) 반응시킨다.

라. 3회 세척한다.

마. 미리 희석해 놓은 conjugate를 100㎕씩 분주한 후 실온에서 30분간 반응시킨다.

※ conjugate 희석 (희석해 놓은 conjugate는 실온에서 8시간 안정하다)

- short protocol : Dilution Buffer N.1으로 1:100 희석

- overnight protocol : Dilution Buffer N.1으로 1:200 희석

바. 3회 세척한다.

사. TMB substrate solution을 100㎕씩 분주한 후 실온에서 10분간 반응시킨다.       이때 직사광선을 피해 어두운 장소에 둔다.

아. Stop solution을 100㎕씩 분주한다.

자. ELISA reader기 450nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ Positive control mean OD ≥ 0.35

◦ Positive control mean OD/Negative control mean OD ≥ 3

3. 결과 판독

◦ Positive : S/P percentage ≥ 55%

◦ Suspect : 45% < S/P percentage < 55%

◦ Negative : 45% ≥ S/P percentage

sample OD - mean negative control

S/P percentage(%) = ---------------------------------------------------------------------

mean positive cotnrol - mean negative control

<PLATE LAYOUT>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	N	N	7	7
B	P	P	8	8
C	1	1	9	9
D	2	2	10	10
E	3	3	11	11
F	4	4	12	12
G	5	5	13	13
H	6	6	14	14

N=NEGATIVE CONTROL

P=POSITIVE CONTROL

1, 2 ,3, etc = SAMPLE #

요네병 Johne's Disease
효소면역법 PARACHEK® 2
	스위스 PRIONICS

I. 대조군과 시료의 분주

1. 실험 전 kit를 미리 실온(18-26℃)에 꺼내놓는다.

2. 양성/음성 대조군과 샘플혈청을 Dilution Buffer로 희석한 후 배양한다.

※ Dilution Buffer 에는 Mycobacterium phlei extract가 포함되어있어

unspecific antibodies가 결합하게 된다.

3. 상기 희석한 샘플혈청을 항원이 코팅되어있는 plate의 각 well에 분주한 후

배양한다.

4. 3회 세척한다. (이때 Unreacted protein은 세척할때 제거된다.)

Ⅱ. Conjugate 첨가

1. Conjugate를 분주한 후 배양한다. (conjugate는 플레이트의 항원과 결합한        immunoglobulin에 반응하게된다.)

2. 3회 세척한다. (이때 Unreacted protoein은 세척할때 제거된다.)

Ⅲ. 발색

1. substrate solution을 각 well에 분주한 후 실온에서 반응시킨다.

이때 직사광선을 피해 어두운 장소에 둔다.

2. Stop solution을 분주한 후 ELISA reader기에서 결과를 읽는다.

※ 자세한 검사방법 및 사용설명서는 kit내 사용자 매뉴얼을 참고할 것

요네병 Johne's Disease
보체결합반응	Complement Fixation Test
			미국 NVSL

1. 각종 시약의 제조

A. Stock MgCl2(1M), CaCl2 (0.3M)용액

◦ Magnesium chloride, hexahydrate (MgCl2, 6H2O)	20.33g 또는

◦ Magnesium chloride, monohydrate (MgCl2, H2O)	9.5g

◦ Calcium chloride, dihydrate (CaCl2, 2H2O)	4.41g	또는

◦ Calcium chloride, monohydrate (CaCl2, H2O)	3.7g

◦ D.W.	100㎖

- 상기 시약을 D.W. 100㎖에 완전 용해시킨후 0.25㎛ 필터로 여과하여 냉장보관 하면서 사용한다.

B. Barbital sodium stock solution

◦ Sodium chloride (NaCl)	85g	42.5g

◦ Sodium 5.5～diethyl barbiturate	3.75g	1.875g

(Barbital sodium, C8H11N2O3Na)

◦ D.W.	1400㎖	700㎖

C. Barbital stock solution

◦ 5.5～diethyl barbituric aicd	5.75g	2.875g

(Barbital  C8H12N2O3)

◦ D.W.	500㎖	250㎖

Barbital stock solution(C.용액)은 D.W를 가열시키면서 완전 용해시킨다.

(Magnetic stirrer를 사용)

- 뜨거운 D.W.에 완전히 용해시킬 것.

- 실온에서 냉각시킨 다음 사용

D. Concentrated barbital buffer solution (CBBS)

◦ B.의 stock solution 1400㎖(700㎖)에 C.의 stock solution 500㎖(250㎖)를 혼합한다.

◦ 상기 A.의 stock 용액을 5㎖(2.5㎖) 첨가하여 혼합

◦ 전체 용량이 2,000㎖(1,000㎖)이 되도록 증류수를 첨가한다.

◦ 라벨링하여 냉장고에 보관

E. BBS working solution

◦ 상기 D.의 CBBS용액 1 volume에 cold D.W. 4 volume을 혼합한다.

(1:4로 희석 ⇒ 5× 희석)

◦ 5× 희석용액을 냉장고에 보관 (희석용액은 매일 만들어 사용)

◦ 5× 희석용액의 pH는 7.3～7.4

※ 5× 희석액은 D.W. 보다는 멸균된 0.04%의 gelatin 용액이 좀 더 우수한 희석액으로 보고되어 있음

※ CFT의 working solution의 복잡한 제조방법을 피하기 위한 수단

⇒ Complement Fixation Test diluent tablet : Oxoid Tablets

(oxoid Code BR 16)을 사용하면 아주 쉽게

CFT 용액을 만듬 : Oxoid tablets

⇒ Commercial tablets

1ℓ 병에 D.W 500㎖

⇓

CFT tablets 10개를 첨가

⇓

열을 가하여 완전 용해시킨다.

⇓

Cooling 후 D.W를 가지고 1ℓ에 맞춘다.

⇓

4℃에 보관하면서 사용 (시험시마다 새로 만들어서 사용)

2. Collection and Storage of Sheep blood(면양혈구 채혈 및 보존)

Alsever's solution

◦ Glucose (C6H6O6)	20.5g

◦ Sodium chloride (NaCl)	4.2g

◦ Trisodium citrate, dihydrate(Na3C6H7․2H2O)	8.0g

◦ Citric acid (C6H8O7)	0.6g

◦ D. W  or  D.D.W	1000㎖

◦ 가열 없이 상기 시약을 완전 용해시킨다.

⇓

115℃에서 20분간 멸균 또는 0.25㎛ 필터로 여과한 후 냉장고에서 보관하면서 사용

3. Washing the Sheep RBC (면양혈구 세척)

◦ 멸균된 alsever's 용액 30㎖를 50㎖ 원심 관에 담는다. (3～4개 준비)

◦ 면양혈액을 무균 적으로 채취하여 즉시 alsever's 용액과 혼합하여 아주 천천히 섞은 다음 냉장고에 보관(Alsever's 용액 30㎖+면양혈액 15-20㎖)

◦ Alsever's 용액과 혼합된 면양혈액은 반드시 냉장고에서 5일 이상 정치한 후(혈구침전) 사용한다.

※ 이와 같은 면양혈구는 약 1달 정도 사용 가능함.

(단, 상층액에 용혈 현상이 육안 적으로 관찰되지 않거나, 혈구의 오염이 의심 되지 않으면 계속 사용)

◦ 정치된 혈액을 일회용 15㎖ 원심분리 관에 4㎖ 정도씩 3～4개씩 분주 (반드시 15㎖ 원심관에 사용)하여 CFT 희석용액을 적당량(9～10㎖) 첨가하여 혼합한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 1회

◦ 모세피펫을 사용하여 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ CFT 희석용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 2회

◦ 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ 다시 CFT 희석용액을 첨가하여 혼합 후 3,000rpm에서 5분간 원심 - 3회

※ 3회 원심 후에도 상층 액이 지속적으로 용혈 시에는 혈구를 버리고 다른 batch 또는 다시 채혈하여 사용함. (alsever's 용액 점검)

◦ 상층 액 및 buffy coat층을 제거

◦ CFT 희석용액을 시험관에 15㎖씩 정도 첨가하여 잘 혼합

◦ 정확하게 1,000g에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층액 제거

◦ 침전된 혈구를 사용하여 3% RBC 부유액을 제조한다.

(필요시 요구되는 RBC의 부유액 제조)

4. Standardization of the RBC Suspension (표준혈구 제조)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

◦ RBC 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심분리 하여 침전된 RBC 1㎖에 CFT 희석 액 32.3㎖를 첨가하면 3% RBC 부유액이 된다.

⇒ 가장 쉬운 3% RBC 부유액 제조법

[방법 2] 정확한 방법

◦ RBC의 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심 하여 침전된 RBC의 양이 얼마인지를 기록한다.

◦ 희석액을 사용하여 packed cell 양의 24배로 희석액을 첨가하여 골고루 희석한다.

◦ ELISA reader의 전원을 켜 놓는다.

◦ 작은 병에 상기의 희석용액 1㎖(250㎕)에 D.W 19㎖(4.75㎖)를 첨가하여 희석한다.

(1:20 희석)

◦ 96well ⊔자(평저)마이크로플레이트에 종으로 8개 well(duplicate)에 각각 100㎕씩 분주

◦ ELISA reader 540㎚ 필터에서 O.D치를 측정하여 16개 well의 평균 O.D치를 계산(Target O.D는 0.115) ⇒ 0.110～0.120

◦ 만약 16개 well의 O.D 평균값이 0.115 보다 높으면 다음 공식에 의거하여 혈구의 최종 희석 농도를 알아냄

O.D의 평균값(16개 well) × RBC 부유 액의 총용량	= 요구되는 최종 희석농도
0.115

※ 만약 O.D의 평균값(16개 well)이 0.255였고, RBC 부유액(24배 희석된 것) 용량이 60㎖라면 CFT 희석액을 얼마나 첨가하면 O.D의 수치가 0.115가 되는 sheep RBC의 농도를 얻을 수 있는가?

0.255×60		=		15.30	= 133.04㎖
0.115				0.115

상기 RBC 부유액 60㎖+희석액 73.04㎖를 첨가하여 희석하면 정확한 3% RBC

◦ 라벨링하여 4℃에 보관

5. Dilution of the Hemolysin (헤모라이신 희석)

(1:100 Stock 용액, 냉동고에 보관)

◦ Hemolysin 원액 1㎖+ 희석액 99㎖ (1:100 stock 용액) ～ 1㎖씩 에펜도르프 시험관에 분주하여 냉동보관

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
stock hemolysin (1:100배)	1㎖	1㎖
1:1000 hemolysin	-	-	시험관2번에서 2㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖
희 석 액	4㎖	9㎖	1㎖	1㎖	2㎖	4㎖	9㎖
Hemolysin 최종 희석 배수	500	1,000	1,500	2,000	3,000	5,000	10,000

※ 1:100 stock hemolysin dilution

VBD 99㎖ + 50% glycerinized hemolysin 1㎖

⇓

1㎖씩 소분하여 냉동고에 보관

6. Titration of the Hemolysin (헤모라이신 역가측정)

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
	(500×)	(1000×)	(1500×)	(2000×)	(3000×)	(5000×)	(10000×)
희석된 Hemolysin (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
3% Sheep RBC (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

◦ gently agitating

◦ 37℃에서 20분간 감작 (5분마다 약하게 혼합)

※ 1:400배 희석된 보체의 준비 ⇒ 원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖(1:10)

⇒ 희석액 11.7㎖ + 1:10 희석보체 0.3㎖(1:400보체희석)↢ 최소한 20분간 냉장보관 후 사용(2시간 이내 사용), 1:300 및 1:500도 준비

※ 희석보체의 결정은 혈구를 70～80% 정도 용혈을 일으키는 양으로 희석하여 사용(희석보체 여러 농도의 실험으로 결정해야 함).

⇒ 300, 400, 500× 희석하여 아래 표처럼 실시하여 보체의 농도 결정

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6	7
Buffer (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
희석보체 (㎖) (4개 농도 희석)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
Shake the rack for mixing
Hemolysin-RBC 희석액 (㎖)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4

◦ throughly mix

◦ 37℃ 항온수조에서 1시간 감작 (30분 배양 후 gently shaking)

◦ 30분간 감작 후 cold 희석액 2㎖를 각각 시험관에 첨가한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 (용혈 안 된 RBC는 침전)한 후 상층액의 100㎕를 ELISA reader의 540㎚ filter에서 O.D를 측정한다.

◦ 7개의 시험관 O.D 수치를 측정하여 아래 공식에 의거 계산된 용혈정도는 다음의 그래프에 표시하여 선을 연결한다.

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.115 (Target O.D)

◦ 연결된 선에 의거하여 본 실험에 사용될 Hemolysin 희석배수를 결정

Hemolysin 역가측정

용

혈

정

도

(%)

80

700

60

50

30

40

20

10000

5000

3000

2000

1500

1000

500000

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

시험관번호	1 (500×)		2 (1000×)	3 (1500×)	4 (2000×)			5 (3000×)	6 (5000×)	7 (10000×)
O.D치
		각 시험관의 O.D치×100					= 용혈정도 %
		0.115 (Target O.D)
용혈정도 %치

◦ 앞의 그림에서의 plateau 선은 1:1000배에서 시작(1000배에서 일직선상의 선이 나타남)

◦ 본 시험에 사용될 hemolysin 희석배수는 25% 보다 더 강한 배수 사용(약 750배).

Hemolytic sensitized cell 제조법

Titration된 hemolysin (1:100) stock을 가지고 상기의 800×로 희석하여 동량의 3% sheep RBC를 첨가하여 항온수조에서 20분간 감작한 후 사용

(5분마다 혼합하여 준다)

♣ Hemolysin의 역가측정은 크게 중요하지 않으나 역가측정의 시험 검사가 끝난 후의 계산에서 hemolysin의 희석배수가 500배 이하일시에는 사용하지 말고 역가 측정을 다시 할 것.

7. Titration of Complement (보체역가 측정)

◦ 3set의 희석보체 준비 (1:300, 1:400, 1:500)

원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖ (1:10배 희석)

⇒ 희석(1:10배)액 0.3㎖+희석액 11.7㎖(1:400배)

⇒ 1:400배 희석보체는 최소한 냉장고에 20분 보관 후 사용

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4
Buffer (㎖)	0.8	0.7	0.6	0.4
항원	0.4	0.4	0.4	0.4
희석보체(ml)	0.4	0.5	0.6	0.8
Hemolysin-RBC 희석액 (㎖)	0.4	0.4	0.4	0.4

◦ Gently mixing

◦ Incubated in a water bath of 37℃ for 30minutes(15분에 한 번 정도 섞어줌)

◦ 30분 감작 후 cold 희석 액 2㎖를 각각의 시험관에 첨가하여 3,000rpm에서 5분간 원심 한 다음 상층 액의 100㎕를 ELISA reader 540㎚ filter에서 O.D치를 측정한다.

◦ 만약 각 시험관의 O.D 수치를 측정하여 다음의 공식에 따라 계산하여 용혈정도의 그래프를 그린 다음 50% 용혈(1C'H50)에 해당하는 보체의 농도를 결정

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.115 (Target O.D)

※ 보체 및 hemolysin 역가 산정시 반드시 target O.D의 값이 같은 조건으로 나누어져야 함.

Calculation of the % of hemolysis in complement titration
Dose fo Complement	O.D	% Hemolysis (Y)	Y/(100-Y)
0.4 0.5 0.6 0.8	0.042 0.052 0.075 0.092	37 45 65 80	37/63 = 0.59 45/55 = 0.82 65/35 = 1.86 80/20 = 4.00

0.8

×

보

체

농

도

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.7

0.8

0.9

1

2 22

3

4

×

0.52

×

×

y(100-y)

50% 용혈을 일으키는 보체역가 측정(1CH50)

※ 5C'H50의 계산법 (본 시험에 사용되는 보체의 희석)

- 전술한 도표 및 그래프에서 희석된 보체(1:400)에서 1C'H50의 O.D치가 0.52였다면, 5C'H50은 2.6 이다. 보체는 희석농도는 얼마인가?

보체의 역가 희석배수	=	보체의 역가 희석(X)
5C'H50		0.8

X =	320		=	123
	2.6

- 희석 되지 않고 보존된 보체원액을 120배로 희석하여 사용하면 5C'H50이 된다.

8. Antigen (항원)

◦ 희석항원을 매일 만들어 사용한다.

◦ 항원은 반드시 제조자 또는 회사가 정해준대로 검사에 필요한 양만 희석하여 사용할 것.

9. Inactivation of Sera (혈청 비동화)

◦ 항온수조에서 또는 인큐베이터에 62.5℃ 30분 동안 비동화(혈청자체만 비동화 시킨 후 8배, 16배, 32배 희석하여 실험에 들어 갈 것)

◦ Anti-complementary activity (ACA)

① 혈청속에는 자연적인 ACA가 있음 ⇐ 열처리에 의하여 파괴됨

② 세균의 감염시 ACA ⇐ 혈청을 고속원심분리 후에 사용 (8,000g×5분)

10. Main Test (본시험)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

A. 양성/음성 대조군 plate

◦ 비동화 처리한 양성/음성 대조군혈청을 준비한다.（대조군 혈청은 희석하지 않는다)

◦ 양성/음성 대조군 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 플레이트의 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ A1 well에 양성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ B1 well에 음성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ 플레이트를 37℃에서 15분간 반응시킨다. (gently shaking)

◦ 희석된 complement 50㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

B.  Complement control plate

◦ CFT 희석용액 50㎕를 G10-12, H10-12 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 50㎕를 G9-10, H9-10 well에 분주한다.

◦ 두 번째 well(G10, H10)에서부터 이진 희석한다.

◦ 플레이트를 37℃에서 15분간 반응시킨다. (gently shaking)

◦ CFT 희석용액 50㎕를 전 well(G9-12, H9-12 )에 분주한다.

<양성/음성 대조군 & Complement Control plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	1/2,048	1/4,096	1/8,192
A	P.S
B	N.S
C
D
E
F
G									Complement control
H

C. 검사혈청 plate

◦ 비동화 처리한  검사혈청을  CFT 희석용액으로 8배 희석한다.

◦ 검사 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 검사혈청 25㎕를 해당 well에 분주한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 플레이트를 37℃에서 15분간 반응시킨다. (gently shaking)

◦ 희석된 complement 50㎕를 전 well에 분주한다.

<검사혈청 plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	시료1	시료9
B	시료2	시료10
C	시료3
D	시료4
E	시료5
F	시료6
G	시료7
H	시료8

D. 플레이트를 37℃에서 30분간 반응시킨다. (gently shaking)

E. Haemolytic system 준비 : 배양을 마치기 20분전에 3% RBC와 동량의 적정희석 된     Hemolysin을 섞은 후 20분 간 감작 시킨다.

F. Haemolytic system 25㎕를 전 well에 분주한 후 37℃에서 45분간 반응시킨다.    (gently shaking)

G. 플레이트를 1,840g 4분 원심분리 후 결과를 판독한다.

[방법 2] End-point titration : 검사혈청에서 양성결과를 보이는 경우 실시

시험관번호 (96 well)	1	2	3	4	5	6	7	8
Dilution	비동화 혈청	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Serum (㎕)	50
Buffer (㎕)		25	25	25	25	25	25	25
Dilute (㎕)		25	25	25	25	25	25	25	25버림
Buffer (㎕)			25
Antigen (㎕)				25	25	25	25	25
◦ 1분간 Shaking ◦ 37℃ 15분간 배양
Complement (㎕)			50	50	50	50	50	50
		◦ Plate는 여러 겹으로 쌓으면 안 됨 ◦ 처음 1분간 Shaking ◦ 37℃ 30분간 배양 ◦ 배양을 마치기 20분 전에 3%RBC와 동량의 적정희석 된 Hemolysin을 섞은 후 20분간 감작하여 사용
H.S.			25	25	25	25	25	25	25
		◦ 처음 1분간 Shaking ◦ incubate at 37℃ 30분(15분에 한번 섞어줌) ◦ 4℃ 에서 3-4시간 정치 또는 원심 후 판독

11. 보체결합반응에 대한 시약 대조

번호	대조 목적	VBD	항원	보체	감작 RBC	3% RBC	결과
1	Ag anticomplementary	.025	.025	.05	.025		0
2	Ag-hemolysin-hemolytic	.075	.025		.025		4
3	C' 5(C'H50) units	.05		.05	.025		0
4	C' 2.5(C'H50) units	.075		.025	.025		+/-
5	C' 2.5(C'H50) units w/Ag	.05	.025	.025	.025		+/-
6	Hemolysin-hemolytic	.10			.025		4
7	Saline-hemolytic	.10				.025	4
8	C'-hemolytic	.05		.05		.025	4
9	Ag-hemolytic	.075	.025			.025	4

12. 판정기준

Percent Hemolysis	판 독	결 과
0% - 50%	+	양성
51% - 90%	±	의심
91% - 100%	-	음성
1 : 8 이하		음성
1 : 16	50% 이하 용혈	의심
1 : 32	50% 이하 용혈	양성

렙토스피라병 Leptospirosis
현미경 응집반응법	Microscopic Agglutination test
			QIA

1. 항원의 보존 및 유지

1) 사용배지

A. Leptospira medium base EMJH(Difco 0794-01-9)

B. Leptospira enrichment EMJH(Difco 0795-73-1) - 냉장보관

2) 배지제조

◦ D.W 900㎖에 상기 A 배지 2.3g 첨가하여 용해

◦ 121℃ 15분간 멸균

◦ 실온에서 45℃까지 냉각

◦ 무균적으로 상기 B의 배지 100㎖ 첨가 혼합

◦ 적당한 용기의 멸균시험관에 적정량(9㎖) 분주 ⇐ 15㎖ tube

◦ 냉장보관

3) 균주의 배양 및 보관

◦ 항원의 계대 ⇒ 상기의 제조된 9㎖ 배지에 배양된 균액을 1500rpm에서 5분간 원심한 후 상층액 1㎖을 접종하여 30℃에서 배양 ⇒ 매주 금요일 마다 지속적으로 계대

◦ 항원의 장기보존 ⇒ 반고체 EMJH 배지에 접종하여 30℃에서 6～7일 배양하여 실온에서 보관 ⇐ 3개월 마다 계대 할 것

4) 항원표준화(2×108개/㎖) ⇒ 항원의 density는 검사 결과에 크게 영향을 미치지 않지만 되도록 항원의 표준 농도를 맞춘다.

항원의 표준화 검사법은 아래의 8번부터 12번에 따른다.

5) 균주 보존을 위한 semisolid 배지 제조법

◦ Base EMJH 2.3g + D.W 900㎖ + bacto agar 3g(0.3%) ⇒ 완전용해

◦ 121℃ 15분간 멸균 ⇒ 실온에서 55℃까지 냉각

◦ 무균적으로 enrichment EMJH 100㎖ 첨가하여 완전히 혼합

◦ 15㎖ tube에 5㎖씩 분주하여 응고시킴

◦ 보존할 Lepto. 균주를 천자하여 30℃에서 3-7일간 배양

◦ 실온 보관 ⇒ 3개월 마다 계대 배양하여 균주의 관리에 철저할 것.

2. 검사방법

1) 가검혈청을 미량원심분리기에서 원심분리 시킨 후 (3000rpm, 5분) 사용

⇐ 일반적으로 생략 가능

2) 평저 96well 마이크로플레이트에 worksheet 작성

3) 평저 96well 마이크로플레이트에 검사할 Leptospira균 serobar (pomona, hardjo 등)를 표시한 플레이트 준비 ⇐ 플레이트 한 장당 10개 시료 검사 가능

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12		혈청희석배수
A	시료1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	음성대조	양성대조		12.5×
B														25×
C														50×
D														100×
E														200×
F														400×
G														800×
H														1600×

4) Plate A열의 1번부터 10번 well까지 검사시료 각 20㎕씩 분주하고, 11번 well에는 음성대조혈청, 12번 well에는 양성대조혈청을 각 20㎕씩 분주.

5) 12 멀티채널 피펫으로 A열의 전체 well(1～12번)에 PBS 225㎕씩 첨가하여 혼합 ⇐ 혈청 12.5×희석

6) B열에서 H열까지의 전 well에 PBS 25㎕씩 분주.

7) 12 멀티채널을 사용하여 A열에서 25㎕씩 취하여 B열에 옮겨서 희석, 계속하여 25㎕씩을 B에서 C열, C열에서 D열, D열에서 E열, E열에서 F열, F열에서 G열, G열에서 H열까지 계단희석 한 다음 H열 희석 후에는 25㎕를 버림.

Plate의 혈청희석배수

A : 12.5×	E : 200×

B : 25×	F : 400×

C : 50×	G : 800×

D : 100×	H : 1600×

8) 4～8일 배양중인 렙토균을 반드시 1500rpm에서 5분간 원심한 다음 상층액을 항원으로 사용함 (8일 이상된 것은 사용하지 말 것).

9) 깨끗한 슬라이드글라스 위에 상층액 한방울을 적하

10) 반드시 커버글라스로서 균액을 덮음

11) 암시야현미경의 200배수에서 관찰하여 균의 오염 및 생존유무를 반드시 확인. (균이 오염 또는 죽었을 경우 실험에 제공할 수 없음)

12) 상기 8)의 상층액의 렙토균 항원을 2×108/㎖ 조정

① 암시야현미경 계산법⇒항원 1drop을 슬라이드글라스+커버그라스⇒

암시야현미경 200x에서 관찰⇒300-500마리가 적당함.

② 흡광도계 (spectrophotometer) 계산법

③ 비탁도법(MacFarland No. Scale) 계산법

◦ 1% BaCl2 0.1㎖+1% H2SO4 9.9㎖ ⇐ 3×108개/㎖

◦ 렙토균액을 상기의 표준탁도와 비슷하게 조정

◦ 렙토균액 조정시에는 PBS 또는 멸균증류수 사용

④ MacFarland Scale No. 0.5로 탁도조절하여 사용하는 것이 가장 좋음

⇐ Colorimeter를 이용한 조정법

13) 2×108개/㎖로 조정된 렙토균을  해당 Plate의 B열부터 H열까지 25㎕씩 첨가

최종혈청 희석배수

B : 50×	F :  800×

C : 100×	G : 1600×

D : 200×	H : 3200×

E : 400×

14) Plate 뚜껑 닫음

15) Plate 혼합기 사용하여 Mix 시킴(용액이 well의 바닥에 고루 깔려져야 함)

16) 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응

17) 암시야현미경 검경

① Plate 자체를 암시야현미경 관찰시

◦ Plate 밑바닥의 습기를 휴지로 제거

◦ 대물렌즈 5×에서 관찰

◦ 먼저 양성 및 음성혈청의 결과 기록하여 검사의 유의성 판정

◦ 시료 판정

◦ Plate는 반드시 1시간 이내에 판독할 것

② Plate 자체를 암시야현미경에서 관찰 못할 경우

◦ 슬라이드글라스를 깨끗이 닦을 것

◦ 검사 Plate의 B열에서 멸균팁 또는 백금이를 사용하여 소량씩 슬라이드글라스 위에 도포하나 커버글라스 덮지 말 것.

(시료가 마르기 전에 검경하여야 함)

1	2	3	4	5
6	7	8	9	10

◦ 암시야현미경의 대물렌즈 200×에서 슬라이드 위의 시료관찰

- 반드시 200×에서 관찰하고 400×에서 관찰하지 말 것 ⇐ 균액이 400× 렌즈에 닿기 때문임

- 400×렌즈 관찰 요구시에는 반드시 커버글라스 덮은 다음 관찰

18) 결과판정

◦ 암시야현미경 하에서 응집상태를 검경하여

+1, +2, +3, +4로 기록

+1 : 25% 응집             +3 : 75% 응집

+2 : 50% 응집             +4 : 100% 응집

◦ 양성 : 최종혈청희석배수 100배에서 +2, 또는 그 이상 응집시

◦ 음성 : 최종혈청희석배수 100배에서 +2미만 응집시

PBS, pH 7.2 제조법

◦ Sodium chloride(NaCl)	8g

◦ Sodium phosphate,diabasic,anhydrous(Na2HPO4)	1.15g

=Di-sodium hydrogenphosphate

◦ Potassium chloride(KCl)	0.20g

◦ Potassium dihydrogenphosphate(KH2PO4)	0.20g

◦ D.W.	1000㎖

◦ 상기 시약을 증류수에서 완전 용해

◦ 121℃에서 15분간 멸균하여 실온에서 보관하면서 사용

소생식기캠필로박터감염증 Bovine Genital Campylobacteriosis
원인체동정	Agent Identification

A. 직접배양법 (Direct culture method)

1. 준비물

◦ 채취된 가검물(가검물이 채취된 면봉)	◦ 그람염색액

◦ 면양혈액 (탈섬화)	◦ 현미경

◦ Catalase 시약	◦ Oxidase 시약

◦ 페트리디쉬	◦ 혐기성 Jar

◦ Blood agar base No. 2

◦ Campylobacter growth supplement (Oxoid SR0232E)

◦ Campylobacter selective supplement (Oxoid SR0069)

◦ 표준균주	◦ Brucella broth base

◦ Campy pak(gas generating system)	◦ Yeast extract

◦ 배양기	◦ Sodium succinate

◦ 암시야현미경	◦ Calcium Chloride

◦ Nalidixic acid (30㎍ disk)	◦ Cephalothin (30㎍ disk)

◦ 항혈청

2. 선택배지제조 (Modified skirrow medium)

◦ Blood agar base No.2 를 정량하여 녹인 다음 121℃ 15분간 고압멸균

◦ 배지를 50℃ 정도 냉각시킨 다음 면양혈액을 5% 첨가 + Campylobacter  growth supplement (skirrow) 첨가 + Selective supplement 첨가

◦ 페트리디쉬에 분주

구분	내 용
Campylobacter growth supplement (CGS) Selective supplement 5% 면양혈액 배지 7% 면양혈액 배지	CGS 1병+멸균D.W 2㎖용해/배지500㎖당 1병 첨가 SS 1병+멸균D.W 2㎖용해/배지 500㎖당 1병 첨가 배지 500㎖당 25㎖ 첨가 배지 500㎖당 35㎖ 첨가

3. 7% 면양혈액+일정량의 Blood agar base No.2

※ 1, 2의 배지는 반드시 무균검사 실시

4. 수소(종모우)의 음경포피, 귀두 및 요도에서 채취되어 수송된 면봉을 가지고 선택배지에 도말 (반드시 표준균주도 시료와 동시에 배양)

5. 시료가 도말된 plate는 미호기성 조건 system에서 미호기조건 상태로 37℃에서 3일간 배양

※ 소 생식기캠필로박터증 배양을 위한 미호기성 조건 system이란?

⇒ 일정한 용기 내의 대기조건을 미호기성 상태(5～15% 산소, 5～10% 이산화탄소, 80～90% 질소)로 유지하기 위해 일정량의 산소를 제거하는 방법

※ 미호기성조건을 유지하기 위한 방법

[방법 1] Candle jar법 ⇒ 시료가 도말된 plate를 일정용기속에 담은 뒤 양초에 불을 붙인 다음 용기의 뚜껑을 닫은 후 양촛불이 꺼진 다음 37℃에서 3일간 배양

[방법 2] Campy pak법 ⇒ 시료가 도말된 plate를 일정용기 속에 담은 뒤 상품화된 Campy pak의 귀퉁이를 자른 다음 즉시 수돗물 10㎖를 첨가하여 용기의 뚜껑을 닫은 후 37℃에서 3일간 배양

6. 배양 3일후 plate를 검사하여 의심균주 선발

의심되는 집락 : 직경 1～3mm의 투명 또는 담황색

Catalase : +Ve

Oxidase : +Ve

7. 상기의 3개 항목검사가 일치되는 집락은 혈액배지에 도말하여 미호기조건상태 37℃에서 2～3일간 순수배양 시킨다.

8. 순수배양된 균에 대하여는 다음과 같은 검사를 실시하여 판정

시료 번호	Catalase 검사	Oxidase 검사	Gram 염색	암시야현미경 운동성	미호기 조건발육		호기조건 발육	약제 감수성		비고
					25℃	42℃		NA	CF
표준 균주	+	+	G-Ve, 나선상의 만곡형 간균, S자형태, 갈매기 날개모양	darting Corkscrew성의 운동성이 특징임	+	-	-	R	S

NA : Nalidixic acid (30㎍)

CF : Cephalothin (30㎍)

9. 의심집락의 검사결과가 상기 7번의 표준균주 성상과 일치될 시에는 항혈청 응집반응 검사로서 최종 동정

↑

검사종료 (가장 단시간의 경우 3일, 최종 동정시까지 8일 소요)

10. Campylobacter fetus subsp. venerealis 균의 배양, 보존

A. 배양 및 보존배지 (semisolid) 제조

◦ Brucella broth	2.8g

◦ Yeast extract	0.5g

◦ Sodium Succinate	1.2g

◦ Calcium Chloride	0.001g

◦ D.W.	100㎖

↓

상기 성분을 완전 녹임

↓

121℃ 15분간 멸균

↓

50℃로 냉각

↓

면양혈액 5㎖ 첨가 (5%)

↓

5부시험관에 5㎖씩 분주

↓

표준 및 의심균주(동정) 접종

↓

미호기조건에서 37℃ 3일배양

↓

배양된 균액을 멸균 Cryotube에 0.5㎖씩 분주

↓

멸균된 10% glycerol 0.5㎖ 첨가

↓

-60℃ 냉동고에 보관 (6개월～2년간 보존가능)

※ 주의 : 냉장보관 시에는 10일 이상 생존 불가능

B. Cryobank를 이용한 균주보존법 : 기타검사법 참고

말전염성자궁염 Contagious Equine Metritis
원인체동정	Agent Identification

1. 말전염성자궁염균의 선택배지 제조 (Timoney's medium)

◦ Eugon agar base를 정량하여 녹인 다음 121℃ 15분간 멸균

◦ 85℃정도 식혀서 5% 면양혈액 첨가하여 5분 정도 혼합 ⇦ 쵸콜렛색이 됨

◦ 항온수조에서 50～55℃ 정도로 배지를 식힌 다음 아래와 같이 제조된 항생제를 배지 ℓ당 각각 1㎖씩 첨가하여 완전히 혼합.

◦ 페트리디쉬(직경 8.5㎝)에 25㎖씩 분주

항생제 Stock 용액 제조법

항생제	용량	용매	희석액	비고
Amphotericin B Clindamycin Trimethoprim	0.05g 0.05g 0.01g	Dimethylformamide 1㎖ 멸균 D.W 1㎖ 0.05M HCl 10㎖	멸균 D.W 9㎖ 멸균 D.W 9㎖ --

* 상기 항생제 Stock 용액을 배지 ℓ당 1㎖씩 첨가시에는 항생제의 최종농도는Amphotericin B 및 Clindmycin은 5㎍/㎖, Trimethoprim은 1㎍/㎖가 됨.

* Streptomycin 첨가배지를 잘 사용하지 않는 이유?

2. 시료가 채취된 수송배지의 면봉을 가지고 선택배지에 도말

(반드시 표준균주도 시료와 동시에 배양)

처음 배지의 1/4은 면봉으로 조밀하게 도말

⇩

다음부터 백금이로 배지 전표면에 획선 도말

* 가장 양호한 CEM 분리 시료 :

Mare : Urethra, Clitoral fossa, Clitoral sinuses, Cervices, Vagina

Stallion : Prepuce, Anterior Urethra, Urethral fossa

* 가장 양호한 시료 수송배지 : Stuart's transport medium

* 채취된 CEM 면봉시료는 수송배지에 깊게 꽂은 후 냉장상태로 48시간 이내에 실험실로 운반 ⇦ 시료 도착 즉시 선택배양

3. 도말된 Plate는 5～10%의 CO2 인큐베이터에서 배양

4. 배양 2, 4, 6일째에 Plate 검사하여 의심균주 선발 (반드시 6일째까지 배양하여 최종음성 판정 가능) ⇦ 6일간 무조건 배양

의심되는 집락 : 배양 48시간 후 베이지색의 조그만 집락을 보이나 5일 후는 3～4㎜정도 됨

5. 의심되는 집락은 반드시 항생제가 첨가되지 않은 Chocolate 평판배지에서 48～72시간동안 CO2인큐베이터에서 순수배양 시킨다.

6. 순수배양된 균에 대하여는 다음과 같은 생화학적 검사를 아래의 순서대로 실시하여 표준균주의 성상과 다른 경우에는 음성 판정

시료번호	Catalase 검사	Oxidase 검사	그람염색성	호기배양 (혈액배지)	운동성	Phosphatase	비고
표준균주	양성	양성	G-구균, 단간균	비발육	음성	양성

7. 의심집락의 검사 결과가 6번의 표준균주와 일치될 때는 항혈청 응집반응 검사에 의하여 최종적으로 동정한다.

※ 말전염성자궁염 동정을 위한 항혈청 Kit

Kit 품명 : Mono-tayl

생산국가 및 회사 : 노르웨이, Bionor

주소 : Bionor A/S, P.O.Box 1868, N-3705 Skien, Norway

TEL : (47) 35538488

FAX : (47) 35537130

CEM 균주보관법

A. 미호기성 세균 보존법

1. 평판배지에 보존하고자 하는 균을 순수배양

2. 무균적으로 채취된 탈섬화된 면양혈액 5㎖ 정도를 세균이 순수배양된 평판에 첨가

3. 멸균된 유리구슬을 10～15개 첨가

4. 구슬을 움직여서 평판 위의 세균집락을 완전히 부유

5. 부유된 세균현탁액 200㎕씩을 멸균된 크라이오시험관에 분주

6. -70℃ 냉동고에 보관 (약 1년 정도 보관 가능)

※ 말전염성자궁염(CEM) 균주는 반드시 매주 1회씩 주기적으로 쵸콜렛 평판배지에 계대배양 (렙토항원과 같은 날 실시)

B. Cryobank를 이용한 세균보존법 : 기타검사법 참고

말전염성자궁염 Contagious Equine Metritis
카드응집반응법		Monotayl Card Test
			노르웨이 BIONOR

1. 의심되는 CEM 균주를 항생제가 첨가되지 않은 초콜릿 배지에서 24～48시간 순수 배양

2. 진단용 kit를 냉장고에서 꺼내어 실온에 30분간 방치

※ 진단액 kit는 반드시 2～8℃의 냉장고에서 보관하여야 하고, 절대로 냉동시키지 말아야 함

3. 진단액은 사용 전에 거품이 일어나지 않게끔 하면서 완전히 내용물을 혼합시킴

※ 내용물이 균질화 되지 않을 경우에는 사용할 수 없음

4. 진단액 kit에 포함되어 있는 Card에 반드시 test reagent를 한 방울 적하

5. 순수 배양된 CEM 의심균주를 Test reagent에서 30초정도 혼합하여 카드를 2～3회 기울여 준 다음 응집유무 판독

6. 5번의 검사에서 응집이 일어난 경우에는 동일한 시료를 반드시 Control reagent 한 방울 위에서 상기 5번과 같이 실시하여 최종판정

7. 최종판정

◦ 양성 : 의심시료가 Test reagent 검사에서 응집(양성)되고, Control reagent 검사에서 비응집(음성)되는 경우

◦ 음성 : 양성 이외의 경우에는 음성임.

※※ 기타사항은 Monotayl kit 설명서 참조 ※※

비저 Glanders
보체결합반응	Complement Fixation Test
				미국 NVSL

1. 각종 시약의 제조

A. Stock MgCl2(1M), CaCl2 (0.3M)용액

◦ Magnesium chloride, hexahydrate (MgCl2, 6H2O)	20.33g 또는

◦ Magnesium chloride, monohydrate (MgCl2, H2O)	9.5g

◦ Calcium chloride, dihydrate (CaCl2, 2H2O)	4.41g 또는

◦ Calcium chloride, monohydrate (CaCl2, H2O)	3.7g

◦ D.W.	100㎖

- 상기 시약을 D.W. 100㎖에 완전 용해시킨후 0.25㎛ 필터로 여과하여 냉장보관 하면서 사용한다.

B. Barbital sodium stock solution

◦ Sodium chloride (NaCl)	85g	42.5g

◦ Sodium 5.5～diethyl barbiturate	3.75g	1.875g

(Barbital sodium, C8H11N2O3Na)

◦ D.W.	1400㎖	700㎖

C. Barbital stock solution

◦ 5.5～diethyl barbituric aicd	5.75g	2.875g

(Barbital  C8H12N2O3)

◦ D.W.	500㎖	250㎖

Barbital stock solution(C.용액)은 D.W를 가열시키면서 완전 용해시킨다.

(Magnetic stirrer를 사용)

- 뜨거운 D.W에 완전히 용해시킬 것.

- 실온에서 냉각시킨 다음 사용

D. Concentrated barbital buffer solution (CBBS)

◦ B.의 stock solution 1400㎖(700㎖)에 C.의 stock solution 500㎖(250㎖)를 혼합한다.

◦ 상기 A.의 stock 용액을 5㎖(2.5㎖) 첨가하여 혼합

◦ 전체 용량이 2,000㎖(1,000㎖)이 되도록 증류수를 첨가한다.

◦ 라벨링하여 냉장고에 보관

E. BBS working solution

◦ 상기 D.의 CBBS용액 1 volume에 cold D.W. 4 volume을 혼합한다.

(1:4로 희석 ⇒ 5× 희석)

◦ 5× 희석용액을 냉장고에 보관 (희석용액은 매일 만들어 사용)

◦ 5× 희석용액의 pH는 7.3～7.4

※ 5× 희석액은 D.W. 보다는 멸균된 0.04%의 gelatin 용액이 좀 더 우수한 희석액으로 보고되어 있음

※ CFT의 working solution의 복잡한 제조방법을 피하기 위한 수단

⇒ Complement Fixation Test diluent tablet : Oxoid Tablets

(oxoid Code BR 16)을 사용하면 아주 쉽게

CFT 용액을 만듬 : Oxoid tablets

⇒ Commercial tablets

1ℓ 병에 D.W 500㎖

⇓

CFT tablets 10개를 첨가

⇓

열을 가하여 완전 용해시킨다.

⇓

Cooling 후 D.W를 가지고 1ℓ에 맞춘다.

⇓

4℃에 보관하면서 사용 (시험시마다 새로 만들어서 사용)

2. Collection and Storage of Sheep blood(면양혈구 채혈 및 보존)

Alsever's solution

◦ Glucose (C6H6O6)	20.5g

◦ Sodium chloride (NaCl)	4.2g

◦ Trisodium citrate, dihydrate(Na3C6H7․2H2O)	8.0g

◦ Citric acid (C6H8O7)	0.6g

◦ D. W  or  D.D.W	1000㎖

◦ 가열 없이 상기 시약을 완전 용해시킨다.

⇓

115℃에서 20분간 멸균 또는 0.25㎛ 필터로 여과한 후 냉장고에서 보관하면서 사용

3. Washing the Sheep RBC (면양혈구 세척)

◦ 멸균된 alsever's 용액 30㎖를 50㎖ 원심 관에 담는다. (3～4개 준비)

◦ 면양혈액을 무균 적으로 채취하여 즉시 alsever's 용액과 혼합하여 아주 천천히 섞은 다음 냉장고에 보관(Alsever's 용액 30㎖+면양혈액 15-20㎖)

◦ Alsever's 용액과 혼합된 면양혈액은 반드시 냉장고에서 5일 이상 정치한 후(혈구침전)사용한다.

※ 이와 같은 면양혈구는 약 1달 정도 사용 가능함.

(단, 상층액에 용혈현상이 육안적으로 관찰되지 않거나, 혈구의 오염이 의심되지 않으면 계속 사용)

◦ 정치된 혈액을 일회용 15㎖ 원심분리 관에 4㎖ 정도씩 3～4개씩 분주 (반드시 15㎖ 원심 관에 사용)하여 CFT 희석용액을 적당량(9～10㎖) 첨가하여 혼합한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 1회

◦ 모세피펫을 사용하여 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ CFT 희석용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 2회

◦ 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ 다시 CFT 희석용액을 첨가하여 혼합 후 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 3회

※ 3회 원심 후에도 상층 액이 지속적으로 용혈 시에는 혈구를 버리고 다른 batch 또는 다시 채혈하여 사용함. (alsever's 용액 점검)

◦ 상층 액 및 buffy coat층을 제거

◦ CFT 희석용액을 시험관에 15㎖씩 정도 첨가하여 잘 혼합

◦ 정확하게 1,000g에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층 액 제거

◦ 침전된 혈구를 사용하여 3% RBC 부유 액을 제조한다.

(필요시 요구되는 RBC의 부유 액 제조)

4. Standardization of the RBC Suspension (표준혈구 제조)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

◦ RBC 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심분리 하여 침전된 RBC 1㎖에 CFT 희석 액 49㎖를 첨가하면 2% RBC 부유 액이 된다.

⇒ 가장 쉬운 2% RBC 부유 액 제조법

[방법 2] 정확한 방법

◦ RBC의 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심 하여 침전된 RBC의 양이 얼마인지를 기록한다.

◦ 희석액을 사용하여 packed cell 양의 30배로 희석액을 첨가하여 골고루 희석한다.

◦ ELISA reader의 전원을 켜 놓는다.

◦ 작은 병에 상기의 희석용액 1㎖(300㎕)에 D.W 9㎖(2.7㎖)를 첨가하여 희석한다.

(1:10 희석)

◦ 96well ⊔자(평저)마이크로플레이트에 종으로 8개 well(duplicate)에 각각 100㎕씩 분주

◦ ELISA reader 540㎚ 필터에서 O.D치를 측정하여 16개 well의 평균 O.D치를 계산(Target O.D는 0.145)  ⇒  0.140～0.150

◦ 만약 16개 well의 O.D 평균값이 0.115 보다 높으면 다음 공식에 의거하여 혈구의 최종 희석 농도를 알아냄

O.D의 평균값(16개 well) × RBC 부유 액의 총용량	= 요구되는 최종 희석농도
0.145

※ 만약 O.D의 평균값(16개 well)이 0.255였고, RBC 부유액(30배 희석된 것) 용량이 60㎖라면 CFT 희석액을 얼마나 첨가하면 O.D의 수치가 0.145가 되는 sheep RBC의 농도를 얻을 수 있는가?

0.255×60		=		15.30	= 105.52㎖
0.145				0.145

상기 RBC 부유액 60㎖+희석액 45.52㎖를 첨가하여 희석하면 정확한 2% RBC

◦ 라벨링하여 4℃에 보관

5. Dilution of the Hemolysin (헤모라이신 희석)

(1:100 Stock 용액, 냉동고에 보관)

◦ Hemolysin 원액 1㎖+ 희석액 99㎖ (1:100 stock 용액) ～ 1㎖씩 에펜도르프 시험관에 분주하여 냉동보관

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
stock hemolysin (1:100배)	1㎖	1㎖
1:1000 hemolysin	-	-	시험관2번에서 2㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖
희 석 액	4㎖	9㎖	1㎖	1㎖	2㎖	4㎖	9㎖
Hemolysin 최종 희석 배수	500	1,000	1,500	2,000	3,000	5,000	10,000

※ 1:100 stock hemolysin dilution

VBD 99㎖ + 50% glycerinized hemolysin 1㎖

⇓

1㎖씩 소분하여 냉동고에 보관

6. Titration of the Hemolysin (헤모라이신 역가측정)

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
	(500×)	(1000×)	(1500×)	(2000×)	(3000×)	(5000×)	(10000×)
희석된 Hemolysin (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
3% Sheep RBC (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

◦ gently agitating

◦ 37℃에서 10분간 감작 (5분마다 약하게 혼합)

※ 1:250배 희석된 보체의 준비 ⇒ 원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖(1:10)

⇒ 희석액 7.2㎖+1:10 희석보체 0.3㎖(1:250×보체희석)↢ 최소한 20분간 냉장보관후사용(2시간 이내 사용), 1:200 및 1:300도 준비

※ 희석보체의 결정은 혈구를 70～80% 정도 용혈을 일으키는 양으로 희석하여 사용(희석보체 여러 농도의 실험으로 결정해야 함).

⇒ 200, 250, 300× 희석하여 아래 표처럼 실시하여 보체의 농도 결정

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6	7
Buffer (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
희석보체 (㎖) (4개 농도 희석)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
Hemolysin-RBC 희석액 (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ throughly mix

◦ 37℃ 항온수조에서 30분간 감작 (후반부 15분간은 gently shaking하면서 감작)

◦ 30분 감작후 cold 희석액 2㎖를 각각 시험관에 첨가한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 (용혈 안된 RBC는 침천)한 후 상층액의 100㎕를 ELISA reader의 540㎚ filter에서 O.D를 측정한다.

◦ 7개의 시험관 O.D 수치를 측정하여 아래 공식에 의거 계산된 용혈정도는 다음의 그래프에 표시하여 선을 연결한다.

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.145 (Target O.D)

◦ 연결된 선에 의거하여 본 실험에 사용될 Hemolysin 희석배수를 결정

Hemolysin 역가측정

용

혈

정

도

(%)

80

70

60

50

30

40

20

10000

5000

3000

2000

1500

1000

500000

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

시험관번호	1 (500×)		2 (1000×)	3 (1500×)	4 (2000×)			5 (3000×)	6 (5000×)	7 (10000×)
O.D치
		각 시험관의 O.D치×100					= 용혈정도 %
		0.145 (Target O.D)
용혈정도 %치

◦ 앞의 그림에서의 plateau 선은 1:1000배에서 시작(1000배에서 일직선상의 선이 나타남)

◦ 본 시험에 사용될 hemolysin 희석배수는 25% 보다 더 강한 배수 사용(약 750배)

Hemolytic sensitized cell 제조법

Titration된 hemolysin (1:100) stock을 가지고 상기의 800×로 희석하여 동량의 2% sheep RBC를 첨가하여 항온수조에서 30분간 감작한 후 사용

(5분마다 혼합하여 준다)

♣ Hemolysin의 역가측정은 크게 중요하지 않으나 역가측정의 시험 검사가 끝난 후의 계산에서 hemolysin의 희석배수가 500배 이하일시에는 사용하지 말고 역가 측정을 다시 할 것.

7. Titration of Complement (보체역가 측정)

◦ 3set의 희석보체 준비 (1:400, 1:500, 1:600)

원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖ (1:10배 희석)

⇒ 희석(1:10배)액 0.2㎖+희석액 9.8㎖(1:500배)

⇒ 1:500배 희석보체는 최소한 냉장고에 20분 방치 후 사용

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6
희석보체 (㎖)	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0	1.1
Buffer (㎖)	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1
H.S (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ Gently mixing

◦ Incubated in a water bath of 37℃ for 30minutes(15분에 한 번 정도 섞어줌)

◦ 30분 감작 후 cold 희석액 2㎖를 각각의 시험관에 첨가하여 3,000rpm에서 5분간 원심한 다음 상층액의 100㎕를 ELISA reader 540㎚ filter에서 O.D치를 측정한다.

◦ 만약 각 시험관의 O.D 수치를 측정하여 다음의 공식에 따라 계산하여 용혈정도의 그래프를 그린 다음 50% 용혈(1C'H50)에 해당하는 보체의 농도를 결정

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.145 (Target O.D)

※ 보체 및 hemolysin 역가 산정시 반드시 target O.D의 값이 같은 조건으로 나누어져야 함.

Calculation of the % of hemolysis in complement titration
Dose fo Complement	O.D	% Hemolysis (Y)	Y/(100-Y)
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1	0.05 0.06 0.07 0.08 0.10 0.11	34 41 49 55 71 76	34/66 = 0.52 41/59 = 0.70 49/51 = 0.96 55/45 = 1.22 71/29 = 2.45 76/24 = 3.17

보

체

농

도

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.1

0.1

0.4

0.6

0.8

1

1.4

1.6

1.8

2

4

6

8

×

×

0.76

×

×

y(100-y)

50% 용혈을 일으키는 보체역가 측정(1CH50)

※ 5.5C'H50의 계산법 (본 시험에 사용되는 보체의 희석)

- 전술한 도표 및 그래프에서 희석된 보체(1:400)에서 1C'H50의 O.D치가 0.76였다면, 5.5C'H50은 얼마인가?

보체의 역가 희석배수	=	보체의 역가 희석(X)
5.5C'H50		0.4

X =	160		=	38
	4.18

- 희석 되지 않고 보존된 보체원액을 38배로 희석하여 사용하면 5.5C'H50이 된다.

8. Antigen (항원)

◦ 희석항원을 매일 만들어 사용한다.

◦ 항원은 반드시 제조자 또는 회사가 정해준대로 검사에 필요한 양만 희석하여 사용할 것.

9. Inactivation of Sera (혈청 비동화)

◦ 항온수조에서 또는 인큐베이터에(뚜껑 닫은 다음 tape로 부착) 58℃ 35분동안 비동화.

(비동화는 반드시 희석하지 말고 혈청자체만 비동화 시킨 후 희석하여 실험에 들어 갈 것)

◦ Anti-complementary activity (ACA)

① 혈청속에는 자연적인 ACA가 있음 ⇐ 열처리에 의하여 파괴됨

② 세균의 감염시 ACA ⇐ 혈청을 고속원심분리 후에 사용 (8,000g×5분)

10. Main Test (본시험)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

A. 양성/음성 대조군 plate

◦ 비동화 처리한 양성/음성 대조군혈청을 준비한다.（대조군 혈청은 희석하지 않는다)

◦ 양성/음성 대조군 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 플레이트의 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ A1 well에 양성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ B1 well에 음성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

B.  Complement control plate

◦ CFT 희석용액 25㎕를 G10-12, H10-12 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 G9-10, H9-10 well에 분주한다.

◦ 두 번째 well(G10, H10)에서부터 이진 희석한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well(G9-12, H9-12 )에 분주한다.

<양성/음성 대조군 & Complement Control plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	1/2,048	1/4,096	1/8,192
A	P.S
B	N.S
C
D
E
F
G									Complement control
H

C. 검사혈청 plate

◦ 비동화 처리한  검사혈청을  CFT 희석용액으로 5배 희석한다.

◦ 검사 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 검사혈청 25㎕를 해당 well에 분주한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 전 well에 분주한다.

<검사혈청 plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	시료1	시료9
B	시료2	시료10
C	시료3
D	시료4
E	시료5
F	시료6
G	시료7
H	시료8

D. 플레이트를 37℃에서 1시간 반응시킨다. (gently shaking)

E. Haemolytic system 준비 : 배양을 마치기 20분전에 2% RBC와 동량의 적정희석 된     Hemolysin을 섞은 후 10분 간 감작 시킨다.

F. Haemolytic system 50㎕를 전 well에 분주한 후 37℃에서 45분간 반응시킨다.    (gently shaking)

G. 플레이트를 1,840g 4분 원심분리 후 결과를 판독한다.

[방법 2] End-point titration : 검사혈청에서 양성결과를 보이는 경우 실시

시험관번호 (96 well)	1	2	3	4	5	6	7	8
Dilution	비동화 혈청	1:2	1:4 A/C	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Serum (㎕)	50
Buffer (㎕)		25	25	25	25	25	25	25
Dilute (㎕)		25	25	25	25	25	25	25	25버림
Buffer (㎕)			25
Antigen (㎕)				25	25	25	25	25
Complement			25	25	25	25	25	25
		◦ Plate는 여러 겹으로 쌓으면 안 됨 ◦ 처음 1분간 Shaking ◦ incubate at 37℃ 1시간 배양 ◦ 배양을 마치기 20분 전에 2%RBC와 동량의 적정희석 된 Hemolysin을 섞은 후 10분간 감작하여 사용
H.S.			50	50	50	50	50	50	50
		◦ incubate at 37℃ 45분 ◦ 20분에 한번 Shaking ◦ 4℃ 에서 3-4시간 정치 또는 1840g 4분 원심후 판독

11. 보체결합반응에 대한 시약 대조

번호	대조 목적	VBD	항원	보체	감작 RBC	2% RBC	결과
1	Ag anticomplementary	.025	.025	.025	.05		0
2	Ag-hemolysin-hemolytic	.05	.025		.05		4
3	C' 5.5(C'H50) units	.05		.025	.05		0
4	C' 2.75(C'H50) units	.05		(.025)	.05		+/-
5	C' 2.75(C'H50) units w/Ag	.025	.025	(.025)	.05		+/-
6	Hemolysin-hemolytic	.075			.05		4
7	Saline-hemolytic	.10				.025	4
8	C'-hemolytic	.075		.025		.025	4
9	Ag-hemolytic	.075	.025			.025	4

12. 판정기준

Percent Hemolysis	판 독	결 과
0%	4+	양성
25%	3+	의심
50%	2+	의심
75%	1+	의심
Few cells remaining	Trace	음성
100%	음성	음성

말파라티푸스 Equine paratyphoid
평판응집반응법	Plate agglutination Test
			일본 치바현 혈청연구소

1. 생리식염수(0.85g/100㎖)를 제조하여 121℃ 15분간 멸균

2. 가검혈청을 생리식역수에 10배 희석

가검혈청 25㎕ + 생리식염수 225㎕

Microplate 또는 적정용기에서 희석

3. 10배 희석된 가검혈청을 부루세라평판 검사용의 유리판에다가 순서대로 50㎕, 30㎕, 20㎕, 10㎕씩을 분주한다.

4. 진단액(항원)을 각각의 시료위에 50㎕씩 첨가하여 완전히 균질화 시킨다.

5. 15분간 plate의 방치후 최종판정

판정기준	10배 가검혈청
	50㎕	30㎕	20㎕	10㎕
음 성	- ±	- -	- -	- -
의양성	+ +	- +	- -	- -
양 성	+ +	+ +	+ +	- +

<주의사항>

- 검사시의 온도는 15~20℃가 되어야 한다.

- 진단액은 사용 전 충분히 흔들어 줄 것.

- 변질된 진단액은 사용치 말 것.

- 진단은 2~5℃ 냉암소에 보관

- 유효기간은 제조일로부터 1년간임

말파라티푸스 Equine paratyphoid
시험관응집반응법	Tube agglutination Test
			일본 치바현 혈청연구소

1. 항원희석용으로 사용되는 생리식염수 완충액을 제조하여 멸균.

NaCl 0.85g + 100㎖ D.W.

2. 시험관 검사용으로 사용되는 진단액(항원)은 상기 희석액에다 15배 희석하여 사용

Plate 용 진단액 1㎖ + 생리식염수 14㎖

3. 가검혈청 시료를 10배부터 1,280배까지 4부 시험관에 아래와 같이 계단 희석.

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7	8		대조
식염수(ml) 가검혈청(ml)	0.9 0.1	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5 0.5	0.5	식염수 0.5ml
혈청희석배수	▲10	20	40	80	160	320	640	1280		-
15x희석된 항원 (ml) 첨가	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5		0.5ml
최종혈청희석배수	20	40	80	160	320	640	1280	2560		음성 대조

4. 완전 혼합한 다음 50℃ 인큐베이터에서 2시간 감작

5. 4℃ 냉장고 O/N 다음 최종 판정

최종혈청희석배수	20	40	80	160	320	640	1280	2560
양 성	+++	+++	+++	+++	+++	++	+	-
의양성	+++	+++	+++	+++	++	+	-	-
음 성	+++	+++	+++	++	+	-	-	-

+++	: 상층부 완전 투명

++	:

+	:

-	: 시험관 바닥에 비응집 항원이 보이고 상층부가 완전 혼탁함.

※ 진단액 공급회사 : 일본 TEL : 0473.72.3571

탄저 Anthrax
원인체 동정	Agent Identification

1. 준비물

◦ 채취된 가검물(육 및 육제품, 혈액, 털, 가죽, 발진 및 수포의 삼출액 등)

◦ 면양혈액 (탈섬화)	◦ Nutrient 평판배지

◦ 혈액한천배지	◦ 현미경

◦ 그람염색액	◦ 페트리디쉬

◦ 배양기

◦ 탄저침강소혈청	◦ 멸균된 증류수 또는 생리식염수

◦ 기타

2. 혈액배지 제조

◦ Blood agar base 또는 Nutrient agar base를 정량하여 녹인다음 121℃에서 15분간 멸균

◦ 배지를 50℃ 정도 냉각시킨 다음 무균적으로 채취된 면양혈액을 5% 첨가

◦ 페트리디쉬에 15～20㎖ 정도 분주하여 굳힘

(반드시 완성된 혈액배지는 무균검사 실시후 사용)

3. 시료의 전처리

① 육 및 육제품, 각종 조직 등 : 육 및 육제품, 각종 조직 등의 시료는 무균적으로 다루어져야 하며, 시료는 약25g 정도를 잘게 썰어서 50㎖ 멸균 원심관에 담은후 멸균된 증류수를 30㎖ 정도 첨가(또는 Lab. blender의 무균백에 담은 후 멸균된 증류수를 30㎖ 정도 첨가하여 Lab. blender에서 균질)

고형시료 25g+멸균증류수 30㎖

60～70℃의 항온수조에서 시험관 30분간 방치

1,000～2,000g에서 20분 정도 원심분리 (3,000g에서 10분 가능)

상층액은 버리고 침전물을 도말배양용 시료로 사용

(침전물 반드시 멸균처리후 버림)

② 기타 가검시료 : 평판배지에 도말

4. 상기 ①침전물 또는 ②의 시료를 혈액평판배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양

5. 배양 24시간후 Plate를 검사하여 의심균주 선발

◦ 혈액배지상의 의심집락 : - α용혈 또는 비용혈 (β용혈집락은 버려짐)

- 집락의 가장자리가 불규칙하고 편평한 회백색의 축모상 또는 곰보유리모양집락의 4～5 mm 크기

6. 의심집락으로 판정되는 집락 3개 정도를 다시 혈액배지에 도말하여 37℃ 24시간 순수배양 시킴.

7. 순수배양된 균에 대하여는 다음과 같은 검사를 실시하여 판정

검사항목	용혈정도	집락	그람염색 ⋆	Catalase	운동성	TSI	페니실린 (10㎍/㎖) 첨가배지	아스코리검사	기니픽 접종 ⋆⋆
탄저균	α 또는 비용혈	회색, 4～5mm	G+, 아포형성 간균	+	-		비발육	+	폐사

⋆ 아포형성은 균체 중앙부위에 위치하고 운동성이 없고 β용혈 없는 것이 가장 큰 특징임.

⋆⋆ 의심집락을 nutrient 액체배지에서 37℃ 24시간 순수배양한 균액 0.5㎖를 Guinea pig 또는 마우스의 피하(subcutaneous)로 접종시에  48시간 이내에 폐사 할 경우 탄저균으로 확정됨.

탄저 Anthrax
아스콜리 검사법			Ascoli Test
				QIA

1. 실험재료 및 장비

1) 냉장고	2) 유발, 공이

3) 가위	4) 멸균 생리식염수

5) 시험관	6) 멸균된 석면 또는 여과지

7) 파스퇴르피펫	8) 듀람관

9) 듀람관 꽂이	10) 탄저침강소 혈청

11) 자불장치

2. 유사 탄저로 폐사한 가축의 비장, 간장, 털, 가축 또는 혈액의 1-2ｇ을 채취한다.

3. 가위로 잘게 썰은 후 멸균된 식염수를 5배 가한다

4. 시험관에 옮긴 후 끓는 물 속에서 약 20-30분간 가열한다.

5. 유수에 냉각시킨 후 멸균된 석면 또는 여과지로 여과한다.

6. 황색을 띤 투명한 반응원을 얻게 된다.

7. 듀람관 꽂이에 샘플 수량만큼 듀람관을 꽂는다.

8. 모세피펫을 사용하여 탄저 침강소 혈청을 듀람관에 50-100㎕정도 넣는다.

9. 같은 양의 반응원을 다른 모세피펫을 사용하여 시험관 벽을 통하여 섞이지 않도록 조용히 중층하여 실온에서 관찰한다 (거품이 생기지 않도록 할 것).

10. 판정 : 중층 후 즉시 또는 수분 내에 혈청과 반응원과의 접촉면에 백색의 혼탁윤이 생길 때 양성

돼지위축성비염 Atrophic Rhinitis
원인체 동정	Agent Identification

[1] Bordetella bronchiseptica 분리 및 동정법

1. 준비물

◦ 멸균된 면봉

◦ 수송배지 : Charcoal 수송배지 또는 기타 수송배지

(상품화된 배지에는 면봉도 준비되어져 있음)

◦ 선택배지 : G20f 배지

◦ 각종 항생물질 : Penicillin G, Gentamycine, fungizone, furaltadone

◦ API 20E Kit 또는 Vitek GNI 카드

◦ 항혈청

◦ 기타

2. Bordetella bronchiseptica 균의 분리를 위한 선택배지 제조(G 20f)

◦ Bactopeptone (Difco) ◦ Glucose ◦ Lactose ◦ Sodium Chloride (NaCl) ◦ Bromthymol blue ◦ Bacto agar ◦ D.W.	10g 5g 5g 2.5g 0.040g 7.5g 500㎖	20g 10g 10g 5g 0.080g 15g 1000㎖

◦ 상기 성분을 D.W.에 첨가하여 완전 용해한 다음 121℃에서 15분간 고압멸균

◦ 50℃ 정도로 냉각시킴

◦ 아래의 각종 Stock 항생제를 배지 ℓ당 PG, F, FT는 1㎖씩, GM은 0.5㎖씩 첨가하여 완전 혼합

항생제 Stock 용액제조법

항생제	용량	용매	희석액	배지 ㎖당 최종농도
Penicillin (PG) Gentamycin (GM) Fungizone (F) Furaltadone (FT)	0.5g 0.005g 0.05g 0.1g	- - Dimethylformamide 2㎖ Ethanol 2㎖	D.W. 5㎖ D.W. 5㎖ 3㎖ 3㎖	20㎍/㎖ 0.5㎍/㎖ 10㎍/㎖ 20㎍/㎖

◦ 완성된 배지는 제조한 날로부터 10일 이내에 사용하여야 함.

(항생제의 반감기 때문임)

3. 멸균된 면봉으로 돼지의 비강에서 swabbing하여 수송배지에 넣어서 실험실로 운반된 시료는 즉시 선택배지에 도말한다.

4. 도말된 plate는 37℃ 인큐베이터에서 24～48시간 배양하여 의심집락 선발(Blue색 집락)하여 아래와 같이 간이검사 실시

선택배지집락 형태	Oxidase	Catalase	그람염색성
Blue색	+ve	+ve	G-, Coccobacilli

5. 간이검사 결과 의심되는 집락은 37℃ 24～48시간 혈액배지에서 순수배양

6. 순수배양된 시료는 API 20E Kit 또는 Vitek GNI card로 검사하여 균동정 하여 판정

※※ 위축성 비염 검사시에는 반드시 Bordetella bronchiseptica 및 Pasteurella multocida 균의 배양이 동시에 이루어져야 함.

※※ 수출용 돼지의 위축성 비염 검사결과 상기 2종의 세균이 동정될 시에는 항혈청 응집검사 실시하지 않고서도 수출용 돼지에서 제외시켜야 함.

[2] Pasteurella spp. 분리 및 동정법

시료채취 (혈액, 각종 친화성 조직, 장기,비강 swabbing 등)

혈액배지에 무균적으로 직접 도말

37℃, 24～48시간 호기배양

의심되는 집락에 대한 순수배양

SS한천배지                                                혈액한천배지

37℃, 24시간 호기배양

SS배지 : No growth

혈액한천배지 : growth, 비용혈성

(단, P.hemolytica는 70%가량 용혈을 보이나, 계대배양시에는 비용혈)

① 현미경검사 : 그람염색 -ve, bacillus 또는 Coccobacillus

② Oxidase : +ve

③ Catalase : +ve

API 20E 또는 API 20NE Kit 검사                           Vitek 기기검사

Pasteurella multocida로 동정 (검사종료)

기타 Pasteurella spp.

생화학적 성상검사로 동정

추백리 Pullorum Disease
원인체 동정	Agent Identification

1. 실험실에 도착된 시료는 4℃에서 보관하면서 가능한 빨리 검사 실시.

2. 준비물

◦ 증균배지	◦ 멸균기

◦ 선택배지	◦ 현미경

◦ 배양기	◦ API 20E Kit 또는 Vitek GNI 카드

◦ 항혈청 (mono and poly group)	◦ 70% 알콜

◦ TSI/LIA 사면배지	◦ 기타

3. 선택증균 및 선택분리배지 제조

◦ 증균배지	◦ 선택분리배지

① Selenite cysteine broth              ① MacConkey agar

② Tetrathionate/brilliant green broth	② Brilliant green agar

③ Rappaport-Vassiliadis(RV) broth 등	③ Bismuth sulfite agar

④ Xylose lysine deoxycholate agar 등

※ 증균 및 선택배지의 제조는 사용설명서를 반드시 준수하여 제조

※ 증균배지는 상기 중에서 1종, 선택배지는 상기 중에서 2종을 선택하여 시료를 검사. (증균 및 선택배지는 여러 가지 사용이 가능하나, 되도록 상기의 제품을 사용)

4. 시료는 다음과 같이 처리하여 증균배양 실시

◦ 액체시료 : 원액 자체를 사용 (원액 1㎖ + 증균배지 9㎖)

◦ 고체시료(고기, 조직) : 시료 25g+ 증균배지 225㎖ (시료 5g+증균배지 45㎖)

◦ 종란(타조) : 70% 알콜에서 10∼20분간 침적 ⇒ 건조

⇓

멸균된 스파츄라 등으로 난각을 깸

⇓

증균배지 500㎖ + 난황 50㎖

⇓

멸균 면봉대로 균질화

5. 증균배지에 접종된 시료는 37℃ (권장온도 사용, RV broth의 경우 41.5℃) 에서 18∼24시간 배양

6. 증균배양액을 2∼3 loop 정도 취하여 2가지의 선택배지에 도말하여 37℃에서 24∼48시간 배양 (표준균주도 같이 배양하되, S. pullorum의 경우 매우 천천히 자라고 아주 작은 집락을 만들어서 48시간 배양을 권장함)

7. 의심되는 집락(5개정도 이상)을 선택배지 또는 비선택배지(nutrient 또는 blood agar)에서 37℃에서 20∼24시간 배양 순수 배양한다. 만일 24시간 배양으로 자라는게 약하면, 24시간 추가 배양을 실시한다.

※ 배지상에서의 살모넬라균 집락형태

◦ MacConkey agar: smooth and colourless colonies,

S.pullorum produces smaller colonies than other salmonllae

◦ BGA: low, convex, pale red, translucent colonies

S.pullorum produces smaller more pale colonies than other salmonellae

◦ XLD: S.pullorum grows sparsely as small red translucent colonies

◦ Nutrient agar and blood agar: smooth, translucent, slightly raised colonies

8. 순수배양된 의심집락은 생화학적(TSI, LIA, Urea agar등 이용), 항혈청을 이용한 혈청학적인 검사방법등을 통하여 최종 판정한다.

Biochemical investigation of Salmonella Pullorum and S. Gallinarum (OIE 2012)

※ API 20E Kit 또는 기타 다른 방법으로 살모넬라속균 확인

◦ API 20E	검사법 바인더 참고
◦ Vitek system
◦ Molecular test (PCR등)

추백리 Pullorum Disease
급속혈청응집반응법	Rapid Serum Agglutination Test
			녹십자/영국 VLA

1. 준비물

항원(한국미생물제조)

◦ 응집반응용 유리평판	◦ 마이크로피펫 및 팁

◦ 가검시료 (혈청)	◦ 탈지면

◦ 양성 및 음성대조혈청	◦ 유리봉(교반봉)

◦ 분시계	◦ 생리식염수

2. 필요한 양의 진단액 및 가검시료를 꺼내어 실온에 1시간 정도 방치

3. 가검시료를 유리판 위에 30㎕씩 적하

4. 응집반응용 진단액을 가검시료 옆(시료와 진단액이 섞이지 않도록)에 30㎕씩 적하 (동시에 25개 시료 이상 검사치 말 것)

5. 유리봉을 이용하여 가검시료와 진단액을 5회 정도 섞어준 뒤 곧바로 5～10초 동안 혼합 후 판정

6. 판정	양성   : 1분 이내에 응집괴 형성

의양성 : 1분～2분 이내 응집괴 형성

음성   : 2분 후에도 비응집(응집괴 비형성)

※※ 의양성인 경우에는 반드시 3～4주 재채혈하여 검사

※ 주의

◦ 검사전 진단액 사용설명서를 읽어 볼 것

◦ 검사전 진단액의 자가응집반응 유무 확인 할 것

(항원 30㎕ + 멸균식염수 30㎕ ⇒ 비응집)

◦ 가검혈청은 즉시 검사치 않을 경우에는 4℃에 보관하며, 절대 냉동시키지 말 것

추백리 Pullorum Disease
시험관응집반응법	Tube Agglutination Test
				미국 NVSL

1. 진단액 및 시약

항원 : Salmonella pullorum tube test 항원(NVSL reagent 28-P)

◦ 양성대조혈청 : NVSL reagent 28-H

◦ 음성대조혈청 : NVSL reagent 28-N

◦ 생리식염수(0.85%)

◦ 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수

2. 항원 : 항원은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수로 McFarland standard 0.75-1.0으로 조정하여 사용한다.

3. 대조혈청(양성 및 음성) 희석: 대조혈청은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수를 사용하여 1:25로 희석

4. 시료희석 : 시료는 멸균식염수를 사용하여 1:25로 희석

5. 스크린검사 : 13X 100mm test tube에 희석혈청 0.5ml과 희석항원 0.5ml을 넣은 뒤 37℃ 또는 50℃ 항온수조에서 20∼24시간 배양한 뒤 판독

⇒ 최종희석배수 : 1:50

6. 5과정에서 양성시료와 대조혈청은 2배 단계 희석하여 정확한 역가측정

7. 판정	양성 : 최종희석배수 1:50 이상에서 맑은 상층액과 더불어 하얀색 침전물 형성

음성 : 최종희석배수 1:50 미만에서 전체 같은 색도이며, 하얀색 침전물 없음

추백리 Pullorum Disease
미세응집반응법	Micro-Agglutination Test
				미국 NVSL

1. 진단액 및 시약

항원 : Salmonella pullorum stained microtiter 항원(NVSL reagent 28)

◦ 양성대조혈청 : NVSL reagent 28-H, 28-L

◦ 음성대조혈청 : NVSL reagent 28-N

◦ 생리식염수(0.85%)

◦ 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수

2. 항원 : 항원은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수로 1:13.5로 희석하여 사용한다.

3. 대조혈청(양성 및 음성) 희석: 대조혈청은 생리식염수를 사용하여 1:10으로 희석하여 사용

4. 시료희석 : 시료는 멸균식염수를 사용하여 1:10으로 희석하여 사용

5. 스크린검사 : ⋃자형 마이크로플레이트에 희석혈청 50㎕와 희석항원 50㎕을 넣은 뒤 플레이트는 실링하고 37℃에서 18~24시간 배양한 뒤 판독

최종희석배수 : 1:20

6. 5의 과정에서 양성시료와 대조혈청은 2배 단계희석하여 정확한 역가 측정

7. 판정	양성 : 최종희석배수 1:40 이상에서 응집반응이 보일시

음성 : 최종희석배수 1:40 미만에서 보라색 버튼이 생기며 플레이트를 기울이면 버튼모양이 흘러내림

※ 응집반응(agglutination)의 정의

- 세균, 적혈구, 세포와 같이 바이러스에 비해 모양이 큰 항원이 대응하는 항체와 반응하면 눈에 보이는 큰 응집괴를 보여주는 현상을 말하며, 이 때의 항원을 응집원(agglutinogen), 항체를 응집소(agglutinin)라고 한다.

닭마이코플라즈마병 Avian Mycoplasmosis
급속혈청응집반응법	Rapid Serum Agglutination Test
			QIA /미국 Intervet

1. 준비물

항원	◦ 마이크로피펫 및 팁

◦ 응집반응용 유리평판	◦ 탈지면

◦ 가검혈청	◦ 유리봉(교반봉)

◦ 양성 및 음성대조혈청	◦ 분시계

◦ 생리식염수

2. 필요한 양의 진단액 및 가검시료를 꺼내어 실온에 1시간 정도 방치

(검사는 20～25℃에서 실시)

3. 가검혈청을 유리판 위에 30㎕씩 적하

4. 응집반응용 진단액을 가검시료 옆(시료와 진단액이 섞이지 않도록)에 30㎕씩 적하 (동시에 25개시료 이상 검사치 말 것)

5. 유리봉을 이용하여 가검시료와 진단액을 5회정도 섞어준 뒤 곧바로 5～10초 동안 혼합 후 판정

6. 판정	양성   : 1분 이내에 응집괴 형성

의양성 : 1분～2분 이내 응집괴 형성

음성   : 2분 후에도 비응집(전혀 응집괴 비형성)

※※ 의양성인 경우에는 반드시 3～4주 후에 재 채혈하여 검사

※ 주의

◦ 검사전 진단액 사용설명서를 읽어 볼 것

◦ 검사전 진단액의 자가응집반응 유무 확인 할 것

(항원 30㎕ + 멸균식염수 30㎕ ⇒ 비응집)

◦ 가검혈청은 즉시 검사치 않을 경우에는 4℃ 보관하며, 절대 냉동시키지 말 것.

7. 응집을 보여주는 시료는 56℃에서 30분간 비동화시킨 다음 검사 실시하여 판정

8. 최종판정 전에는 반드시 M. synoviae 검사를 실시하여야 함.

(MG와 MS의 교차반응이 아주 높음)

닭마이코플라즈마병 Avian Mycoplasmosis
혈구응집억제반응법	Haemagglutination Inhibition Test
				QIA

1. 준비물

◦ 마이코플라즈마 갈리셉티쿰 항원

◦ 마이코플라즈마 갈리셉티쿰 양성 및 음성혈청

◦ 96well V형 마이크로플레이트

◦ 닭 적혈구	◦ 원심분리기

◦ PBS완충액	◦ 마이크로플레이트 씰러

◦ 항온수조	◦ 증류수제조기

◦ 수소이온농도측정기	◦ 고압증기멸균기

◦ 화학천칭	◦ 기타

2. 닭 적혈구 부유액의 준비

가. 0.5～1.0㎖의 Alsever's 용액이 들어있는 10㎖ 주사기에 23g의 주사바늘을 사용하여 심장천자 또는 경정맥 또는 익하 정맥으로부터 신선한 닭의 혈액을 채취한다.  바늘을 빼내고 신속하게 내용물을 약 5배의 양이되는 Alsever's 용액에 옮겨 담는다. (예: 10㎖ Alsever's 용액에 2㎖ 혈액)

나. 혼합물을 500g에 5분간 원심분리한다.

다. 상층액과 백혈구층을 가는 파이펫으로 제거한다.

라. 냉장된 PBS에 RBC를 재부유하고 나,다의 절차를 3회 반복 실시한다.

마. HA 또는 HI검사를 위하여 PBS에 RBC를 0.5%로 희석한다.

혈구 부유액은 4℃에 보관하여야 하며, 58시간 이내에 사용되어야 한다.

3. 혈구응집반응시험

검사항원에 대하여 아래와 같이 역가(titer)를 측정한다.

가. V자형 96 well microplate의 1번에서 11번까지의 well에 phoshate buffered saline(PBS)을 50㎕씩 분주한다.

(V-shaped plates의 혈구응집은 적혈구 buttons이 round bottom wells 보다 판독시에 더욱 선명하고 분명하다.)

나. A열의 1번 well에 검사대상 양성항원을 50㎕씩 분주한다.

다. A열의 1번에서 11번well까지 단계별로 배수 희석한다.(최종희석배수: 212)

라. 마지막 12번well에 PBS를 50㎕씩 분주한다.

마. 신선하게 준비된 0.5% 닭 적혈구(RBC) 부유액 50㎕씩 각 well에 주입 한다. (4주령의 닭으로부터의 채혈이 가장 용이하다. RBC 부유액은 사용할 때 58시간 이상 경과되지 아니한 것이어야 한다. 동일한 닭의 혈구가 사용되어야 하며, 혈구부유액은 자동응집여부에 대하여 확인되어야 한다.)

바. Microshaker 위에서 microplate를 30초간 진동한다.

사. 뚜껑을 덮고 4℃에서 30분간 방치한다. (control cells에 button 형성이 이루어지지 않았을 경우에 장시간 방치한다.)

아. Microplate를 기울여서 최종역가를 기록하며, 각 열에서 적혈구가 움직 이지 아니하는 마지막 well을 읽는다. (HA의 최종역가)

정확한 혈구응집을 확실하게 판별하는 것이 핵심이다.

자. 검사용 항원에 필요한 희석계수를 알려면 항원의 기히 정해진 역가를 검사하기 위하여 지정된 HA units의 지정된 숫자(이검사에서는 4HA units)로 나눈다.

예를 들면, 항원의 HA 역가가 256이고 검사를 위하여 4HA units가 필요한 경우 256÷4, 즉 64가 well당 대상 항원의 4HA Units를 제공하는데 필요한 희석배수이다.

4. 혈구응집억제반응시험

가. V-bottomed Microplate의 각 well에 PBS를 50㎕씩 주입한다.

나. A열의 1번 well과 2번 well(serum control)에 검사시료 혈청을 각 50㎕씩 주입한다.

다. B열의 1번 well에 이미 알고 있는 양성혈청을 50㎕씩 주입한다.

(Positive control)

라. C열의 1번 well에 SPF혈청(음성)을 50㎕씩 주입한다. (Negative control)

마. D열의 1번 well에 희석된 항원 50㎕를 주입한다. (Retitration of Antigen).

바. 각 열의 2번 well부터 12번째 well까지 단계희석 한다.

사. Serum control과 retitrated antigen이 주입된 well 이외의 각 well에 4HA units로 희석된 항원을 50㎕씩 주입한다.

아. Plate를 microshaker에 30초간 희석한 상온에서 30분간 정치시킨다.

자. Plate를 비스듬히 (약 45도 각도) 놓고 각 혈청의 최종역가를 판독하여 RBC buttons이 형성된 최고희석배수를 기록한다.(혈구 대조군의 혈구와 같은 비율로 혈구가 흘러내릴 때 응집억제가 일어난 것으로 본다)

차. Controls은 아래와 같이 판독되어야 한다.

1) 양성 : 완전한 Button형성(이미 알고 있는 역가에서)

2) 음성 : 완전한 응집형성(Button 형성 없음)

3) Retitrated antigen : 4번째 well까지 응집이 일어나야 하며, 나머지 wells 에서는 RBC buttons이 형성되어야 한다.

< 주의 >

이러한 controls(대조군)이 기대치로부터 한 개 well 이상으로 차이가 있는 경우 검사는 다시 실시되어야 한다.

✂ 비특이 반응

통상적으로 역가가 1/64 이하일 때 비특이 반응이 가끔 일어난다.

이러한 경우에 반응용 혈청시료는 Receptor Destroying Enzyme (RDE)으로 하루저녁동안 처리되어야 한다. 이러한 처리는 RDE (sellcome reagents Ltd)로 혈청시료를 1/5로 희석하여 하루 저녁 37℃에서 배양시킨다.  이 혼합물은 56℃에서 30분간 비동화 시킨다.  경험에 의하면 이러한 처리는 대부분의 비특이 HI역가를 대부분 제거한다.

이러한 처리 후에도 일부 혈청에서 비특이 HI역가가 지속되면 추가로 해당 가금군으로부터 추가로 채취된 IO 혈청시료에 대한 검사가 실시되어야 한다.

진단학적이 이루어지기 전에 가금군으로부터 가능한 모든 증거 임상증상, 병리 및 바이러스학적 소견 등이 고려되어야 한다.

닭마이코플라즈마병 Avian Mycoplasmosis
혈구응집억제반응법	Haemagglutination Inhibition Test
			SPAFAS

1. 준비물

o 0.85% Sodium chloride

o 닭 적혈구

o U-bottomed 96well microplate

o 항온수조

o 원심분리기

o 기타

2. 항원의 혈구응집 역가 측정

가. 각각의 HA 역가에 대해 duplicate로 시험한다.

나. 멀티채널 피펫으로 식염수 50㎕를 A부터 H열까지 분주한다.

다. 제일 마지막 1열은 control로 사용한다.

라. 첫 번째 well에 50㎕의 항원을 분주한다. (표 1.)

예) A1과 B1 well에 Avian Adenovirus Group Ⅲ (EDS-76) AF/Ⅰ,

C1과 D1 wlldpNewcastle Disease virus AF/Ⅰ 등

<표. 1>

TWO-FOLD DILUTIONS
A T I G E N S			2	4	8	16	32	64	128	256	512	1024	2048	4096
			1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	EDS	A
	EDS	B
	NDV	C
	NDV	D
	PMV2	E
	PMV2	F
		G
	CONTROL	H

마. 1번째 well부터 12번째 well까지 단계희석한다. (최종희석배수: 212)

바. 0.5% 닭적혈구 부유액을 50㎕씩 각 well에 분주한다.

사. 플레이트의 가장자리를 혈구가 골고루 분산되도록 가볍게 친다.

아. 실온에서 45분간 감작시킨다.

자. 감작 후, 항원 혈구응집 역가를 측정한다.

HA 역가는 완전혈구응집이 일어난 마지막 항원으로 나타난다.

(No red cell button).

<표. 2> 이 HA 역가는 1 HA unit와 같다.

Control well은 완전하게 형성된 botton들이 존재하거나 없는 것을 결정하는 시각적 참조가 된다. 만약 red cell botton이 control well에서 형성되지 않는다면, 실험은 무효이다.

<표. 2>

TWO-FOLD DILUTIONS
A T I G E N S			2	4	8	16	32	64	128	256	512	1024	2048	4096
			1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	EDS	A											●	●
	EDS	B											●	●
	NDV	C									●	●	●	●
	NDV	D									●	●	●	●
	PMV2	E								●	●	●	●	●
	PMV2	F								●	●	●	●	●
		G
	CONTROL	H	●	●	●	●	●	●	●	●	●	●	●	●

EDS (rows A & B) - HA Titer 1:1024

NDV (rows C & D) - HA Titer 1:256

PMV2 (rows E & F) - HA Titer 1:128

3. 시료 준비

가. 각 시험 혈청, 양성 및 음성 항혈청을 56℃에서 30～45분가량 비동화시킨다.

(보체 및 HI inhibitor 파괴)

나. 위의 혈청들을 10% 닭적혈구 부유액과 동량으로 마이크로튜브에 넣은 다음부드럽게 흔들어 실온에서 30분간 감작시킨다.

다. 비동화 후, 시료를 2500 RPM에서 5분간 원심분리한다.

최종 희석농도는 1:2  이다.

4. 항원 준비

* 8 Unit의 항원을 준비 (Newcastle Disease Virus에 대해서는 16 Unit).

(plate의 수 × 8) × 0.025 × 11 = 8 Unit의 항원(㎖)

a             b       c

a. 대조혈청을 포함한 시험 시료의 수

b. 각 well에 들어갈 8 Unit의 항원의 양(㎖)

c. 8 Unit의 항원을 넣을 각 열의 well 수

<예>  ( Avian Adenovirus group Ⅲ )

▶ 28개의 시료 (양성 및 음성 대조혈청 포함)

▶ 각 plates는 8개의 시료를 검사함

▶ 총 4개의 plates

가. (4×8) × 0.025 × 11 = 8.8㎖ 의 8 Unit 항원

일반적으로, 8Unit 항원의 2배의 양이 필요하다.

8.8 × 2 = 17.6㎖의 8 Unit 항원

표 2에서 Antigen Titer EDS = 1:102

나.	HA Titer	=	Volume of 8 Unit in 1㎖		(a)	1024	=	128	(c)
	Desired of HA Units				(b)	8

a. Antigen HA Titer (표 2)

b. 8 HA Units

c. 1㎖의 항원 안에서의 8 Unit의 항원의 양

이것은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

127㎖ Saline

+ 1㎖ EDS Antigen

128㎖ 8 Unit Antigen

그러나 이미 앞서 8 Unit 항원의 사용액이 17.6㎖으로 결정되었으므로(가.항 참조),

17.6	=	0.14
128

1㎖의 8 Unit 항원의 양으로 원하는 8 Unit 항원의 양을 나눈다.

그 결과는 전체 17.6㎖의 8 Unit 항원에서 필요한 희석하지 않은 EDS 항원의 양을 나타낸다.

다. 필요한 8 Unit 항원의 총 용량에서 희석되지 않은 항원의 양을 뺀다.

17.6 - 0.14 = 17.46㎖

라. 준비된 8 Unit 항원은 다음과 같다.

17.46㎖ Saline

+0.14㎖ Undiluted EDS Antigen

17.6㎖  8 Unit Antigen

5. HA Antigen Retitration

가. 준비된 8 Unit 항원은 실험을 하는 시점에서 HA unit activity를 입증하기위해서 역가를 재측정해야 한다. 이것은 보통 HI test를 실시할 때 동시에 행해진다. <표 3>이 plate set-up을 나타낸다.

<표. 3>

Place 0.500㎖ of Saline to each well.				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Two-Fold Dilu-tions	1/16	A
		1/8	B
		1/4	C
		1/2	D
		1	E
		2	F
		4	G
Place 0.100㎖ of 8 Unit Antigen		8	H
				EDS	EDS	NDV	NDV	PMV2	PMV2						Control wells
				8 Unit Antigens

나. 멀티채널피펫을 사용하여 saline 0.050㎖씩을 plate의 A well에서 G well까지 분주한다. (control well 포함)

※ Newcastle Disease Virus 검사 시에는 A well에서 H well까지 분주.

다. 8 Unit 항원을 0.100㎖씩 H well에 분주한다.

각각의 HA 항원 역가 재측정에는 Double set으로 시험된다. (표. 3)

※ Newcastle Disease Virus 검사 시에는 H well에 16 Unit의 항원 0.05㎖을 분주한다.

라. H well에서 시작하여 A well까지 항원(8 Unit)을 연속적으로 희석한 후 (two-fold), 마지막 0.05㎖은 버린다.

마. 0.5% chick red blood cell(crbc) 부유액을 0.050㎖씩 control well을 포함한 모든 well에 분주한다.

바. 혈구들이 well에서 잘 분산되도록 plate의 가장자리를 가볍게 두드린 후, 실온에서 약 45분간 감작시킨다.

사. 감작 후, plate를 판독한다. 표. 4는 예상 모식도를 나타낸 것이다.

<표. 4>

				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
		1/16	A	●	●	●	●	●	●						●
		1/8	B	●	●	●	●	●	●						●
		1/4	C	●	●	●	●	●	●						●
		1/2	D	●	●			●	●						●
		1	E					●	●						●
		2	F												●
		4	G												●
		8	H												●
				EDS	EDS	NDV	NDV	PMV2	PMV2						Control wells
				8 Unit Antigens

※ 만약 unit activity가 tow-fold에서 벗어난다면(1 HA Unit에서 한 단계 이하 혹은 이상), 다음과 같은 HI test의 가정이 세워질 수 있다.

- 만약 HA Unit activity가 1이 아닌 1/2로 나타난다면, HI titer는 한 단계의 test serum HI titers를 증가시킴으로써 수정시킬 수 있다(X2).

예) NDV - 1/2 Unit (표. 4)

Test serum HI Titers	Corrected HI Titers
10	20
40	80
5	10
320	640

- 만약 HA Unit activity가 1이 아닌 2로 나타난다면, HI titer는 한 단계의 test serum HI titers를 감소시킴으로써 수정시킬 수 있다(X0.5).

예) PMV2 - 2 Unit (표. 4)

Test serum HI Titers	Corrected HI Titers
10	5
320	160
40	20
640	320

- 만약 HA Unit activity가 예외적으로 범위에서 벗어난다면, HI test titers는 무효이며 Technical Sevices Manage에게 알려야 한다.

6. Hemagglutination-Inhibition Test

가. 양성 및 음성 혈청을 포함하여 모든 가검혈청을 검사하는데 필요한 plate의 수를 결정한다. (하나의 plate로 8개의 시료를 검사할 수 있다.)

나. 표. 5와 같이 plate를 셋팅한다.

<표. 5>

				□	1:5 Dilution of Test Serum
						TWO-FOLD DILUTIONS
				5	10	20	40	80	160	320	640	1280	2560	5120
				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	Plate
T E S T S A M P E S		1	A													No.
		2	B
		3	C
		4	D
		5	E
		6	F
	(-)	7	G
	(+)	8	H													Agent
									0.025㎖ Salines
			0.050㎖ 8 Units Antigen						0.025㎖ 8 Units Antigen

다. 1열의 각 well(A에서 H까지)에 Saline 0.080㎖씩 분주한 후, 각 가검혈청  0.020㎖씩을 더하여 1:5희석이 되게 한다.

라. 가검혈청의 수에 관계없이 양성 및 음성 혈청은 항상 끝에 오도록 한다.

마. Saline 0.025㎖씩을 plate의 3열에서 11열의 각 well에 분주한다(표. 5).

바. 8 Unit Antigen 0.050㎖씩을 2열의 각 well에 분주한다.

사. 8 Unit Antigen 0.025㎖씩을 3역에서 11열의 각 well에 분주한다.

아. 멀티채널피펫을 사용하여 1열에서 11열까지 0.050㎖씩 계단 희석한 다음, 마지막 0.050㎖은 버린다. (최종희석 농도는 1:5120)

자. 0.5% chick red blood cell 부유액을 0.050㎖씩 1열에서 11열의 각 well에 분주한다.

차. 혈구들이 well에서 잘 분산되도록 plate의 가장자리를 가볍게 두드린 후, 실온에서 약 45분간 감작시킨다.

카. 감작 후 plate를 약 70° 정도 기울여 running button이 형성된 최고 희석농도를 판독한다(표. 6).

<표. 6>

						TWO-FOLD DILUTIONS
				5	10	20	40	80	160	320	640	1280	2560	5120
				1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	Plate
T E S T S A M P E S		1	A	◀	◀	◀	◀	◀	◀							No.
		2	B	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀
		3	C	◀	◀	◀
		4	D	◀	◀	◀	◀	◀
		5	E	◀
		6	F	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀
	(-)	7	G	◀
	(+)	8	H	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀	◀				Agent

※ HI Results
1. 160	2. 640
3. 20	4. 80
5. 5	6. 2560
7. (-) 5	8. (+) 1280

가금티푸스 Fowl Typhoid
원인체 동정	Agent Identification
			QIA

1. 실험실에 도착된 시료는 4℃에서 보관하면서 가능한 빨리 검사 실시.

2. 준비물

◦ 증균배지	◦ 멸균기

◦ 선택배지	◦ 현미경

◦ 배양기	◦ API 20E Kit 또는 Vitek GNI 카드

◦ 항혈청 (mono and poly group)	◦ 70% 알콜

◦ TSI/LIA 사면배지	◦ 기타

3. 선택증균 및 선택분리배지 제조

◦ 증균배지	◦ 선택분리배지

① Selenite cysteine broth              ① MacConkey agar

② Tetrathionate/brilliant green broth	② Brilliant green agar

③ Rappaport-Vassiliadis(RV) broth 등	③ Bismuth sulfite agar

④ Xylose lysine deoxycholate agar 등

※ 증균 및 선택배지의 제조는 사용설명서를 반드시 준수하여 제조

※ 증균배지는 상기 중에서 1종, 선택배지는 상기 중에서 2종을 선택하여 시료를 검사. (증균 및 선택배지는 여러 가지 사용이 가능하나, 되도록 상기의 제품을 사용)

4. 시료는 다음과 같이 처리하여 증균배양 실시

◦ 액체시료 : 원액 자체를 사용 (원액 1㎖ + 증균배지 9㎖)

◦ 고체시료(고기, 조직) : 시료 25g+ 증균배지 225㎖ (시료 5g+증균배지 45㎖)

◦ 종란(타조) : 70% 알콜에서 10∼20분간 침적 ⇒ 건조

⇓

멸균된 스파츄라 등으로 난각을 깸

⇓

증균배지 500㎖ + 난황 50㎖

⇓

멸균 면봉대로 균질화

5. 증균배지에 접종된 시료는 37℃ (권장온도 사용, RV broth의 경우 41.5℃) 에서 18∼24시간 배양

6. 증균배양액을 2∼3 loop 정도 취하여 2가지의 선택배지에 도말하여 37℃에서 24∼48시간 배양 (표준균주도 같이 배양)

7. 의심되는 집락(5개정도 이상)을 선택배지와 비선택배지(nutrient 또는 blood agar)에서 37℃에서 20∼24시간 배양 순수 배양한다. 만일 24시간 배양으로 자라는게 약하면, 24시간 추가 배양을 실시한다.

※ 배지상에서의 살모넬라균 집락형태

◦ MacConkey agar: smooth and colourless colonies

◦ BGA: low, convex, pale red, translucent colonies

◦ XLD: S.gallinarum colonies are small, dome-shaped, and may have a central black spot due to H2S production, but this reaction may be delayed or variable

◦ Nutrient agar and blood agar: smooth, translucent, glistening, domed colonies

8. 순수배양된 의심집락은 생화학적(TSI, LIA, Urea agar등 이용), 항혈청을 이용한 혈청학적인 검사방법등을 통하여 최종 판정한다.

Biochemical investigation of Salmonella Pullorum and S. Gallinarum (OIE 2012)

※ API 20E Kit 또는 기타 다른 방법으로 살모넬라속균 확인 가능

◦ API 20E	검사법 바인더 참고
◦ Vitek system
◦ Molecular test (PCR등)

가금티푸스 Fowl Typhoid
급속혈청응집반응법	Rapid Serum Agglutination Test
			녹십자 / 영국 VLA

1. 준비물

항원

◦ 응집반응용 유리평판	◦ 마이크로피펫 및 팁

◦ 가검시료 (전혈)	◦ 탈지면

◦ 양성 및 음성대조혈청	◦ 유리봉(교반봉)

◦ 분시계	◦ 생리식염수

2. 필요한 양의 진단액 및 가검시료를 꺼네어 실온에 1시간 정도 방치

3. 가검시료를 유리판 위에 30㎕씩 분주

4. 응집반응용 진단액을 가검시료 옆(시료와 진단액이 섞이지 않도록)에 30㎕씩 분주(동시에 25개 시료 이상 검사하지 말 것)

5. 유리봉을 이용하여 가검시료와 진단액을 5회 정도 섞어준 뒤 곧바로 5~10초 동안 혼합 후 판정

6. 판정   양성 : 1분 이내에 응집괴 형성

의양성 : 1~2분 이내에 응집괴 형성

음성 : 2분후에도 비응집(전혀 응집괴 형성안됨)

※주의

◦ 검사전 진단액 사용설명서를 읽어볼 것

◦ 검사전 진단액의 자가응집반응 유무 확인할 것

(항원 30㎕ + 멸균식염수 30㎕ ⇒  비응집)

◦ 가검혈청은 4℃보관 및 신속히 검사(72시간 이내)하며, 절대 냉동시키지 말 것

가금티푸스 Fowl Typhoid
시험관응집반응법	Tube Agglutination Test
				미국 Intervet

1. 진단액 및 시약

항원 : Salmonella gallinarum tube test 항원

◦ 양성대조혈청 : NVSL reagent 28-H

◦ 음성대조혈청 : NVSL reagent 28-N

◦ 생리식염수(0.85%)

◦ 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수

2. 항원 : 항원은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수로 McFarland standard 0.75-1.0으로 조정하여 사용한다.

3. 대조혈청(양성 및 음성) 희석: 대조혈청은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수를 사용하여 1:25로 희석

4. 시료희석 : 시료는 멸균식염수를 사용하여 1:25로 희석

5. 스크린검사 : 13X100mm test tube에 희석혈청 0.5ml과 희석항원 0.5ml을 넣은뒤 검사방법 37℃ 항온수조에서 적어도 20시간 배양한 뒤 판독

⇒  최종희석배수 : 1:50

6. 5과정에서 양성시료와 대조혈청은 2배 단계 희석하여 정확한 역가측정

7. 판정	양성 : 최종희석배수 1:50 이상에서 맑은 상층액과 더불어 하얀색 침전물  형성

음성 : 최종희석배수 1:50 미만에서 전체 같은 색도이며, 하얀색 침전물 없음

가금티푸스 Fowl Typhoid
미세응집반응법	Micro-Agglutination Test
				미국 NVSL

1. 진단액 및 시약

항원 : Salmonella gallinarum stained microtiter 항원

◦ 양성대조혈청 : NVSL reagent 28-H, 28-L

◦ 음성대조혈청 : NVSL reagent 28-N

◦ 생리식염수(0.85%)

◦ 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수

2. 항원 : 항원은 0.5% 페놀이 첨가된 생리식염수로 1:13.5로 희석하여 사용한다.

3. 대조혈청(양성 및 음성) 희석: 대조혈청은 생리식염수를 사용하여 1:10으로 희석하여 사용

4. 시료희석 : 시료는 멸균식염수를 사용하여 1:10으로 희석하여 사용

5. 스크린검사 : ⋃자형 마이크로플레이트에 희석혈청 100㎕와 희석항원 100㎕을 넣은 뒤 플레이트는 실링하고 37℃에서 18~24시간 또는 48시간 배양한 뒤 판독

⇒ 최종희석배수 : 1:20

6. 5의 과정에서 양성시료와 대조혈청은 2배 단계희석하여 정확한 역가 측정

7. 판정	양성 : 최종희석배수 1:40 이상에서 응집반응이 보일시

음성 : 최종희석배수 1:40 미만에서 보라색 버튼이 생기며 플레이트를 기울이면 버튼모양이 흘러내림

※ 응집반응(agglutination)의 정의

- 세균, 적혈구, 세포와 같이 바이러스에 비해 모양이 큰 항원이 대응하는 항체와 반응하면 눈에 보이는 큰 응집괴를 보여주는 현상을 말하며, 이 때의 항원을 응집원(agglutinogen), 항체를 응집소(agglutinin)라고 한다.

가금콜레라 Fowl cholera
원인체 동정	Agent Identification

1. 준비물

◦ 채취된 가검물(혈액, 각종 친화성 장기, 조직 또는 비강, 삼출물 swabbing 등)

◦ 혈액배지

◦ Salmonella-Shigella 배지(SS배지)

◦ 그람염색액

◦ Catalase 시약

◦ Oxidase 시약

◦ Vitek 기기 또는 API 20E, API 20NE Kit 등

◦ 현미경

◦ 기타

◦ 페트리디쉬

◦ 면양혈액

2. 혈액배지 제조

◦ Blood agar base를 일정량의 증류수에서 녹인 다음 고압증기멸균하여 50℃  정도로 식힘

◦ 면양혈액을 배지총량의 5∼7% 정도 첨가하여 배지와 완전히 혼합시킨다.

◦ 페트리디쉬에 분주하여 굳힌 다음 무균검사 및 배지표면을 말린 다음 사용

3. 채취된 가검시료 및 표준균주를 혈액배지에 직접 도말하여 37℃에서 18∼24 시간 호기배양

4. 표준균주와 대조하여 비슷한 의심집락 (비용혈성, Catalse +VE, Oxidase +VE)은 순수배양을 위하여 혈액배지에 도말배양 시킨다. (37℃ 18∼24시간)

5. 순수배양된 집락은 아래의 간이검사를 실시하여 표준균주의 성상과 다른 경우에는 음성 판정

시료번호	Catalase 검사	Oxidase검사	그람염색	용혈상태	비고
표준균주	+VE	+VE	그람 -VE, bacillus, Coccobacillus, 양단염색	-VE

6. 시료에서 분리된 의심집락이 상기 5번의 표준검사와 일치되는 경우에는 API  20E Kit 또는 Vitek GNI card 등으로 검사하여 균동정하여 판정

※ Pasteurella multocida균은 상기 6번의 검사법으로서 최종동정이 가능함.

⇐ 항혈청응집반응검사 불필요

7. Pasteurella multocida 균주 보관법

A. 배지보관법

◦ Stock culture agar	5g

◦ D.W.	100㎖

↓

상기 성분을 완전 녹임

↓

121℃ 15분간 멸균

↓

50℃로 냉각

↓

면양혈액 5㎖ 첨가 (5%)

↓

5부시험관에 5㎖씩 분주하여 사면배지 제조

↓

표준 및 의심균주(동정) 접종

↓

37℃ 24시간 배양

↓

-60℃ 냉동고 보관 (1개월～6개월 보존가능)

※ 주의 : 냉장보관시 3주 이상 생존 불가능

B. Cryobank를 이용한 균주보관법 : 기타검사법 참고

◦ -70℃에서 60개월간 보존

살모넬라감염증 Salmonellosis
원인체 동정	Agent Identification

1. 실험실에 도착된 시료는 4℃에서 보관하면서 가능한 빨리 검사 실시.

2. 준비물

◦ 증균배지	◦ 멸균기

◦ 선택배지	◦ 현미경

◦ 배양기	◦ API 20E Kit 또는 Vitek GNI 카드

◦ 항혈청 (mono and poly group)	◦ 70% 알콜

◦ TSI/LIA 사면배지	◦ 기타

3. 선택증균 및 선택분리배지 제조

◦ 증균배지	◦ 선택분리배지

〔선증균배지(Pre-enrichment media)〕  ① Brilliant green agar

① buffered peptone water             ② Xylose lysine deoxycholate agar

② universal pre-enrichment broth      ③ Bismuth sulfite agar

④ Chromogenic agars (Rambach agar 등)

〔증균배지(Enrichment media)〕

① Selenite cysteine broth

② Tetrathionate broth

③ Rappaport-Vassiliadis(RV) broth 등

※ 증균 및 선택배지의 제조는 사용설명서를 반드시 준수하여 제조

※ 증균배지(Pre-enrichment media, enrichment media)는 상기 배지 중에서 각 1종, 선택배지는 상기 중에서 2종을 선택하여 시료를 검사. (증균 및 선택배지는 여러 가지 사용이 가능하나, 되도록 상기의 제품을 사용)

4. 시료는 다음과 같이 처리하여 증균배양 실시

◦ 액체시료 : 원액 자체를 사용 (원액 1㎖ + 선증균배지 9㎖)

◦ 고체시료(고기, 조직) : 시료 25g + 선증균배지 225㎖ (시료 5g + 선증균배지 45㎖)

◦ 종란(타조) : 70% 알콜에서 10∼20분간 침적 ⇒ 건조

⇓

멸균된 스파츄라 등으로 난각을 깸

⇓

선증균배지 500㎖+난황 50㎖

⇓

멸균 면봉대로 균질화

5. 선증균배지에 접종된 시료는 37℃에서 16∼20시간 배양

( S.pullorum/gallinarum 은 선택배지에 직접 접종을 권장함)

6. 선증균배지에 접종된 시료는 증균배지에 접종하여 37℃(배지의 권장 온도 사용, RV broth의 경우 41.5℃)에서  24∼48시간 배양

7. 증균배양액을 2∼3 loop 정도 취하여 선택배지에 도말하여 37℃에서 24∼48시간 배양 (표준균주도 같이 배양)

※ Bismuth sulfite 배지 사용할 때에는 반드시 48시간까지 배양.

7. 의심되는 집락(5개정도 이상)을 선택배지와 비선택배지(nutrient 또는 blood agar)에서 37℃에서 20∼24시간 배양 순수 배양한다.

※ 배지상에서의 살모넬라균 집락형태

◦ BGA: red/pink with reddening of the media

◦ XLD: red with black centre (or occasionally translucent red in the case of H2S negative strains) colonies

◦ Rambach agar: crimson with pale borders or orange/colourless colonies

8. 순수배양된 의심집락은 생화학적, 혈청학적인 검사방법등을 통하여 최종 판정한다.

※ API 20E Kit 또는 기타 다른 방법으로 살모넬라속균 확인 가능

◦ API 20E	검사법 바인더 참고
◦ Vitek system

API 20E 검사법
	API 20E Enterobacteriaceae

1. 준비물

API 20E는 장내세균과 그 밖의 그람음성 간균을 동정하기 위한 것이다.

이것은 한 개의 집락을 가지고 23가지의 생화학적 실험을 할 수 있는 작은 시험관으로 되어 있다. API Profile Recognition System과 함께 사용하여 동정 할 수 있다. 이것에 의한 Samonella, Shigella 및 장염성 E.coli의 생화학적 동정은 혈청학적으로 확인되어야 한다.

임상검체에서 분리된 세균을 사용한 연구에서 API 20E는 Enterobacteriaceae의 균종동정을 위한 상품화된 Kit중에서 가장 완전한 것이고 반응이 분명하며, 판독과 해석이 용이하므로 한 검사실의 결과가 한결같게 나올 뿐만 아니라 세계 여러 나라의 결과가 한결같게 된다.

★★ 검체의 채취와 배양

모든 검체는 채취 후 곧 검사실로 운반되어야 하고, 될 수 있으면 빨리 배양해야 한다. 검체 처리 방법이 검사실마다 다를 수 있으나 적절한 배지와 배양 조건을 선택하는 것이 매우 중요하다.

★★ API 20E KIT의 내용물

- Gallery 25개	- 보고용지 25장

- 배양판 및 배양뚜껑 25개	- 설명서 및 세균동정표 1장

★★ API 20E KIT를 사용하기 위하여 검사실에서 준비 할 것

- 멸균된 pasteur pipette (1회용 주사기)	- Burner

- 배양기 (35～37℃)	- 아연(Zn)가루

- 냉장고 (2～8℃)	- MacConkey 배지

- Pen	- loop

- 멸균증류수(API#2011)	- rack

- API 20E 시약(API#2012)	- Mineral oil

- API OF Medium(API#5011)

★★ 시약 (API #2012)

Kovac 시약, oxidase 시약, 질산염환원시약, Voges-Proskauer 시약, ferric chloride 및 광유(mineral oil : API#7010)도 필요하다.

★★ 보관

- API 20E gallery는 2～8℃ 냉장고에 보관하면 18개월 이상 사용 할 수 있다.

- 배양판 및 배양뚜껑은 냉장고에 보관할 필요가 없다.

★★ 사용법

1) Strip 준비

가. 배양 tray와 뚜껑을 준비한다.

나. 뚜껑의 긴쪽 끝에 환자의 검체 번호를 기록한다.

다. 수돗물 5㎖를 배양 Tray에 넣어서 건조를 막는다.

라. API 20E Strip을 봉투에서 꺼내어 배양 Tray에 넣는다.

2) 세균부유액 준비

가. suspension medium (API #2011)을 쓸 때는 플라스틱 마개의 편편한 쪽을 엄지로 눌러서 꼭지를 부러뜨려서 연다.

* 주의 : 특별한 부유액을 써야 될 경우가 있다.

- Haemophilus는 혈청을 첨가한 멸균 증류수

- Vibrio Parahaemolyticus는 멸균 식염수

- Pasteurella는 0.1% yeast extract첨가 멸균 증류수

나. 멸균된 Pasteur파이펫(백금이나 멸균된 applicator stick도 쓸 수 있다)로 배지위에 잘 분리된 집락 1개를 채취하여 시험관 벽에 문질러서 부유액을 만들고 잘 섞는다.

다. 이와 동시에 OX 실험을 여과지(filter paper)에서 실행한다. 여과지에 실험코자 하는 colony를 수분을 함유시킨 여과지에 묻힌 후 OX 시약을 떨어뜨리면 반응이 나온다. 진한 자주색이 나오면 양성반응이다.

3) Strip 접종

API 20E에는 20개의 소시험관으로 구성되어 있고, 각 소시험관은 Tube와 cupule 부분으로 되어 있다.

가. Pasteur 파이펫으로 접종한다.

나. API 20E 배양 Tray를 기울이고 파이펫 끝을 cupule의 벽에 대고 소시험 tube 부분을 채운다.

다.

CIT

,

VP

와

GEL

소시험관은 Tube와 cupule부까지 채운다.

라. 접종이 끝난후 ADH, LDC, ODC와 URE H2S 소시험관에는 Mineral oil을 채운다.

4) 배양

접종 후 Tray에 플라스틱 뚜껑을 덮고 35～37℃ 배양기에 18～24시간 배양한다.

* 주의 : API 20E는 18～24시간 배양 후에 생화학적 반응을 판독해야 한다. 휴일로 인해 그렇게 할 수 없을 때는 18～24시간 배양 후에 꺼내어 2～8℃ 냉장고에 보관한다. 혹은 배양기에 넣는 대신 검사대 위에 놓아 실온에 둔다.

5) 판독

가. 37℃ 18～24시간 배양 후에 판독한다. 시약 첨가 없이 판독하는 시험의 결과를 먼저 기록한다. API 20E에 들어있는 생화학적 시험과 그 해석은 뒤에 수록되어 있다.

나. GLU 시험관이 음성(청색이나 녹색)이거나 양성반응이 2개 이하일 경우 시약을 넣지 않는다. 뒷장의 “Enterobacteriaceae와 기타 그람음성 간균 동정절차”를 참고한다.

다. GLU가 양성(노랑)반응 이거나 양성반응이 3개 이상이면 TDA와 VP에 먼저 시약을 넣는다. TDA반응은 즉시 나타나고 VP반응은 10분간 지난 뒤에 본다. IND시험관에 Kovac 혹은 James 시약을 넣는다. IND에 Kovac 시약을 넣은 후에 Nitrate 환원 시약을 GLU시험관에 넣는다.

* 주의 : 시약을 넣기 전에 GLU 시험관(청색이든 노랑이든)에 거품이 있는지 본다. Nitrate 환원과 indole 시험은 맨 나중에 해야 된다. 이 시험에서 생기는 가스는 다른 시험결과에 영향을 미치기 때문이다. 시약을 넣은 뒤에는 플라스틱 뚜껑을 덮어서는 안된다. 운동성 시험은 시약을 넣기 전 VP시험관에서 1백금이를 취해서 현적 표본을 만든다.

6) 세균의 동정

가. 첨부된 감별표를 써서 동정한다. 동정을 위해서는 여러 반응을 종합한 성적 전체를 고려해야 한다.

나. 균종이나 생물형(biotype)의 신속한 동정을 위해서는 API Index (API # 2013)을 이용한다. 이것은 21가지 생화학적 반응을 3개씩 묶고, 양성반응에 부여된 수치를 합하여 7자리의 숫자로 표시한다. 이 번호를 Index에서 찾아 균명을 알아낸다.

다. Profile Recognition System(PRS)도 이용할 수 있다.

(API # 2015)것은 Coder, Index 및 Analytical Profile Index로 되어 있다. 여러 기관의 수집 균주와 표준균주(Type cuture 및 neotype culture) 150,000개 이상을 써서 만들었기 때문에 대단히 정확한 통계학적 계산이 가능하고 따라서 희귀한 세균의 동정도 가능하다. PRS Computor  Service는 API제품에 의한 결과의 해석이 세계 어디에서나 같게 하고 있다.

7) 폐기

사용한 Ampule과 배양에 사용한 재료는 가압멸균, 소독 혹은 소독제에 담근 후 버려야 한다.

* 고려되어야 할 점

API 20E는 23가지의 생화학 시험을 쉽게 할 수 있다. 그 결과 해석은 미생물 검사에 경험이 있는 사람이 해야 한다. 때로는 검사자의 판단력, 지식, 추가시험이 동정에 필요하다. 그람음성 간균중의 일부는 추가시험을 필요로 한다. 다음 사항도 고려되어야 한다 ; 검체의 출처, 환자의 병력, 집락과 염색표본의 표는 표준균주와 여러 기관의 수집 균주로 만든다. API의 생화학적 반응표는 형태, 항혈청 검사, 항생제 감수성 양상 등.

API 감별Macromethod에 의한 표와 다를 수 있다. 예를 들면 API의 Urease시험은 Ferguson 처방이므로 흔히 쓰이고 있는 Christensen법 보다 감도가 낮다. Macromethod로 지연형 양성으로 표시된 반응은 Enterobacteriaceae의 API 표에는 대체로 음성인데 그것은 18～24시간 배양 결과이기 때문이다.

드물게 Klebsiella와 Proteus의 포도당 반응이 청록색으로 변한다. 이것은 위음성으로 기록해야 한다. 감별표도 그렇게 작성되었다.

항혈청이 있을 때에는 Salmonella, Shigella, 장염 E.coil는 그 항원성을 시험해야한다. 이 제품과 그 해석에 있어서 고려해야 될 추가 사항은 API 20E의 포장과 Analytical Profile Index의 서론에 들어있다.

* 정확성

API System의 정확성에 대해서는 프랑스의 Pasteure연구소, 스웨덴의 National Bacterilogy Laboratory, 미국의 CDC, 일본의 NIH가 양호하게 평가하였으며, 주요 논문은 참고문헌에 수록하였다.

API 20E는 Enterobacteriaceae와 그 밖의 그람음성 간균의 균종을 동정 할 수 있음이 여러 평가에서 밝혀졌다. 더욱이 각 균종의 생활형을 구별 할 수도 있다. Enterobacteriaceae의 생활형을 알아내면 치료의 성과나 병원감염의 존재를 알아낼 수 있다.

* 정도관리

API 20E에 쓰인 물질은 각 제조번호의 제품마다 정도관리가 되고 있다. 사용자가 정도관리를 원할 때에는 아래의 American Type Culture Collection의 표준균주를 사용한다.

- Klebsiella pneumoniae	NCTC  8172

- Enterobacter cloacae	ATCC 13047

- Proteus vulgaris	ATCC 13315

- Pseudomonas aerugionsa	ATCC 10145

장내세균 및 그람음성 간균 동정 술식

							2～3mm크기의 잘 분리된 집락 하나를 취한다.
집락하나를 따서 증류수에 부유시킨다.
									순수배양시험, 항혈청시험 혹은 추가시험을 위해 평판 이나 사면에 접종
API 20E에 접종
								포도당 반응을 관찰

－               포도당                ＋

시약을 넣지 않음

양성반응이 0～2가지             3이상 양성반응

35～37℃에                   주의 : 1

18～24시간배양        재

항

온

20E 시약 넣음

2 API OF에 접종하고

운동성검사                 일곱자리숫자 24시간용

주의 : 2

주1 : 양성반응이 한가지도 없으면 VP칸의 세균 한

35～37℃에	백금이를 혈액 한천에 접종하여 24시간 배양

36～48시간 배양	하고, 세균이 살아 있는지 본다.

주2 : MacConkey agar를 분리배양에 쓰지 않
았을 때는 MacConkey 배지에 접종한다.

20E에 시약 넣음

아홉자리숫자 - 48시간용

Catalase 검사법
	Catalase Test

1. 준비물

가. 평판 및 사면배지에 순수배양한 균주

나. 3% Catalase 시약

35% H2O2 1㎖ ＋ D.W. 10.66㎖

다. 슬라이드글라스

2. 방법

슬라이드글라스 위에 3% H2O2 1방울 적하한 다음 단독 균집락을 취하여 혼합 즉시 기포 발생 유무 판정

3. 판정

가. 양성 : 기포 형성

나. 음성 : 기포 비형성

4. 기타

H2O2는 부식성이 있으므로 피부 및 눈, 신체부위가 접촉되지 않도록 취급주의

Oxydase 검사법
	Oxydase Test

1. 준비물

가. 평판 및 사면배지에 18～24시간 순수 배양한 균주

나. 1% Oxidase 시약

Tetramethyl-P-phenylenediamine dihydrochloride 1g ＋ D.W. 100㎖

2. 방법

가. 직접 평판배지 검사법 : 평판배지에 자란 단독 균집락 위에 oxidase 시약을 2～3방울 첨가 후 1분후에 판정

나. 간접 paper strip 검사법 : 여과지 위에 oxidase 시약을 떨어뜨린 후, 백금이로 단독 균집락을 취하여 혼합 후 1분내에 판정

3. 판정

가. 양성 : deep blue color ⇒ dark

나. 음성 : 색깔 변화 없음.

4. 기타

Oxidase시약은 암 유발성 물질이므로 취급에 조심하고, 시약은 사용 직전에 만들어야 함.

Gram 염색법
	Gram Staining

1. 슬라이드글라스를 깨끗이 닦아 불꽃에 두세번 통과시킨 후 실험대 위에 놓는다.

2. 백금이를 화염 멸균한다.

3. 도말(smear)

가. 액상배지에 배양시 : 백금이로 떠낸 균액 한 방울을 슬라이드글라스 표면에 가능한한 넓게 원형으로 펴서 바른다.

나. 고체배지에 배양시 : 슬라이드글라스 위에 멸균 생리식염수 1 loop를 먼저 놓고 백금선으로 균을 소량 집균하여 슬라이드글라스 표면에 가능한한 얇고 넓게 바른다.

4. 건조(drying) : 도말표본을 공기 중에서 말린다.

5. 고정(fixation) : 말린 도말표본을 불꽃에 2～3회 통과시킨다.

(세균을 죽이고 또한 세균체의 단백질을 응고시켜 슬라이드에 균을 고정)

6. 염색(Difco 염색시약 set)

가. Crystal violet으로 1분간 염색

나. 수돗물로 수세

다. Gram's iodine으로 1분간 염색

라. 수돗물로 수세

마. 아세톤-알콜로 10～20초간 탈색

바. 수돗물로 수세

사. safranin으로 20초간 대조염색

아. 수돗물로 수세

자. 여과지로 도말표본의 습기를 제거한다.

7. 경검 : 염색한 도말표본위에 유침유(immersion oil) 한방울을 떨어뜨린 후, 1000×에서 표본관찰

Ziel-Neelsen's 염색법
	Acid-fast 염색법

1. 슬라이드글라스를 깨끗이 닦음.

2. 시료를 슬라이드글라스에 얇게 도말하고, 자연 상태에서 건조시킴.

3. 열을 가하여 고정.

4. Carbolfuchsin 염색액을 슬라이드위에 5㎖정도 첨가하여 3～5분간 가온.

※ 슬라이드글라스 위의 염색이 끓거나 마르지 않게끔 계속적으로 염색액을 첨가

Carbolfuchsin 염색액 제조법

A. Solution A

◦ Basic fuchsin(90% dry content)	0.3g

◦ 95% ethyl alcohol	10㎖

B. Solution B

◦ Phenol	5g

◦ D.W.	95㎖

C. A와 B를 혼합하여 3～4일간 방치한 다음 filter paper로 여과하여 사용

5. 수돗물로 간접 세척

6. Acid alcohol 용액으로 2분간 탈색한후 흐르는 물로 세척

Acid-alcohol 제조법

◦ Concentrated HCl	3㎖

◦ 95% ethyl alcohol	97㎖

7. Loeffler's alkaline methylene blue 용액에서 30～60초간 대조염색

Methylene blue 용액 제조법

◦ Methylene blue	0.3g

◦ D.W.	100㎖

8. 흐르는 물로 간접세척하고, 공기 중에서 건조

9. 현미경 100×(유침유)에서 슬라이드 검경하여 판정

결 과 판 정

◦ 항산성균 : 적색 (청색배경)

◦ 요네병 원인체는 적색간균으로 보이며, 한곳에서 Clumps를 형성한 것이 보임.

운동성 검사법
	Mobility Test

[방법 1] : 운동성 배지 이용법

1. 24시간 이상 배양되지 않은 순수 배양균을 검사에 사용

2. 운동성 검사용 배지 제조 (Semisolid 배지)

◦ Tryptose	10g	1g

◦ Sodium Chloride	5g	0.5g

◦ Bacto agar	5g	0.5g

◦ D.W.	1000㎖	100㎖

⇩

완전용해 (전자렌지)

⇩

4부시험관에 3㎖씩 분주

⇩

121℃ 15분간 멸균

⇩

Cooling하여 사용

* 반고체배지 : 배지성분+agar 0.3～0.5%가 첨가된 것.

3. 스트레이트 백금이를 사용하여 순수 배양된 집락을 상기 배지의 중앙에 따라서 바닥의 1/3정도까지 깊게 접종

4. 37℃에서 24시간 배양 후 관찰

◦ 운동성 세균 : 천자된 부위에서부터 균의 확산

◦ 비운동성 세균 : 천자된 부분에만 균이 자람

※ 운동성 배지로는 SIM 또는 MIO 배지를 사용하여도 좋지만 H2S 생성균주인 경우에는 운동성 관찰이 어렵기 때문에 상기의 배지가 가장 우수함.

[방법 2] : Hanging drop (현적표본) 검사법

◦ 준비물

- Waseline

- 커버글라스

- hole slide 글라스(슬라이드 중앙에 홈이 파져 있음)

1. 검사하고자 하는 순수균을 37℃에서 18시간 액체배지 배양

(평판배지의 집락인 경우에도 검사가능 ⇦ 멸균 식염수로 균부유액 제조)

2. 커버글라스 귀퉁이에 Waseline을 조금씩 바른다.

3. 커버글라스 중앙에 균부유액 1방울을 놓음.

4. hole slide 글라스 중앙의 홈부위가 균액이 있는 중앙에 오게 덮는다.

5. 커버글라스가 위로 오게끔 한다.

6. 현미경의 100～400배에서 운동성 관찰

◦ 운동성 세균 :

◦ 비운동성 세균 :

※ flagella, pilli를 가진 세균만이 운동성이 있음.

Cryobank를 이용한 세균보존법
	Cryobank

A. 저장방법

1. 평판배지에서 순수 배양된 세균집락을 cryobank 시험관의 beads내에 백금이를 사용하여 무균적으로 접종

2. 세균이 접종된 cryobank시험관을 Vortex를 이용하여 2～3회 혼합

3. 멸균된 피펫 등(마이크로피펫, 일회용 피펫)을 사용하여 cryobank 시험관내의 용액을 제거함

4. Cryotube에 라벨링 또는 마킹한 다음 cryobank box에 넣고 냉동고(-70℃)에서 저장

B. 회수방법

1. -70℃ 냉동고에서 배양하고자 하는 cryotube를 꺼내어 실온에 10～20분 정도 방치

2. 멸균된 백금이를 이용하여 cryotube 내에서 bead를 1～2개 정도 꺼냄

3. 꺼낸 bead를 적절한 증균배지에 넣거나 또는 평판배지(혈액배지 또는 적절한 선택배지)에 도말

4. 접종된 상기의 증균배지 또는 평판배지를 37℃ 또는 균의 특성에 맞게끔 배양

5. cryotube는 다시 -70℃ 냉동고의 cryobank box에 재차 보관

C. CRYOBANK란?

1. CRYOBANK는 화학적으로 처리된 beads와 cryogenic 보존용액으로 구성된 cryobial system이다.

2. 장점

◦ bacteria를 장기간 높은 viability로 보존 할 수 있는 경제적이고 편리한 system이다.

◦ 반복적인 subculture가 필요없고, culture collection이 수월하다.

◦ 균주를 최소의 공간에서 효율적으로 정리 및 보관이 가능하도록 package되어 있다.

◦ 까다로운 bacteria를 포함하여 적용 bacteria 범위가 넓다.

3. 적용범위 : Esherichia coli transformant를 포함한 일반 실험실에서 다루는 모든 bacteria clinical/brewing/food/dairy/water/veterinary/pharmaceutical/biotechnology

D. 보존기간

ORGANISM	MAXIMUM VIABILITY로 저장 가능한 기간(MONTH)		ORGANISM	MAXIMUM VIABILITY로 저장 가능한 기간(MONTH)
	-70℃ Storage	-20℃ Storage		-70℃ Storage	-20℃ Storage
Acinetobacter twoffii	22		Haemophilus spp.	>36	12
Actinobacillus equoii	24		Helicobacter spp.	48
Actinobacter spp.	36		Legionella spp.	24	12
Aerococcus spp.	12		Listeria spp.	24
Aeromonas hydrophila	60		Micrococcus spp.	36	24
Agrobacterium spp.	>36		Moraxella spp.	>36
Anaerobic cocci	60	36	Neisseria spp.	60	12
Bacillus spp.	36	60	Pasteurella spp.	60	12
Bacteroides spp.	60	12	Plesiomonas shigelloides	>36
Burdetella spp.	60	12	Pseudomonas spp.	>36
Campylobacter spp.	36		Rhodococcus equi	24
Candida spp.	12		Saccharomyces rouxil	30
Clavibacter spp.	36		Salmonella spp.	12	12
Clostriduim spp.	60	24	Shigella sonnei	30
Corynebacterium spp.	24	12	Staphylococcus spp.	60	12
Cryptococcus neoformans	12		Streptococcus spp.	60	12
Curtobacterium spp.	36		Treponema hyodysenteriae	18
Dermatophytes	24		Vibrio spp.	60	12
Enterobacteriaceae spp.	12	36	Xanthomonas spp.	30
Erwinia spp.	36		Xylophilus spp.	24
Erysipelothrix rbusiopathiae	14		Yersinia spp.	12	12
Escherichia coli	36
Gardnerella spp.	12

VITEK 기기 사용법
	세균자동동정기

1. 준비물

◦ Vitek transfer tube (product NO. V0405)

◦ 0.5% 멸균 Saline

◦ Vitek filling stands(product NO. V5204)

◦ Vitek fine tip marker

◦ 멸균된 12×75mm 투명시험관

◦ 백금이 및 램프

◦ 혈액배지 또는 기타 배지

◦ Oxidase test reagent

◦ Colorimeter (비색계)

◦ Vitek ID Card

◦ Diluent dispenser (옆꼭지 분리하여 멸균)

◦ 현미경

◦ 그람염색액

2. 검사하고자 하는 세균집락을 적절한 배지(혈액배지 등)에서 35～37℃ 18～24시간 순수배양(24시간 이상된 균은 사용치 말 것)

3. 순수배양된 집락을 그람염색하여 현미경으로 검경하여 그람염색성 구분

4. Oxidase 검사하여 Oxidase 양성 및 음성 구분

5. 상기 3, 4번의 결과를 바탕으로 사용하고자 하는 카드종류(GNI, GPI, BAC, ANI, NHI 등)를 결정한다.

ex) GNI Card를 예를 들어 설명(그람음성간균인 경우)

6. GNI 카드(product NO. V1306)를 꺼내서 Vitek fine tip marker로 균의 번호를 기입(반드시 카드 뒷면에 고딕체로서 기록)

7. 상기 4번의 결과에서 Oxidase 양성인 경우에만 사용하는 카드의 좌측상단 둥근 홈부위에 marker 가지고 검게 칠한다.

8. 라벨링한 멸균 투명시험관에 순수배양된 균을 0.5% 멸균 Saline(1.8㎖)으로 부유하여 Vitek filling stand에 놓는다.

9. Colorimeter를 사용하여 McFarland 표준 탁도에 아래의 ⑤와 같이 조정

Colorimeter 사용법

① Colorimeter는 충전식 사용(on press 상태에서 영점조절)

② 12×75mm 투명시험관에 0.5% 멸균 Saline을 1.8㎖ 정도 채운다.

③ 0.5% 식염수 시험관은 Well에 넣어 Colorimeter의 눈금이 100이 되게끔 on를 누르고 영점 조정

④ 상기 8의 부유된 균액 시험관을 Colorimeter의 well에 넣어 농도를 측정

⑤ 사용하는 카드의 종류에 따라서 반드시 아래와 같이 농도가 조정되어져야 함.

- Colorimeter의 Red 색깔 : GPI ,GPS, BAC (McFarland 0.5)

- Colorimeter의 Blue 색깔 : GNI, GNS, GNU, EPS, UID, UID-3

(McFarland 1.0)

- Colorimeter의 Green 색깔 : YBC (McFarland 2.0)

- Colorimeter의 Yellow 색깔 : ANI, NHI (McFarland 3.0)

10. Transfer tube를 (Product NO. V0405) 준비하여 transfer tube의 짧은부위를 test 카드의 inlet port에 끼운다.(Transfer tube는 구부리거나 꺾이지 않도록 함)

11. 카드를 Vitek filling stand에 두고(카드표시부위가 윗쪽 방향) transfer tube의 긴부위가 sample 속으로 들어가게 한다.

12. Filling Stand를 Vitek fillier 속에 넣음

13. Vitek System 전원공급

① AVR 전원공급

② UPS 전원공급 (I key press)

③ 컴퓨터 본체 전원공급

④ 모니터 전원공급

⑤ 프린터 전원공급 (Operate key press)

⑥ Vitek R/I Battery 및 AC Power on

14. Card에 균부유액을 Filling 시킨다.

① Filler On key를 press

② Cycle ready에 불이 들어오면

③ Fill key press

④ Cycle ready에 불이 꺼짐

⑤ Filling 끝나면

⑥ Cycle ready에 다시 불이 들어옴

⑦ Filler off key를 press

※ Card에 균액이 알맞게 채워지지 않는 경우에는 폐기

15. Transfer tube를 Card에서 빼어난 다음 blue sealer plug로 Card의 inlet port를 밀봉

16. 카드 내에 공기가 있을 시에는 카드를 세워서 툭툭치면 공기가 bubble well에 들어간다.

17. 카드를 Reader/incubator tray에 넣음(Card 글씨가 윗쪽)

(13번부터 16번까지 15분 이내에 완결시켜야 함)

18. Vitek Operation Control System On에 의하여 균동정 실시

① Login에 SUPV 입력

enter

② Password에 SUPV 입력

enter

③ 적색화면에서 O.K에 마우스 표시 두고 Click(살짝 누름)

④ Main menu 화면의 Vitek에 마우스 표시 두고 Click

⑤ Vitek Status가 화면에 표시

⑥ Reader에 마우스 표시 두고 Click

⑦ Status에 마우스 표시 두고 Click

⑧ Vitek reader Status 화면에서 Process on에 마우스 표시 두고 Click

⑨ O.K에 마우스 표시 두고 Click

⑩ 동정 완료후 print 될 때까지 기다림(검사종료시간 : 4～18시간)

19. Vitek Operation Control System Off 요구시

① Vitek status에서 Quit

② Main menu의 system선택

③ System maintenance선택

④ Stop system선택

⑤ Moniter 상의 화면이 사라질 때까지 기다림

⑥ R/I Vitek 전원 차단

⑦ 프린터 전원 차단

⑧ 모니터 및 컴퓨터 전원 차단

⑨ U.P.S. 전원 차단

⑩ A.V.R. 전원 차단

⋇ 균동정 도중에 결과를 보고 싶을 때

① Vitek Status 화면에서 Operations에 마우스 표시 두고 Click

② Print Results 화면에서 Operations에 마우스 표시 두고 Click

블루텅병 Bluetongue
경쟁적효소면역법				cELISA
		미국 IDEXX

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온에 꺼내놓는다.

나. 항원이 코팅되어있는 plate에 Dilution Buffer N.2를 80㎕씩 각 well에 분주한다.

다. 양성/음성 대조군과 샘플혈청을 해당 well에 20㎕씩 분주한 후 microplate shaker로 잘 섞는다

라. 실온(18～26℃)에서 45분간 반응시킨다.

마. Conjugate(wash solution으로 20배 희석)를 100㎕씩 분주 후 실온(18～26℃)에서 45분간 반응시킨다

바. 세척액으로 3회 세척한다.

사. TMB-substrate 100㎕씩 분주 후 실온에서 10분간 반응시킨다. 이때 직사광선은 피한다.

바. stop solution을 100㎕씩 분주한다.

사. ELISA reader기 450nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ 0.7 ≤ 음성대조군 OD ≤ 3.0

◦ Positive control의  S/N percentage는 20% 미만이어야 한다.

3. 결과 판독

◦ Negative : S/N percentage ≥ 80%

◦ Suspect : 70% < S/N percentage < 80%

◦ Positive : S/N percentage ≤ 70%

sample OD - mean negative control

S/P percenage(%) = ---------------------------------------------------------------------

mean positive cotnrol - mean negative control

블루텅병 Bluetongue
경쟁적효소면역법				cELISA
		미국 VMRD Inc.

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온에 꺼내놓는다.

나. 항원이 코팅되어있는 plate에 양성/음성 대조군과 샘플 혈청을 25㎕씩 2개 well에 분주한 뒤 실온(21～25℃)에서 15분간 반응시킨다.

다. Antibody-peroxidase conjugate를 모든 well에 25㎕씩 첨가한 후 실온에서 15분간 반응시킨다.

라. 3회 세척한다.

마. substrate 50㎕씩 분주 후 실온에서 10분간 반응시킨다. 이때 직사광선은 피한다.

바. stop solution을 50㎕씩 분주한다.

사. ELISA reader기 620, 630 or 650nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ 0.3 〈음성대조군 OD〈 2.0

◦ 양성대조군의 OD는 음성대조군 평균 OD의 50% 이하여야 한다.

3. 결과 판독

◦ 샘플혈청이 음성대조군 평균 OD의 50% 이하일 경우 양성

◦ 샘플혈청이 음성대조군 평균 OD의 50% 이상일 경우 음성

소백혈병 Bovine Viral Leukosis
면역확산법				AGID
			미국 NVSL

1. Agar 준비

1) 0.2M Tris buffer(pH7.2)를 준비한다.

Tris methylamine	24.23g

D.W. up to	1L, pH 7.2(2.5M HCL사용)

2) 0.2M Tris buffer(pH7.2)로 8.5% NaCl 용액을 준비한다.

NaCl	85g

Tris/HCL up to	1L

3) 2번 용액에 agarose 8g을 첨가(0.8~1.2% agarose용액)하고 완전히 녹을 때까지 끓인다.

4) Agarose용액이 55～60℃로 식을 때까지 기다린 후 직경 100㎜의 페트리디쉬에 15ml씩 붓는다.

5) 뚜껑을 살짝 덮은 후 실온(20～25℃)에서 1시간 가량 건조시킨다.

6) 한 플레이트 당 7개 well(지름 6.5mm, well간격 3mm)로 구성된 pattern 4개를 만든다(그림 참조).

2. 시약 및 가검혈청 분주

1) 중앙의 well에 항원을 분주한다.

2) 둘레 6개의 well 중 교대로 3개의 well에 항혈청을 분주한다.

3) 3개의 well에 가검혈청을 각각 분주한다.

4) 페트리디쉬를 실온(20～27℃)의 humid chamber에 반응시키면서 24, 48, 72시간에 관찰한다.

3. 결과판정 : 불빛 아래에서 먼저 대조혈청을 확인하고 가검혈청을 판독한다.

1) 음성 : 표준침강선이 항원과 항혈청사이에만 나타나고 항원과 가검혈청사이에는 보이지 않음

2) 양성 : 표준침강선이 항원과 가검혈청사이에 보임

3) 약양성 : 표준침강선이 항원을 향해 약간 구부러지거나 항원과 가검혈청사이에 완전한 침강선이 형성되도록 이어지지 않는 경우(재실험 필요)

4) 강양성 : 표준침강선이 가검혈청에 도달하기전에 항원을 향해 구부러져서 항원과 가검혈청 사이의 모호한 또는 넓은 선으로 이어진 경우(명확한 선을 확인하기 위해서는 가검혈청을 1:4 또는 1:8로 희석하여 재검사한다.)

5) 비특이적반응 : 대조침강선과 가검혈청 침강선이 교차

소백혈병 Bovine Viral Leukosis
효소면역법				ELISA
			미국 IDEXX

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온에 꺼내놓는다.

나. 항원이 코팅되어있는 plate에 sample diluent를 90㎕씩 각 well에 분주한다.

다. 양성/음성 대조군과 샘플혈청을 해당 well에 10㎕씩 분주한 후 microplate shaker로 잘 섞는다

라. 37℃에서 60분 또는 실온(18~26℃)에서 overnight(18-26 hours) 반응시킨다.

마. 세척액으로 3회 세척한다.

바. Conjugate를 100㎕씩 분주 후 37℃에서 60분 또는 실온(18~26℃)에서 overnight(18-26 hours) 반응시킨다.

사. 세척액으로 3회 세척한다.

아. TMB-substrate 100㎕씩 분주 후 실온에서 15분간 반응시킨다. 이때 직사광선은 피한다.

자. stop solution을 100㎕씩 분주한다.

차. ELISA reader기 450nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ Positive control OD〈 2.0

◦ Negative control OD〈 0.5

◦ Positive control OD - Negative control OD ≥ 0.3

3. 결과 판독

◦ Negative : S/P percentage < 30%

◦ Suspect : 30% ≤ S/P percentage < 40%

◦ Positive : S/N percentage ≥ 40%

sample OD

S/P percentage(%) = ------------------------------------

mean negative control

소백혈병 Bovine Viral Leukosis
효소면역법 SERELISA® BLV Ab Mono Indirect
		프랑스 SYNBIOTICS

o  예비단계(preliminary steps)

1) 대조군과 시료의 분배와 위치를 설정한다.

2) 혈청을 준비한다. (다수의 혈청을 혼합하여 사용하는 경우 10개 이내로 제한) 단일 또는 혼합 혈청을 희석액으로 1:10 희석후 사용한다. 대조혈청도 동일하게 준비한다.

I. 대조군과 시료의 분주

1. 양성대조군을 A1 & A2 well, 음성 대조군을 B1 & B2 well에 100㎕씩 분주한다.

2. 희석한 샘플혈청을 항원이 코팅되어있는 plate의 각 well에 100㎕씩 분주한다.

3. 플레이트를 37℃에서 1시간 배양한다.

4. 세척액으로 4회 세척한다.

Ⅱ. Conjugate 첨가

1. 희석한 Conjugate(Conjugate희석액으로  10배 희석)를 100㎕씩 각 well에 분주한다.

2. 37℃에서 1시간 배양한다.

3. 세척액으로 4회 세척한다.

Ⅲ. 발색

1. Well당 substrate 100㎕를 첨가한 후 빛을 차단한 상태에서 실온에서 30분 반응시킨다.

2. Well당 50㎕의 반응정지액을 첨가하고 450nm에서 OD치를 측정한다.

Ⅳ. 결과의 유효성

◦ Positive control mean OD ≥ 0.3

◦ Negative control mean OD < 0.5× Positive control mean OD

Ⅴ. 결과 판독

방법 1 : Index calculation

혼합 혈청의 판정기준 값 : -0.125 × (ODP)

단일 혈청의 양성판정 기준값은 0이며 음성판정 기준값은 -0.125 × (ODP)이다.

다음의 식을 이용하여 가검혈청의 지표값을 계산한다.

지표값(Sample index) = 0.5 × ( sample OD - ODP )

혼합 혈청 :

지표값 : 0.125×ODP  이상이면 양성

지표값  : 0.125×ODP  미만이면 음성

단일 혈청 :

지표값  0이상이면 양성

지표값 -0.125×ODP  미만이면 음성

지표값 -0.125×ODP과 0 사이면 의심

방법 2 : OD(optical density)의 분석

혼합혈청의 양성판단 기준값이자 단일혈청의 음성판단 기준값은 0.75×(ODP)이며  단일혈청의 양성판단 기준값은 (ODP)이다. 이를 표로 나타내면 다음과 같다.

	0.75×(ODP)		ODP
			시료 OD
단일혈청	-	+/-	+

	0.75×(ODP)
			시료 OD
혼합혈청	-	+

소백혈병 Bovine Viral Leukosis
효소면역법 SERELISA® BLV Ab BI Indirect
		프랑스 SYNBIOTICS

o  예비단계(preliminary steps)

1) 대조군과 시료의 분배와 위치를 설정한다.

2) 혈청을 준비한다. (다수의 혈청을 혼합하여 사용하는 경우 10개 이내로 제한) 단일 또는 혼합 혈청을 희석액으로 1:10 희석후 사용한다. 대조혈청도 동일하게 준비한다.

I. 대조군과 시료의 분주

1. 음성 대조군(N)을 A1에서 A4 well까지(A1 & A3 : 세포성 항원 ; A2& A4 ; 바이러스 항원)  양성 대조군(P)을 B1에서 B2 well까지 (B1 & B3 : 세포성 항원 ; B2 & B4 : 바이러스 항원)  100㎕를 분주한다.

2. 10배 희석된 샘플혈청을 두 개의 well(세포성 항원과 바이러스성 항원 well)에 100㎕씩 분주한다.

3. 플레이트를 37℃에서 1시간 배양한다.

4. 세척액으로 4회 세척한다.

Ⅱ. Conjugate 첨가

1. 희석한 Conjugate(Conjugate희석액으로  100배 희석)를 100㎕씩 각 well에 분주한다.

2. 37℃에서 1시간 배양한다.

3. 세척액으로 4회 세척한다.

Ⅲ. 발색

1. Well당 substrate 100㎕를 첨가한 후 빛을 차단한 상태에서 실온에서 30분 반응시킨다.

2. Well당 50㎕의 반응정지액을 첨가하고 450nm에서 OD치를 측정한다.

Ⅳ. 결과의 유효성

◦ 양성대조군의 △OD  ≥ 0.2이상

◦ 음성대조군의 △OD <  0.4 × △ODP

* △OD : BLV 항원well과 세포성 항원 well간의 OD값 차이

△ODP : 2개 양성 대조혈청 △OD의 평균

Ⅴ. 결과 판독

Anti bovine Leukosis virus gp51 항체의 존재는 바이어스성 Ag well과 세포성 Ag well간 OD 차이로 결정된다. 이 차이값은 양성대조군에서 획득된 역치와 비교된다.

방법 1 : Index calculation

혼합 혈청의 판정기준 값 : -0.0625  × (△ODP)

단일 혈청의 양성판정 기준값은 0이며 음성판정 기준값은 -0.0625  × (△ODP)이다.

다음의 식을 이용하여 가검혈청의 지표값을 계산한다.

지표값(Sample index) = 0.25  × (sample △ODP - △ODP )

혼합 혈청 :

지표값 -0.0625×△ODP  이상이면 양성

지표값 -0.0625×△ODP  미만이면 음성

단일 혈청 :

지표값  0이상이면 양성

지표값 -0.0625×△ODP  미만이면 음성

지표값 -0.0625×△ODP과 0 사이면 의심

방법 2 : OD(optical density)의 분석

혼합혈청의 양성판단 기준값이자 단일혈청의 음성판단 기준값은 0.75×(△ODP)이며  단일혈청의 양성판단 기준값은 (△ODP)이다. 이를 표로 나타내면 다음과 같다.

	0.75×(△ODP)		△ODP
			시료 OD
단일혈청	-	+/-	+

	0.75×(△ODP)
			시료 OD
혼합혈청	-	+

수포성 구내염 Vesicular Stomatitis
경쟁적효소면역법				cELISA
			미국 NVSL

1. 검사시약

- 수포성구내염 ELISA 항원(Indiana형 및 New Jersey형)

- 수포성구내염 진단용 마우스 항체 (Indiana형 및 New Jersey형)

- 수포성구내염 대조 양성혈청 (Indiana형 및 New Jersey형)

- 항 마우스 염소 면역글로불린 conjugate (KPL 50-76-01)

- 항원코팅용액 (0.05M carbonate/bicarbonate, pH 9.6)

Carbonate/bicarbonate capsule(Sigma C-3041) 한 알을 100ml 증류수에 용해

- 생리식염수(PBS buffer, 0.01M PBS)

Phosphate buffered saline tablet(Sigma P-4417) 한 개를 100ml 증류수에 용해

- 플레이트 블로킹 용액 (0.01M PBS + 5% skimmed milk solution)

ex) PBS buffer 100ml에 5g dry milk powder를 녹인다.

- 혈청희석액 (0.01M PBS + 1% skimmed milk solution)

ex) PBS buffer 100ml에 1g dry milk powder를 녹인다.

- Conjugate 희석액 (0.01M PBS + 1% skimmed milk solution + 10% normal goat serum)

ex) 혈청희석액 9ml에 normal goat serum(zymed 01-6201) 1ml

- 세척용액 (0.002M PBS + 0.05% Tween 20) : Sigma P-3563

- 발색제(TMB solution : KPL TMB one component 50-76-01)

- Stop solution (Aldrich 319570, 2M sulfuric acid)

2. 항원 코팅

- 수포성구내염 항원을 코팅용액으로 1:2,500(batch에 따라 조정될 수 있음) 희석하고 Nunc PolySorp ELISA plate에 well당 75ul씩 분주한다. 단 G11 및 G12 well (blank well)에는 항원 코팅용액만을 분주한다.

- 플레이트를 4℃에서 하룻밤 정치한다.

- 코팅된 플레이트는 -70℃에 60일간 보관이 가능하다.

3. Blocking

- 당일 코팅(37℃, 3~4시간)되었거나 동결보관 되었던 플레이트의 항원을 털어내고 흡습지위에서 세게 톡톡 두드려 남아있는 액체를 제거한다. 플레이트를 절대로 세척하지 않는다.

- 100㎕의 블로킹 용액을 모든 well에 분주한다.

- 플레이트를 25℃에서 30분 동안 감작시킨다.

- 블로킹 용액을 털어낸 후 세척액으로 플레이트를 3회 세척한다.

- 플레이트를 흡습지위에서 톡톡 털어 남아있는 물기를 제거한다.

4. 혈청분주

- 혈청희석액으로 가검혈청을 1:8로 희석(10㎕ 혈청 + 혈청희석액 70㎕)한 후 가검혈청당 2개 well씩 50㎕ 분주한다.

- 희석액 대조군 및 양성혈청 대조군도 복수의 well에 분주한다.

- 플레이트를 37℃에서 30분간 감작시킨다.

5. Ascites 분주

- 혈청 반응이 완료된 플레이트는 세척하지 말고 혈청희석액으로 1:2,500배 희석한 ascites fluid를 모든 well에 50㎕씩 분주한다.

ex) 혈청희석액 6ml에 ascites fluid 2.4㎕를 더해야 하지만 stock fluid를 10배 사전희석한 후 보관하여 1:250배 희석(혈청희석액 6ml에 ascites fluid 24㎕) 하는 것이 정확한 희석에 유리하다.

- 플레이트를 37℃에서 30분간 감작시킨다.

- 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 흡습지위에서 톡톡 털어 물기를 제거한다.

6. Conjugate 분주

- 10% normal goat serum이 포함된 혈청희석액으로 1:450배 희석한 goat anti- mouse HRP conjugate를 모든 well에 50㎕씩 분주한다.

ex) 혈청희석액 6ml에 conjugate 13㎕ 가한다.

- 플레이트를 37℃에서 30분간 감작시킨다.

- 세척액으로 플레이트를 3회 세척한 후 흡습지위에서 톡톡 털어 물기를 제거한다.

7. Substrate 및 stop solution 분주

- 플레이트의 모든 well에 TMB substrate solution을 50㎕씩 분주한다.

- 25℃에서 15~20분간 감작시킨다.

- 50㎕의 stop solution을 모든 well에 분주한다.

- 450nm에서 판독한다.

8. 결과 판독

- 100% 대조well(blank well)은 흡광도가 0.05 이하여야 하며, 0% 대조well(혈청희석액 적용well)은 흡광도가 1.0 이상이여야 한다. 경쟁백분율(percent inhibition)은 다음 공식으로 구한다.

PI = 100［(0% 대조well 흡광도 - 가검혈청 흡광도)/(0% 대조well 흡광도)］

- PI ≥ 50% 이면 양성

- PI 〈 50% 이면 음성

<플레이트 layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	1		9		17		25		33		41
B	2		10		18		26		34		42
C	3		11		19		27		35		43
D	4		12		20		28		36		44
E	5		13		21		29		37		45
F	6		14		22		30		38		DB
G	7		15		23		31		39		BL
G	8		16		24		32		40		Pos

DB : dilution buffer(혈청없음), BL : blank(항원없음), Pos : 양성혈청

수포성 구내염 Vesicular stomatitis
바이러스 중화시험				VN Test
			미국 NVSL

1. 시약

- 세포배양배지(희석액) : α-Minimum Essential Medium(α-MEM), 항생제 첨가

- 세척액 : Calcium-Magnesium free Phosphate buffered saline

- 항원 : VS-NJ, VS-IND strain (미국 NVSL도입 바이러스)

- 트립신 용액 : 0.5% Trypsin Versene

- 배양세포 : Vero cell 또는 IBRS-2 cell

- 소태아혈청 : Fetal Bovine serum(FBS)

- 세포배양용 96well plate

2. 검사방법

1) 검사할 가검혈청 및 대조혈청(양성 및 음성)을 56℃에서 30분간 비동화 한다.

2) 마이크로플레이트를 그림 1 및 2와 같이 나누어 표시한다.

3) cell control을 제외한 모든 well에 배지 25㎕를 분주한다.

cell control에는 50㎕ 씩 분주한다.

4) 각 복수 well의 처음과 두 번째 well에 비동화된 혈청 25㎕씩 분주한다.

5) 두 번째 well에서부터 이진 희석하여 나간다. Serum control은 희석하지 않는다.

6) 1,000TCID50/25㎕ 역가의 바이러스 부유액을 준비하여 Serum control, Cell control 및 virus back titration을 제외한 모든 well에 25㎕씩 분주한다.

7) 10-1, 10-2, 10-3 바이러스 희석액을 만들어 virus control로 사용한다.  각 희석배수당 8개의 well에 25㎕씩 분주한다.

8) 플레이트를 부드럽게 흔들어 혈청과 바이러스가 잘 섞이도록 한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간동안 감작시킨다.

9) 각 well에 3 X 105 cells/ml의 세포부유액(10% FBS)을 150㎕씩 분주한다.

10) 37℃, 5% CO2 인큐베이트에서 2~3일간 배양하면서 매일 관찰한다.

3. 판정

1) 3일간 배양하는 동안 날마다 CPE를 관찰한다.

2) 바이러스의 역가가 750-1,330TCID50/25㎕이어야 한다.

3) Serum control에는 CPE가 보이지 않아야 한다.

4) Virus가 첨가된 well에서 CPE가 100% 억제되고 해당 well의 monolayer가 형태적으로 대조군의 well과 비교하여 이상이 없을 때 해당 well의 최고 혈청희석 배수의 역수를 중화항체가로 표시하며 항체가가 1:32 이상이면 양성으로 판정한다.

<SAMPLE PLATE>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	S.C	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	S.C	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64
A	1	1	1	1	1	1	5	5	5	5	5	5
B	1	1	1	1	1	1	5	5	5	5	5	5
C	2	2	2	2	2	2	6	6	6	6	6	6
D	2	2	2	2	2	2	6	6	6	6	6	6
E	3	3	3	3	3	3	7	7	7	7	7	7
F	3	3	3	3	3	3	7	7	7	7	7	7
G	4	4	4	4	4	4	8	8	8	8	8	8
H	4	4	4	4	4	4	8	8	8	8	8	8

<CONTROL PALATE>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	S.C	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	S.C	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64
A	P.S
B
C	N.S
D
E	1000 TCID		100 TCID		10 TCID		1 TCID		0.1 TCID		cell control
F
G
H

말전염성빈혈 Equine Infectious Anaemia
				면역확산법 AGID
		SYNBIOTICS, VMRD, IDEXX

1. Agar 준비

1) Borate buffer 준비

NaOH	2g

H3BO3	9g

D.W. up to	1L

pH 8.6±0.2

2) Borate buffer로 1% agarose용액을 만들어 완전히 녹을 때까지 끓인다.

3) Agarose 용액이 55～60℃로 식을 때까지 기다린 후 직경 100㎜의 페트리디쉬에15㎖ 씩 붓는다.

4) 뚜껑을 살짝 덮은 후 실온(20～25℃)에서 1시간 가량 건조시킨다.

5) 한 플레이트당 7개 well로 구성된 pattern 4개를 만든다(그림 참조).

6) 진공펌프를 사용하여 well내의 gel을 완전히 제거한다.

2. 시약 및 가검혈청 분주

1) 중앙의 well에 항원을 분주한다.

2) 둘레 6개의 well 중 교대로 3개의 well에 항혈청을 분주한다.

3) 3개의 well에 가검혈청을 각각 분주한다.

4) 페트리디쉬를 dry chamber에 넣어 뚜껑을 덮고 실온(20～27℃)에서 24～72시간동안 감작시키면서 관찰한다.

3. 결과판정 : 불빛 아래에서 먼저 대조혈청을 확인하고 가검혈청을 판독한다.

1) 음성 : 표준침강선이 항원과 항혈청사이에만 나타나고 항원과 가검혈청사이에는 보이지 않음

2) 양  성 : 표준침강선이 항원과 가검혈청사이에 보임

3) 약양성 : 표준침강선이 항원을 향해 약간 구부러지거나 항원과 가검혈청사이에 완전한 침강선이 형성되도록 이어지지 않는 경우 (재실험 필요)

4) 강양성 : 표준침강선이 가검혈청에 도달하기전에 항원을 향해 구부러져서 항원과 가검혈청사이의 모호한 또는 넓은 선으로 이어진 경우(명확한 선을 확인하기 위해서는 가검혈청을 1:4 또는 1:8로 희석하여 재검사한다.)

5) 비특이적반응 : 대조침강선과 가검혈청침강선이 교차

말전염성빈혈 AGID pattern

Ab

Ab

A

Ag

B

C

Ab

결과 판정

Ab : 표준 혈청 (양성대조)

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

Ab

Ab

A

Ag

Ab

B

C

부분양성시료

양성시료

음성시료

말전염성동맥염 Equine Viral Arteritis
바이러스중화시험				VN Test
			미국 NVSL

Cell : RK-13

virus : EVA virus Bucyrus strain

medium : 10% FBS 및 항생제 첨가된 α-MEM

1. 검사방법

1) 가검혈청 및 대조혈청(양성 NVSL 370-EDV 및 음성 NVSL 372-EDV)을 56℃에서 30분간 비동화한다.

2) 마이크로플레이트를 그림 1 및 2와 같이 나누어 표시한다.

3) Cell control을 제외한 모든 well에 배지 25㎕를 분주한다. Cell control에는 50㎕씩 분주한다.

4) 각 복수 well의 처음과 두 번째 well에 비동화된 혈청 25㎕씩 분주한다. 첫 번째 well에는 혈청 및 배지만 분주하여 Serum control로 사용한다.

5) 두 번째 well에서부터 이진 희석하여 나간다. Serum control은 희석하지 않는다.

6) 100TCID50/25㎕ 역가의 바이러스 부유액(10% 보체첨가)을 준비하여 serum control, cell control 및 virus back titration을 제외한 모든 well에 25㎕씩 분주한다.

7) 10-1, 10-2, 10-3 바이러스 희석액을 만들어 virus control로 사용한다. 각 희석배수당 8개의 well에 25㎕씩 분주한다.

8) 플레이트를 부드럽게 흔들어 혈청과 바이러스가 잘 섞이도록 한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간동안 감작시킨다.

9) 각 well에 3 X 105 cells/ml의 세포부유액(10% FBS)을 100㎕씩 분주한다.

10) 37℃, 5% CO2 인큐베이트에서 3일간 배양하면서 매일 관찰한다.

2. 판정

1) 3일간 배양하는 동안 날마다 CPE를 관찰한다.

2) 바이러스의 역가가 30-300 TCID50/25㎕이어야 한다.

3) 표준양성 혈청의 역가 차이가 0.3log10이하(기존역가의 +/- 2배)일 경우 유효하다.

4) Serum control에는 CPE 및 세포독성이 관찰되지 않아야 한다.

※ 세포독성(특히 herpesvirus백신을 접종한 경우 가능성이 있다고 함)이 관찰된 경우 기니픽 보체를 rabbit 보체로 교체하는 방법이 거론되기도 하지만 RK13 세포를 하루 전날 microplate에 접종하여 monolayer 상태로 만든 후 혈청-바이러스 반응액을 접종하는 방법이 적극적으로 권장되고 있다.

5) 혈청의 역가가 1:4이상이면 양성으로 판정한다.

※ Virus back titration중 가장 낮은 배수의 바이러스 CPE well와 비교해서 75% 이상 CPE 발생이 억제된 경우에는 양성으로 판정하고, 75%이상 CPE가 발생한 경우에는 음성 well로 판정한다.

[그림 1] Sample plate

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	S.C	1/4	1/8	1/16	S.C	1/4	1/8	1/16	S.C	1/4	1/8	1/16
A	1				5				9
B
C	2				6				10
D
E	3				7				11
F
G	4				8				12
H

[그림 2] Control Plate

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	S.C	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	1/2048	1/4096
A	P.S
B
C	N.S
D
E	100 TCID		10 TCID		1 TCID		0.1 TCID		CELL CONT ROL
F
G
H

말전염성동맥염 Equine Viral Arteritis
말정액 항원검사	Virus isolation

Cell : RK-13

virus : EVA virus Bucyrus strain

medium : 항생제 포함 2% FBS α-MEM (정액희석용)

0.75% CMC(carboxymethyl cellulose) 및 항생제 포함 α-MEM

※ 0.75% CMC 배지준비

o CMC(sigma 4888, medium viscosity) 3g을 70ml 증류수에 녹인다.

o 90%가량 녹인 CMC 용액을 고압멸균한 후 이에 α-MEM 330ml을 더한다.

o 4℃에서 overnight으로 녹인다.

(제 1일)

10% FBS(항생제 포함) α-MEM배지로 RK-13 cell을 25cm2 플라스크에 3~5일간 배양(37℃ 5% CO2)하여 monolayer상태가 되도록 한다.

(제 4일)

1. 정액 스트로우에서 정액 1ml을 15ml 원심분리관에 채취한다.

2. 1000rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액(seminal plasma)을 취하여 항생제가 첨가된 2% FBS α-MEM에 10-3배까지 10배 단계희석(10-1-10-3) 한다.

3. 세포가 배양되어 있는 플라스크내 배지를 버리고 각 희석 배수당 최소 2개 이상의 flask에 1㎖씩 접종한다.

4. 플라스크 뚜껑을 닫고 시료가 세포표면에 골고루 퍼지도록 부드럽게 기울여준다.

5. 37℃(5% CO2)에서 1시간 동안 플라스크를 배양한 후 0.75% CMC가 첨가된 배지(α-MEM, 항생제 포함)를 8ml씩 분주한다.

6. 2~6일간 배양(37℃ 5% CO2)하면서 CPE를 관찰한다.

7. CPE가 관찰되지 않는 경우 2차 접종에 대비하여 제 1일과 같은 방법으로 세포를 준비한다.

8. CPE가 관찰된 경우에는 real-time RT-PCR로 재확인한다.

(제 8일)

1. CPE가 관찰되지 않은 플라스크를 2 ~ 3회 해동후 스크래퍼를 이용하여 긁어낸다.

2. 플라스크의 세포부유액을 원심분리관에 채취한 후 제 4일의 2~6번과 동일한 절차로 배양한다.

3. CPE가 확인된 경우에는 real-time RT-PCR로 재확인한다.

#  Real-time RT-PCR을 이용한 항원검출법

a. Real-Time RT-PCR primer 및 probe1)

Primer & Probe	Genomic location(basese)	Seqeunces	Product size (bp)	Target region
Forward	12,365-12,385	GGCGACAGCCTACAAGCTACA	204	ORF7
Reverse	12,550-12,568	CGGCATCTGCAGTGAGTGA
Probe	12,404–12,425	TTGCGGACCCGCATCTGACCAA

1) Zhengchun Lu외 6명, 2008. Comparison of two real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays for the detection of Equine arteritis virus nucleic acid in equine semen and tissue culture fluid. Journal of Veterinary Diagnosis and Investigation. 147-155

b. Real-Time RT-PCR 시약조성(Qiagen 2 x QuantiTect RT-PCR kit)

시약명	사용량
Master Mix	12.5
Primer(F) 10pmole	1
Primer(R) 10pmole	1
RT-MIX	0.3
Probe (10µM)	0.8
Template	3
RNase- free water	6.4
Final vol.	25㎕

c. 온도조건 (Corbett Rotor gene 3000)

RT-PCR 증폭 조건
RT and pre-denature		Denature	Annealing &Extension
50℃, 30min	95℃, 15min	95℃, 15sec	60℃, 60sec
1회	1회	40회

d. 결과판정

- 바이러스 검출 파장대 곡선의 생성유무를 확인한다.

돼지오제스키병 Aujeszky's Disease (Pseudorabies)
바이러스중화시험				VN Test
			미국 NVSL

세포 : PK-15 cell

바이러스 : Aujeszky's virus

배지 : α-MEM

1. 검사방법

1) 가검혈청 및 대조혈청(양성 및 음성)을 56℃에서 30분간 비동화한다.

2) 마이크로플레이트를 그림1 및 2와 같이 나누어 표시한다.

3) Cell control을 제외한 모든 well에 배지 50㎕를 분주한다.

Cell control에는 100㎕씩 분주한다.

4) 각 복수 well의 처음과 두 번째 well에 비동화된 혈청 50㎕씩 분주한다.

첫 번째 well에는 혈청 및 배지만 분주하여 Serum control로 사용한다.

5) 두 번째 well에서부터 2진희석하여 나간다.

6) 100 TCID50/50㎕ 역가의 바이러스부유액을 준비한다. Serum control, Cell control 및 virus back titration을 제외한 모든 well에 50㎕씩 분주한다.

7) 10-1, 10-2, 10-3 바이러스 희석액을 만들어 virus control로 사용한다.

각 희석배수 당 8개의 well에 분주한다.

8) 플레이트를 부드럽게 흔들어 혈청과 바이러스가 잘 섞이도록 한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간동안 감작시킨다.

9) 각 well에 1.5 X 105cells/ml의 세포부유액(10% FBS)을 150μl씩 분주한다.

10) 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2~3일간 배양하면서 매일 관찰한다.

2. 판정

1) 바이러스의 역가가 30~300 TCID50/50㎕이어야 한다.

2) 혈청의 역가가 1:4 이상이면 양성으로 판정한다.

그림1. CONTROL PLATE

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
		SC	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	VIRUS BACK TITRATION
A	+VE CONTROL									100
B
C	-VE CONTROL									10-1
D
E	CELL CONTROL									10-2
F
G										10-3
H

그림2. TEST PLATE

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
		SC	1/4	1/8	1/16	SC	1/4	1/8	1/16	SC	1/4	1/8	1/16
A		1				5				9
B		1				5				9
C		2				6				10
D		2				6				10
E		3				7				11
F		3				7				11
G		4				8				12
H		4				8				12

돼지오제스키병 Aujeszky's Disease (Pseudorabies)
효소면역법	HerdChek* : Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit
				미국 IDEXX

1. 진단킷트의 사용목적

HerdChek : Anti-PRV(V)는 porcine pseudorabies virus(PRV)와 normal host cell(NHC)을 이용하여 돼지혈청내의 오제스키바이러스에 대한 항체를 검출하는 진단킷트이다.

2. 개요

가성광견병 혹은 오제스키병으로도 불리는 이 질병은 type 1 돼지 허피스바이러스에 의한 질병이다. 감염으로 인한 높은 폐사율은 감수성 있는 모돈으로부터 태어난 포유자돈에 영향을 미친다. 치명적인 상태의 어린 돼지는 호흡곤란, 발열, 침 많이 흘리기, 식욕감퇴, 구토, 설사, 떨림, 침울 등의 증상을 보이며, 감염의 최종단계에서는 종종 운동실조, 안구진탕, 지속적 발작, 간헐적 경련, 혼수 상태를 보이고 죽음에 이른다. 폐사는 보통 임상증상이 확실히 나타난지 24-48 시간 후에 이루어진다. 이유자돈 및 비육돈에서의 임상증상은 4-8일까지 연장된다. 성돈에서의 폐사율은 2%까지 나타나지만, 일반적으로 경제적 손실은 없다. 임신돈의 임상증상은 사실상 성돈과 비슷하나, 태아의 태반감염에 의한 차이가 있다. 이 질병은 태반감염이 일어날 수 있고, 수태기에 따라서 일련의 증상이 나타날 수 있다 : 재흡수, 조산, 침연태아 출산, 사산, 유약자돈 출산, 감염돈 출산 등. 최근 감염에서 회복된 모돈의 20%가 다음 교배에서 임신하지 못하였다는 보고가 있다. 자연감염 또는 백신을 통한 PRV에 대한 노출은 혈청, 혈장, 고기로부터 나온 삼출액 등에서의 항체를 측정함으로써 추정할 수 있다.

자연감염 또는 백신접종에 의한 오제스키병 바이러스에의 노출 유무는 혈청내 항체측정으로 확인가능하다.

3. 시약

모든 시약은 2-7℃에 보관한다.

A. PRV coated plates	6 Plate

B. Anti-PRV gB: HPRO conjugate

보존제로 gentamicin 함유	60㎖

C. 양성대조혈청

돼지 PRV 양성혈청

protein stabilizer가 첨가된 PBS로 희석됨

보존제로 azide 함유	7㎖

D. 음성대조혈청

돼지 PRV 음성혈청

보존제로 azide 함유	7㎖l

E. 혈청 희석액

protein stabilizer가 첨가된 phosphate buffer

보존제로 azide 함유	120㎖

F. 세척액 농축액

(10× concentrate) phosphate

보존제로 gentamicin 함유	235㎖

G. TMB solution	60㎖

H. Stop solution	60㎖

4. 원리

HerdChek:Anti-PRV(V)는 돼지혈청내의 PRV 항체를 검출하기 위한 효소면역법 킷트이다. 첫 번째 단계에서, 샘플내 존재하는 PRV 항체는 플레이트의 항원과 반응하게된다. 세척 후, Anti-PRV gB antibody conjugate를 첨가하여 바이러스 항원에 대하여 경쟁하도록 한다. 만일 PRV gB 항체가 샘플내에 존재하지 않는다면, conjugated antibody는 항원과 결합할 것이다. 반대로, 샘플내에 PRV gB 항체가 존재한다면, 효소가 결합된 단클론항체와 항원과의 반응은 block될 것이다. 마지막으로 결합되지 않은 conjugate를 씻어내고 substrate/chromogen solution을 분주한다. Enzyme의 존재하에, substrate는 발색단과 반응하는 물질로 변환되어 파란색을 띈다. 650nm에서의 흡광도(A650)를 spectrophoto- meter를 이용하여 측정한다. 결과는 샘플의 흡광도를 음성대조혈청의 흡광도의 평균으로 나누어 계산하고, 결과는 S/N (sample/negative) value로 나타낸다. PRV에 대한 항체의 양은 A650에서의 흡광도에 반비례 한다, 즉  S/N value에 반비례 한다. PRV 항체의 존재는 이전에 PRV의 야외주에 노출되었거나, 약독 혹은 사독백신을 적용하였거나, gE-deleted 백신을 적용함을 시사한다.

5. 킷트에 포함되지 않은 시약 및 기구

◦ 피펫: 50㎕, 100㎕ 피펫과 멀티채널 피펫

◦ 일회용 피펫팁

◦ 메스실린더: 세척액 희석용 500㎖

◦ 96 well 플레이트 판독기

◦ 유리 또는 플라스틱 혈청희석용 시험관

◦ 증류수 또는 이온제거수

◦ 세척액 분주 및 흡입용 기구

◦ 흡입을 위한 진공펌프 및 필요기구

6. 주의사항

◦ Virus가 화학적으로 처리되었지만 PRV를 전파할 가능성이 있다는 전제하에서 시약들을 다룬다.

◦ 입으로 피펫팅하지 않는다.

◦ 킷트로 실험하는 동안에는 음식물 반입금지

◦ TMB 및 stop solution 등은 피부에 자극을 주므로 주의한다.

◦ 어떤 시약은 보존제로 sodium azide를 포함하고 있다. 버릴때는 폭파할 위험이 있으므로 대량의 물과 함께 버린다. 또한 Anti-PRV gB HRPO Conjugate에  sodium azide가 오염되지 않도록 주의한다.

◦ TMB 용액은 강한 빛이나 산화제에 노출하지 말아야 하고 모든 TMB 용액은 깨끗한 유리병이나 플라스틱병에 보관한다.

◦ 모든 시약은 2-7℃에서 보관한다. 사용하기 전에 실온에 두고 사용 후에는 곧바로 냉장 보관한다.

◦ 사용한 모든 시약 및 소모품은 적절한 방법으로 폐기한다.

◦ 킷트에 포함된 시약들에 오염이 되지 않도록 조심한다.

◦ 유효기간이 지난 시약은 사용하지 말고 다른 serials의 제품을 혼용하지 않는다.

◦ 본 프로토콜을 정확히 따라야 좋은 결과를 얻을 수 있다. 피펫팅 용량, 감작시간, 세척 등의 기준을 정확히 따른다.

7. 시료 처리

시료희석액으로 시료, 음․양성대조혈청을 1/2로 희석한다. (예: 150㎕ 샘플 + 150㎕ 시료희석액)

각각의 샘플은 팁을 교체하여 사용하고 HerdChek worksheet를 쓸 때 샘플의 위치를 표시하여야 한다. 샘플은 plate에 분주 전 잘 혼합한다.

8. 세척액 제조

세척액 농축은 실온에 두었다가 혼합하며 녹지 않고 남아있는 염이 없도록 한다. 증류수로 1:10으로 희석한다.

(예: 30㎖ 농축액 + 270㎖ 증류수 - 한 플레이트 검사 시 필요한 양).

9. 본검사

모든 시약은 사용하기 전에 실온(18-25℃)이 되도록 한다. 시약은 부드럽게 vortexing하거나 흔들어서 혼합한다.

1) 항원이 코팅된 플레이트를 꺼내어 work sheet에 시료의 정확한 위치를 표기한다.

2) 1/2로 희석된 음성대조혈청을 A1과 A2에 100㎕씩 분주

3) 1/2로 희석된 양성대조혈청을 B1과 B2에 100㎕씩 분주

4) 희석된 가검혈청을 연이어 있는 well에 100㎕씩 분주한다. 모든 시료는 복수로 검사하여야 한다. (예: 샘플1-C1, C2, 샘플2-D1, D2...)

5) 실온에서 60분간 감작시킨다.

6) well내의 모든 시약을 진공으로 빨아들여 제거한다.

7) 각 well당 300㎕의 PBS로 3-5회 세척한다. 각 세척이 끝날 때마다 well내의 모든 시약을 완전히 제거한다. 세척중간에 플레이트가 건조되지 않게 주의한다. 마지막 세척이 끝나면 흡습지위에서 플레이트를 톡톡 두드려서 물기를 완전히 건조시킨다.

8) 모든 well에 anti-PRV gB: HRPO conjugate를 100㎕씩 분주한다.

9) 실온에서 20분동안 감작시킨다.

10) 6번과 7번과정을 반복한다.

11) 모든 well에 TMB용액 100㎕씩 분주한다.

12) 실온에서 15분간 반응시킨다.

13) 모든 well stop solution을 50㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨다.

14) 플레이트를 650㎚에서 판독 한다.

15) 결과를 계산한다.

10. 결과

검사결과가 유효하기 위해서는 다음의 조건이 충족되어야 한다.

◦ 음성대조혈청 평균 ― 양성대조혈청 평균 ≥ 0.300

결과가 이상할 경우에는 검사방법을 검토해보고 시약을 재점검하여 검사를 다시 실시한다. 가검혈청내에 항체가 있는가 없는가는 각 샘플에 대한 S/N value를 계산함으로써 결정된다.

11. 계산

◦ 음성대조혈청의 평균을 계산한다.

A1 A(650) + A2 A(650)

NC:PRV = □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

2

◦ 양성대조혈청의 평균을 계산한다.

B1 A(650) + B2 A(650)

PC:PRV = □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□

2

◦Sample /음성시료(S/N) 비율 계산

Sample A(650)

S/N = □□□□□□□□□□□□□□□□

NC:PRV

12. 결과의 판정

◦ S/N value가 0.60이하면 PRV에 대해 양성이다.

◦ S/N value가 0.60초과 0.70이하면, 재검을 실시한다. 만일 결과가 동일하면, 나중 날짜에서 샘플을 채취하여 다시 실험을 한다.

◦ S/N value가 0.7을 초과하면, PRV에 대해 음성이다.

돼지오제스키병 Aujeszky's Disease (Pseudorabies)
	SERELISATM PRV g1 Ab Mono Blocking
			미국 SYNBIOTICS

1. SERELISATM PRV g1 Ab kit 사용 목적은

- 백신접종을 한 집단 중 감염돈과 비감염돈을 감별하기 위하여

- 백신접종을 안한 집단 중 감염돈의 확인

2. 원리

SERELISATM PRV g1 Ab Mono Blocking test kit는 돼지에서 anti-envelop glycoprotein을 검출하는 blocking immuno enzymatic technique이다.

◦ 각각의 샘플은 PRV envelop glycoprotein이 코팅된 well에 분주. 샘플 내의 Anti-g1 antibodies는 well에 코팅된 바이러스의 glycoprotein antigen과 결합한다.

◦ 세척단계 후, anti-g1 monoclonal antibody(Mab) peroxidase conjugate를 첨가. g1과 결합하여 (Ag PRV envelop glycoprotein)-(Mab anti-g1/ peroxidase) complex를 형성한다.

◦ 여분의 conjugate는 이차 세척으로 제거한다. conjugate와 enzyme의 결합은 색을 발현시키는 substrate를 첨가하면서 나타난다.

- 샘플에 anti-g1 antibody가 없다면 enzyme conjugate 결합이 g1 자리에 변환되면서 진한 색깔 반응이 나타남

- 샘플에 anti-g1 antibody가 존재하면 enzyme conjugate 결합이 적어 색변화가 감소한다.

3. 시약

◦ PRV envelop glycoprotein에 감작하는 microplate 4개 : 6 strips(2X8 well) 개봉 후 4주 안에 사용하고 사용 후 봉지 밀봉

◦ Wash solution(W) 증류수로 10배 희석, 희석 후 48시간 내 사용

◦ Sample diluent(SD)

◦ Negative control(N)

◦ Positive control(P)

◦ Conjugate diluent(CD)

◦ Conjugate (농축) Mab anti-BVD/BD peroxidase(CJ)

conjugate 희석액에 10배 희석, 희석 후 24시간 이내 사용

◦ Buffered peroxidase substrate(PS)

◦ Stop solution(S)

◦ 접착필름 12장

※ 주의 : kit와 희석용액은 5℃±3℃ 보관

4. 킷트에 포함되지 않은 시약 및 기구

◦ 증류수 또는 이온제거수

◦ 피펫 : 0~1000㎕

◦ 메스실린더 (100㎖, 1000㎖)

◦ 수동, 자동 또는 반자동 세척기

◦  마이크로플레이트 판독기, bichromatic filter(450㎚와 630㎚) 또는 monochromatic filtre(450nm)

◦ 인큐베이터(±37℃±3℃)

5. 주의사항

◦ 유효기간이 지난 시약 사용금지.

◦ 사용하기 적어도 한 시간 전에 실온에 시약보관

◦ 모든 시약과 샘플은 감염 위험요소가 있으므로 주의해서 취급.

◦ 시약으로부터 피부와 눈 보호. 만약 묻었다면 흐르는 차가운 물로 씻어내기.

◦ 입으로 피펫팅하지 않는다.

◦ 시료를 다룰 때 오염되지 않도록 주의. 각 시료는 각각의 피펫팁을 사용한다.

◦ substrate용액이 metallic ion, oxidizing agent, detergent에 오염되는 것을 주의. 용기는 깨끗한 것을 사용. conjugate와 substrate를 동일한 용기나 피펫으로 사용하지 않는다.

◦ 사용한 일회용품은 폐기 전 5% sodium hypochloride에 1시간 동안 담가 두거나 120℃ 1시간 이상 autoclave해서 오염을 줄인다.

Risk phrases

R35 : 화상에 주의

S26 : 눈에 들어갔을 때 즉시 씻어내고 의사와 상의

S30 : 제품에 물을 첨가하지 말 것

S45 : 사고시나 몸 상태가 좋지 않을 시 즉시 의사와 상의

6. 시료처리

혈청은 혈청 희석액으로 1:2 희석

혈장 또는 전혈은 ±5℃ 7일 이내 또는 -20℃에서 보관

7. 본실험

control과 sample은 분주

실험할 혈청 또는 혈장 샘플을 먼저 희석해서 준비

◦ control 분주

vial을 흔들어

negative control 100㎕를 A1, A2에 분주

positive control 100㎕를 B1, B2에 분주

◦ sample

2배로 희석한 혈청 또는 혈장을 각 well에 100㎕씩 분주

직접 희석하려면 well에 혈청 희석액 50㎕에다 혈청 또는 혈장 50㎕를 넣고 잘 섞는다.

샘플은 단일 또는 이중검사 실시

Strip은 frame안에 장착하여 washer나 reader를 사용할 수 있게 한다.

Strip 수에 맞게 부착필름을 잘라 well을 덮는다.

손 또는 plate agitator를 사용해 plate를 살살 흔들어 섞는다.

◦ Incubation

5℃±3℃에서 overnight(14～18시간)하거나 37℃±3℃에서 2시간±5분 배양한다.

◦ Washing

증류수 또는 demineralised water로 세척농축액 1:10 희석

조심스럽게 부착필름을 제거한 후 4번 세척

◦ Conjugate

conjugate 희석액으로 1:10 희석

one strip에 2㎖ 필요(농축액 200㎕ + 희석액 1.8㎖)

conjugate 분주

각 well 당 희석된 conjugate 100㎕를 넣고 새로운 부착필름을 덮는다.

incubation

37℃±3℃에서 1시간±5분 배양한다.

washing

부착필름을 조심스럽게 떼어내고 4번 washing

◦ Substrate 첨가

peroxidase buffered substrate 100㎕를 각 well에 넣고 이번에는 부착필름을 덮지 않는다. plate를 살살 흔들어 섞는다.

◦ Incubation

30분±5분동안 실온(20℃±5℃) 암실에서 배양한다.

◦ Stop solution 첨가

각 well 당 50㎕ stop solution 첨가. plate를 살살 흔들어 섞고 well안에 기포가 생기지 않도록 조심한다.

◦ OD 측정

bichromatic (450㎚, 630㎚) 또는 monochromatic reader (450㎚)로 OD 측정

8. 결과판독

negative control의 OD≥0.5

positive control의 competition percentage≥80% 이어야 유효

%P		ODN-ODP
	=		× 100
		ODN

방법 1) Competition percentage (%sample)를 계산

%S		ODN-ODS
	=		× 100
		ODN- ODP

음  성	%S < 40%

의양성	40% ≤ %S < 50%

양  성	%S ≥ 50%

방법 2) Analysis of optical densities

OD CO 40 = 0.60 ODN + 0.40 ODP

OD CO 50 = 0.50 ODN + 0.50 ODP

샘플의 OD치가 OD CD 50보다 높으면 양성

OD CD 40보다 높으면 의양성

OD CD 40보다 낮으면 음성

돼지오제스키병 Aujeszky's Disease (Pseudorabies)
원인체 동정		Agent Identification
				미국 NVSL

제 1일

12 well plate에 PK-15 cell을 1×105 cells/㎖로 하여 각 well당 2㎖씩 분주한 후, 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양한다.

제 4일

1. 정액스트로우에서 정액 1㎖을 15㎖ 원심분리관에 채취한다.

2. 얼리고 녹이는 과정을 2-3회 반복한다.

3. 1000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 채취하여 9㎖의 PBS가 들어있는 원심분리관에 첨가한다.

4. 37℃에서 2시간 동안 감작시킨다.

5. 세포가 배양되어 있는 플레이트의 각 well에 들어있는 배지를 버리고 그림1과 같은 식으로 감작시킨 시료를 200㎕씩 접종한다.

6. 37℃에서 2시간 동안 감작시킨다.

7. 각 well의 시료를 버리고 PBS로 2～3회 세척한다.

8. 각 well에 성장배지(5% FBS, α-MEM) 2㎖을 분주한다.

9. 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하면서 CPE를 관찰한다.

10. 제 1일과 같은 방법으로 세포를 준비한다.

제 7일

1. 시료 상층액을 접종하여 3일간 배양된 플레이트를 얼리고 녹이는 과정을 2-3회 반복한다.

2. 각 well의 세포를 스크래퍼를 이용하여 긁어낸다.

3. 각 well의 배지와 세포를 각각의 튜브에 수집하여 1000rpm에서 5분간 원심분리 한다.

4. 미리 준비된 세포가 배양되어 있는 플레이트의 각 well에 들어있는 배지를 버리고 3번 과정을 거친 시료의 상층액을 200μl씩 접종한다.

5. 제 4일의 6-9번과 동일한 절차를 시행한다.

6. 제 4일의 10번과 같이 세포를 준비한다.

제 10일

제 7일과 똑같은 과정을 반복한다.

제 13일

제 10일과 똑같은 과정을 반복한다.

단 세포는 준비하지 않아도 된다.

제 16일

각 well에 세포변성이 일어났는지 확인한다.

세포변성이 일어나지 않으면 음성으로 판정하고 세포변성이 일어나면 단클론항체를 이용하여 염색한 후 현미경으로 관찰한다.

그림 1. 플레이트의 구성(12 well plate)

	1	2	3	4
A	시료 1	시료 1	시료 2	시료 2
B	시료 3	시료 3	시료 4	시료 4
C	시료 5	시료 5	시료 6	시료 6

* Tip : 세포배양 플레이트를 2 set 준비하여 실험하되, 1 set는 3일 간격으로 계대하여 실험하고 다른 1 set는 지속적으로 CPE를 관찰하도록 한다.

돼지생식기호흡기증후군 PRRS
효소면역법		(IDEXX PRRS X3)
				미국 IDEXX

1. 진단킷트의 사용목적

IDEXX PRRS X3는 돼지혈청 내의 PRRS virus에 대한 항체를 검출하는 진단킷트이다.

2. 개요

PRRSV는 호흡기 및 가벼운 신경증상을 일으키는 새로운 돼지 질병은 1987년에 최초로 보고되었다. 대부분의 케이스에서 일반적인 임상증상으로 볼 때 진단은 swine influenza, pseudorabies, classical swine fever, parvovirus, encephalomyocarditis, chlamydia, 그리고 mycoplasma와 감별진단해야 한다. 이 질병은 미성숙태아, 임신말기 유산, 허약자돈, 사산, 미이라태아를 일으키는 번식계 질병이다. 이러한 번식계 질병은 1-3주 령에 관찰할 수 있다. 호흡기 질병은 3-4주령 이전에 일으킬 수 있는 중요한 증상이다. 호흡기 증상은 대부분의 생식기 증상 중에 나타날 수 있다.

많은 다른 질병과 혼동되는 증상 때문에 이 질병은 mystery swine disease (MSD)라고 불려졌고, 후에는 swine infertility and respiratorysyndrome(SIRS)라고 불려졌다. 1990년, 유럽연구자들은 MSD/SIRS로 동정할 수 있는 특징들을 보고했다. 독일, 네덜란드, 스페인, 프랑스, 영국 그리고 캐나다에서 발생했으며, New Pig Disease, porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), blue ear disease and porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)로 보고했다. 그리고 지금은 이 질병을 PRRS로 부르고 있다.

유럽과 북아메리카 과학자들은 이 질병에 대하여 원인체를 성공적으로 분리하였다. 이 질병은 양 그룹들에 의해서 실험적으로 연구하고 있다. 연구가들은 PRRS 임상증상을 나타내는 유럽주와 US주에 대해 토론하고 있다. 이 원인체는 equine arteritis virus(EVA)와 lactate dehydrogenase-elevating virus(LDV)와 비슷하다. 네덜란드의 연구가들은 유전적인 sequencing 정보에 근거로 하여 Arteriviridae family로 새롭게 분류 되어야 한다고 제안했다. 이 바이러스는 원래 Togaviridae의 unclassified virus로 명명되어 있었다.

현재 이 바이러스의 감염은 전세계 대부분의 지역이다. 일부 나라에서는 비발생지역이지만 몇몇 나라에서는 발생률이 80% 이상인 나라도 있다. 여러 연구결과에서 발표된 PRRS의 두 가지 특징적인 양상은 이 바이러스 분리주에서의 1) 균주 변이성(strain variability)과 회복기 동안 존재하는 2) 지속적 감염이다. 이러한 PRRS 두 가지 특징은 이 질병의 진단 시 혼동을 줄 수 있다.

자연감염에 의한 PRRS 바이러스의 노출은 혈청 중에 존재하고 있는 항체를 측정함으로서 진단할 수 있다. 이 바이러스의 여러 균주에 대해 민감한 항체를 측정할 수 있는 면역진단방법은 매우 중요하다.

3. 시약

모든 시약은 2-8℃에 보관한다.

A. PRRSV 항원이 코팅된 플레이트	5 Plates

B  음성대조혈청	4㎖

C. 양성대조혈청	4㎖

D. conjugate	60㎖

E. 혈청 희석액	120㎖

F. TMB Substrate	60㎖

G. Stop solution	60㎖

H. 세척액 농축액(10X)	235㎖

4. 원리

PRRS X3는 돼지혈청 내의 PRRS 항체를 검출하기 위한 효소면역법 킷트이다.  플레이트에는 재조합 PPRSV가 코팅되어 있다. 코팅된 well에 혈청을 분주하여 감작하면 PRRS에 특이적인 항체가 코팅된 항원과 반응한다. 결합하지 않은 물질을 세척하여 씻어내고, 플레이트에 존재하는 모든 돼지 항체와 결합하는 anti-porcine:horse- radish peroxidase conjugate를 첨가한다. 마지막으로 결합하지 않은 conjugate를 씻어내고 TMB substrate를 분주한다. 색깔의 변화는 샘플내의 PRRSV에 대한 특이항체의 결합양에 비례한다.

5. 킷트에 포함되지 않은 시약 및 기구

◦ 피펫 : 10㎕, 100㎕ 및 400㎕ 피펫과 멀티채널 피펫

◦ 일회용 피펫팁

◦ 메스실린더 : 세척액용 500㎖

◦ 96 well 플레이트 판독기

◦ Blank 용 코팅되지 않은 빈 플레이트

◦ 혈청희석용 시험관

◦ 증류수 또는 deionized water

◦ 세척액 분주 및 흡입용 기구

◦ 흡입을 위한 진공펌프 및 필요기구

6. 주의사항

◦ Virus가 화학적으로 처리되었지만 PRRS를 전파할 가능성이 있다는 전제하에서 시약들을 다룬다.

◦ 입으로 피펫팅하지 않는다.

◦ 킷트로 실험하는 동안에는 음식물 반입금지

◦ ABTS 농축액, 세척액 및 stop solution 등은 피부에 자극을 주므로 주의한다.

◦ 어떤 시약은 보존제로 sodium azide를 포함하고 있다. Anti-porcine:HRPO conjugate에 sodium azide가 오염되지 않도록 주의한다.

◦ TMB 용액, 희석액 그리고 산이 들어있는 용액은 피부나 눈에 접촉을 하지 않도록 한다. 정지액은 플라스틱 병에 넣어 보관한다. 산이 들어있는 용액 취급시 보안경을 착용한다.

◦ TMB 용액은 강한 빛이나 산화제에 노출하지 말아야 하고 모든 TMB 용액은 깨끗한 유리병이나 플라스틱 병에 보관한다.

◦ 모든 시약은 2-8℃에서 보관한다. 사용하기 전에 실온에 두고 사용후에는 곧바로 냉장 보관한다.

◦ 사용한 모든 시약 및 소모품은 적절한 방법으로 폐기한다.

◦ 유효기간이 지난 시약은 사용하지 말고 다른 serials의 제품을 혼용하지 않는다.

◦ 본 프로토콜을 정확히 따라야 좋은 결과를 얻을 수 있다. 피펫팅 용량, 감작시간, 세척 등의 기준을 정확히 따른다.

7. 시료처리

시료 희석액으로 혈청을 1:40으로 희석한다.

(예 : 혈청 5㎕ + 시료 희석액 195㎕)

대조혈청은 희석하지 않는다.

8. 세척액 제조

세척액 농축은 실온에 두었다가 혼합하며 녹지 않고 남아있는 염이 없도록 한다. 증류수로 1:10으로 희석한다. (예: 30㎖ 농축액 + 270㎖ 증류수 - 한 플레이트 검사시 필요한 양)

9. 본검사

모든 시약은 사용하기 전에 실온이 되도록 한다. 시약은 부드럽게 vortexing하거나 흔들어서 혼합한다.

1) 항원이 코팅된 플레이트를 꺼내어 work sheet에 시료의 정확한 위치를 표기한다.

2) 희석되지 않은 음성대조혈청을 PRRS well C1, D1에 100㎕씩 분주한다.

3) 희석되지 않은 양성대조혈청을 PRRS well A1, B1에 100㎕씩 분주한다.

4) 희석된 가검혈청을 연이어 있는 well에 100㎕씩 분주한다.

5) 실온에서 30분간 감작시킨다.

6) well내의 모든 시약을 제거한다.

7) 각 well당 300㎕의 세척액으로 3-5회 세척한다. 각 세척이 끝날 때마다 well내의 모든 시약을 완전히 제거한다. 세척중간에 플레이트가 건조되지 않게 주의한다. 마지막 세척이 끝나면 흡습지위에서 플레이트를 톡톡 두드려서 물기를 완전히 건조시킨다.

8) 모든 well에 conjugate를 100㎕씩 분주한다.

9) 실온에서 30분동안 감작시킨다.

10) 6번과 7번과정을 반복한다.

11) 모든 well에 TMB용액 100㎕씩 분주한다.

12) 실온에서 15분간 반응시킨다.

13) 모든 well stop solution을 100㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨다.

14) 플레이트를 650㎚에서 판독 한다.

15) 결과를 계산한다.

11. 결과

검사결과가 유효하기 위해서는 다음의 조건이 충족되어야 한다.

◦ 양성대조혈청 평균 ― 음성대조혈청 평균 ≥ 0.150

◦ 음성대조혈청 평균 ≤ 0.150

계산

◦ 양성대조혈청의 평균을 계산한다.

Positive control mean		A1 A(650) + A2 A(650)
	=
		2

◦ 음성대조혈청의 평균을 계산한다.

Negative control mean		B1 A(650) + B2 A(650)
	=
		2

◦ Sample /양성시료(S/P) 비율 계산

S/P		Sample A(650) -Negative control mean
	=
		Positive control mean- Negative control mean

12. 결과의 판정

◦ S/P ratio가 0.4 이상이면 PRRSV에 대해 양성이다.

돼지생식기호흡기증후군 PRRS
	간접형광항체법 IFA (Indirect immunofluorescence assay)
				OIE manual

1. 준비

가. 냉동 보관된 항원 코팅 슬라이드를 실온에 꺼내둔다.

나. 가검 혈청의 번호 및 위치를 test sheet에 적어둔다.

2. 검사방법

가. 항혈청과 가검혈청을  PBS(0.01M;pH7.2)로 20배 희석한다.

나. 희석한 혈청과 양성, 음성 대조혈청 50㎕씩 각각 IFA용 slide에 분주한다.

다. 슬라이드를 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

라. PBS로 세척한 다음, 용액을 완전히 제거 한다.

마. 적정농도(50～100배)로 희석한 rabbit or goat anti-swine IgG(H+L) conjugated with FITC를 각 well에 분주한다.

바. 슬라이드를 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

사.  PBS로 세척한 다음, 마지막은 증류수로 린스한다.

아. 슬라이드를 완전히 건조시킨 후 형광현미경으로 관찰한다.

돼지 인플루엔자 Swine influenza
	항원, 항체 검사
			QIA

항 원 진 단 법

1. 샘플채취 및 전처리

□ 돼지

1) 돼지 비강의 점막 분비물 및 상피세포 swab

2) 채취한 swabs을 냉장상태로 신속히 실험실로 운반한다.

3) nasal swabs을 PBS(4ml)가 담긴 tube에 1개씩 넣고 강하게 vortex한다.

4) 3)번을 항생제 처리한 후, 1,500-1,900g에서 15-30분 원심분리한다.

5) 상층액을 0.45㎛ synringe filter를 이용하여 filter한다.

※ 상층액은 4℃에서 24시간 보관이 가능하다. (24시간 이상 보관하고자 할 경우는 -70℃에서 보관할 것!)

6) filter한 상층액을 5개씩 *pooling한다.

6) 전처리된 상층액을 이용하여 바이러스를 증식시킨다.

- Cell culture virus isolation and egg inoculation

□ 돈육

1) 시료 1점 당 지방을 배제한 살코기 위주로 25g을 자른 후 분쇄기에 3점을 합쳐서 분쇄한다.

2) 분쇄된 시료를 Whirl pak에 넣는다.

3) 150㎖ 용량의  PBS를 2)번 pak에 넣고 잘 섞어준다.

4) 상층액을 50㎖ tube로 옮긴 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리한다.

5) 상층액 200㎕를 채취하여 RNA를 분리한 후 RT-PCR 검사를 실시한다.

2. Virus isolation

돼지비강 swabs : cell culture virus isolation 및 egg inoculation실시

□ Cell culture virus isolation

1) MDCK (Madin-Darby canine kidney) cell을 monolayer되도록 24well에 미리 배양한다.

● MDCK cell medium : DMEM +10% FBS + Antibiotics

2)  전처리된 샘플을 접종하기 전에 cell monolayer를 PBS로 2-3회 washing한다.

3) 전처리된 샘플을 200㎕ 씩 접종한다.

4) 1시간동안 37℃에서 배양한다. (occasional rocking)

5) 상층액을 제거한 후, 적당한 용량(2㎖)의 TPCK treated trypsin(1㎕/㎖)이         함유된 바이러스배양배지를 각각의 well에 분주한다.

● Media for virus growth : DMEM + TPCK treated trypsin(1㎕/㎖) + Antibiotics  (without serum)

6) 4-5일간 37℃에서 배양하면서 CPE(cytopathic effect)를 관찰한다.

7)ⅰ) CPE가 관찰되지 않을 경우 :

- HA test를 실시하고, 그 결과가 양성일 경우 RT-PCR 실시.

- plate를 -70℃에서 얼렸다가 녹인 후, 상층액을 이용하여 2차 계대 실시(3-6번 과정반복) 후  HA test -> 결과가 양성일 경우 RT-PCR 실시.

ⅱ) CPE가 관찰될 경우 : HA test, RT-PCR 실시.

□ Egg inoculation

1) 9-11일령 SPF란을 준비한다.

2) allantoic cavity에 0.2㎖의 시료를 접종한다. (sample당 3-5 eggs접종)

3)  37℃에서 5일간 배양한다. 매일 검란을 하고 24시간 이내에 죽은 eggs는 버린다.

4) 접종 24시간 이후 죽은 eggs는 냉장시킨 후 요막액을 채취해둔다.

배양기간 마지막 날에는 살아있는 eggs를 냉장시킨 후 요막액을 채취한다.

5) 채취한 요막액을 1500-1900g, 10-20분간 원심분리한다.

6) 상층액으로 HA test를 실시한다.

7) ⅰ) HA test에서 음성일 경우, 5)번 요막상층액으로 1)번-6)번의 과정을 재실시 한다.

ⅱ) HA test에서 양성일 경우, RT-PCR을 실시한다.

4.  Haemagglutination test (HA test)

□ 돼지

1) 0.5% RBC를 준비한다. (male turkey or chicken blood : strain에 따라서 혈구 종류마다 응집능의 차이를 보임, 4℃에서 1주일 보관가능)

2) U bottom 마이크로플레이트의 각 well에 PBS를 50㎕씩 분주한다.

3) 각 첫째열의 첫 well에 가검시료를 50㎕씩 분주한다.

4) 마이크로피펫으로 첫 번째 well(1/2)부터 11번째 well(1/2048)까지 이진      희석한다.(12번째 well : cell control로 작용)

5) 각 well에 0.5% RBC 50㎕를 분주하고, 플레이트를 잘 흔들어 준다.

6) 플레이트를 sealing하고 실온에서 30-60분간 정치시킨다.

(control well에 명확한 버튼이 형성될 때까지 정치시킨다.)

7) 혈구의 응집유무를 확인한다.

․ RBC spread thoughout the well : complete haemagglutination (positive HA)

․ distinct button of RBC : negative for haemagglutinating activity (negative for SIV)

․ partial button (donut-like apperance)을 보일 경우 플레이트를 45°정도 기울여서 적혈구의 흘러내림(tear-drop appearance)을 확인한다. 적혈구가     흘러내린다면 negative haemagglutination.

5.  RT-PCR

- RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리한 후, NP gene target One-step RT-PCR mix(Qiagen) 또는 M gene target premix(제노바이오)를 이용한 PCR을 실시한다.

□ RNA 분리

○ RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용한 RNA분리

1) 엔펜도르프 튜브에 200㎕ 샘플과 400㎕ buffer RLT를 넣고 가볍게 pipetting

2) 600㎕ 70% EtOH를 첨가 후 가볍게 pipetting

3) kit내 spin column에 2)번 solution 600㎕를 옮긴 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

4) column을 통과한 collection tube의 solution을 비운 후 재장착

5) 3번-4번 과정 반복

6) 700㎕ buffer RW1을 column에 첨가 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

7) column을 통과한 collection tube의 solution을 비운 후 재장착

8) 500㎕ buffer RPE를 column에 첨가 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

9) 7번-8번 반복

10) collection tube를 새것으로 교체한 후, 10,000rpm에서 1분간 원심하여 혹시라도 남아있을 수 있는 buffer RPE를 확실히 제거한다.

11) spin column을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 30㎕ RNase-free water를 spin column membrane에 첨가한 후, 실온에서 1-2분 방치

12)  10,000rpm에서 1분간 원심하여 RNA를 추출한다.

13) RT-PCR을 실시한다.

ⅰ) One-step RT-PCR mix(Qiagen)을 이용한 PCR 또는,

ⅱ) M gene target  premix(제노바이오)을 이용한 PCR

□ One-step RT-PCR mix(Qiagen)을 이용한 PCR

1) Primer set

Primer	Sequence(5'-3')	amplicon size
SIV NP F	CATCCCAGTGCTGGGAARGAYCCTAAGA	218bp
SIV NP R	AGAGCTCTTGTTCTCTGATAGGTC

2) PCR set up

Reagent	One-step RT-PCR(㎕)
Extracted nucleic acid	5
Nuclease-free water	11
5xbuffer	5
dNTPs	1
Primer mix (F+R/each 20pM)	2
Enzyme mix	1
Total volume	25

3) PCR reaction 조건

Step	One-step RT-PCR
	Temp	Time	Cycle
Reverse transcription	45°C	30min	1
Pre-denaturation	95°C	15min	1
Denaturation	94°C	20sec	35
Annealing	50°C	20sec
Elongation	72°C	30sec
Elongation	72°C	10min	1

4) 5-10㎕의 RNA추출물을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 양성band를 확인한다.

□  M gene target premix(Median diagnostics)을 이용한 PCR

- 진단 kit의 protocol에 따라서 검사를 실시한다.

6. 신종인플루엔자/계절독감 감별

- 신종 인플루엔자에 특이적인 M gene 부위를 이용하여 PCR검사를 실시한 후, 양성이 확인되는 경우 NA와 M에 대한 전체 유전자 PCR을 하여 유전자 염기서열 분석으로 신종인플루엔자 인지 최종 확인한다.

항 체 진 단 법

◆ 돼지

- 미국 IDEXX사의  IDEXX HerdChek SIV(H1N1) Test Kit을 이용하여 screenig test 실시한다.

- 1차(입고 2일째), 2차(입고 16일째) 혈청의 ELISA 실험결과 S/P ratio 값      상승이 확인되는 경우 HI test를 실시한다.

1.  Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

- IDEXX HerdChek SIV(H1N1) Test Kit의 진단 manual에 따라 검사 실시

□ 실험방법

1) 모든 시약은 사용하기 전에 실온(18-25℃)이 되도록 한다. 시약은 부드럽게  vortexing하거나 흔들어서 혼합한다.

2) 희석하지 않은 음성대조혈청을 A1, B1 well에 분주한다.

3) 희석하지 않은 양성대조혈청을 C1, D1 well에 분주한다.

4) 40배 희석한 가검혈청을 다음 well에 duplicate로 분주한다.

5) 실온에서 30분간 반응시킨다.

6) 3~5회 세척한다. 세척중간에 플레이트가 건조되지 않게 주의한다. 마지막 세척이 끝나면 흡습지위에서 플레이트를 톡톡 두드려서 물기를 제거한다.

7) Anti-Porcine:HRPO conjugate를 100㎕씩 분주한다.

8) 5~6번 실시한다.

9) TMB Substrate Solution을 100㎕씩 분주한다.

10) 실온에서 15분간 반응시킨다.

11) Stop Solution을 100㎕씩 분주한다.

12) 플레이트를 650nm에서 판독 한다.

□ 결과 유효조건

1) positive control mean - negative control mean > 0.150

2) negative control mean ≤ 0.150

3) SI에 대한 항체존재 유무는 각 샘플의 S/P ratio를 계산함으로써 결정된다.

※ 계산

ⅰ) Calculation of negative control mean(NCX)

NCX		A1 A(650) + B1 A(650)
	=
		2

ⅱ) Calculation of positive control mean(PCX)

PCX		C1 A(650) + D1 A(650)
	=
		2

ⅲ) Calculation of the (S/P) Ratio

S/P		Sample mean ― NCX
	=
		PCX ― NCX

2. Haemagglutination inhibition test (HI test)

□ 돼지

○ 혈청 전처리(RDE 처리법)

- nonspecific inhibitor의 inactivation을 위해 혈청을 전처리 한다.

1) RDE  1병에 0.85% saline 20㎖를 넣고 잘 녹인다.

☞ RDE - Denka Seiken, 구입시 동결건조상태로 냉장고에 보관되어 있음

2) 녹인 RDE 60ul를 Deep well plate에 분주한다.

3) 혈청을 20㎕씩 넣으면서 피펫팅하여 잘 섞어 준다.

4) 37℃ water bath에서 18시간 반응한다(오후 3시 → 다음날 오전 9시).

5) 56℃ water bath에서 30분간 비동화후 실온에서 식힌다.

6) 0.85% saline 120㎕씩 분주하여 희석배수 1:10을 맞춘다.

☞ Serum : RDE : 0.85% Saline(1:10) = 1 : 3 : 6 = 20㎕ : 60㎕ : 120㎕

□ HI test

○ HI test 검사법

- 사용항원 : 0.01M PBS(pH 7.2)에 희석한 4 HAU/25㎕ HA 항원

1) PBS를  96well plate(U-bottom)의 모든 well에 25㎕씩 분주한다.

2) 전처리한 혈청을 96well plate의  두 well(ex.A1,B1)에 25㎕씩 분주한다.      (양성혈청과 음성혈청을 포함시킨다.) 한 well은 serum control로 작용.

※ RDE 처리한 혈청이 남는다면 잘 기록하고 -70℃에 보관하여 추후      사용할 수 있도록 한다.

3) 2배단계 희석(횡으로)하여 마지막 well은 virus control이 없을 경우        대조로 남겨두기 위하여 25㎕를 버린다.

4) Virus를 8HA unit/50㎕으로 희석하여 역가를 맞춘 것을 25㎕씩          (4HAU), serum control 과 cell control을 제외한 모든 well에  분주한다.

serum control은 antigen 대신  25㎕ PBS를 분주한다. cell control well에는  50㎕ PBS를 분주한다.

☞ HI 시험 시작전 8HA로 희석하여 Back titration을 실시하여 정확하게 희석하였는지 test한 다음 HI test에 이용한다.

5) 손가락 또는 기계를 이용하여 섞어준다.

☞ 반응 용액이 넘쳐서 다른 well에 흘러들어가지 않도록 주의한다.
6) 30~60분 실온에서 반응한다.

7) 0.5% RBC 용액 50㎕씩 분주 후 신속하게 잘 섞어준다.

☞ HI PBS로 50㎖ tube에서 washing을 실시하되 50㎖에서 3회, 15㎖에서   1회 정도 washing을 하는 것이 바람직하고 반드시 백혈구를 충분히 제거  하도록 한다.

☞ 또 하나 적혈구가 용혈되지 않게 조심스럽게 피펫팅을 실시한다.

※ 채혈시 Alsever's solution과 1 : 1 동량으로 혈액을 섞어서 채혈하고,     가급적 당일 신선 혈구를 사용하고 채혈 1주일이내에 한하여 사용하고   남은 것은 버리도록 하자.

8) 정치 20~30분 후 판독한다.

☞ 반드시 plate를 기울였을 때 흘러내리는 well을 양성으로 판정한다.

※ HI titer는 4HA unit 항원을 완전히 억제하는 혈청의 최대희석 배수이다.

9) 결과유효조건

ⅰ) serum control well : no haemagglutination

ⅱ) negative serum : no inhibition

ⅲ) positive serum : anticipated HI titre

ⅳ) HA back titration : 4-8 HAU/25㎕

10) 양성판정 : 1차, 2차 검사결과 4배 이상의 역가상승을 보이는 경우 최근 감염으로 판정한다.

HI Assay에 필요한 Buffer

1. 25X Phosphate Buffer(0.25M)

27.4g Na2HPO4

7.9g  NaH2PO4 ․H2O in 1000ml D.W.(증류수 970ml로 시작)

2. HI용 0.01M PBS (pH 7.2) -- PH 조정할 것

25X Phosphate Buffer 40ml + 8.5g Nacl in 1000ml D.W. 또는

25X Phosphate Buffer 40ml + 20X Nacl 50ml  in 1000ml D.W.

3. 20X Saline: 170g NaCl in 1000ml D.W.(증류수800ml로 시작)

4. 1X saline: 50ml 20X saline + 950ml D.W

<INFLUENZA HI TEST LAYOUT 예시>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1/2 (21)	1/4 (22)	1/8 (23)	1/16 (24)	1/32 (25)	1/64 (26)	1/128 (27)	1/256 (28)	1/512 (29)	1/1024 (210)	1/2048 (211)
A	1
B	1
C	2
D	2
E	P
F	P
G	N
H	N

* yellow : serum control, P: positive serum, N: negative serum,

green : virus control    # cell control : PBS 50㎕ + RBC (별도설정)

참 고 문 헌

1. World Organization for Animal Health (OIE). Manual of diagnostic         tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2009 Chapter 2.8.8.

Availableat:http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.08.08_               SWINE_INFLUENZA.pdf

2. KANSAS STATE VETERINARY DIAGNOSTIC  LABORATORY. Information for     submitting samples for swine influenza testing.

Available at : http://www.vet.ksu.edu/depts/dmp/service/h1n1.htm

3. Trends in emerging viral infections of swine. Chapter 2.1. p27.

4. WHO manual on Animal Influenza diagnosis and surveillance.

5. 미국산 수입돼지 검역대책 보고(알림) : 농림수산검역검사본부 검역검사과(2012.9.21.)

돼지 정액 항원검사
	PCR 진단법
			QIA

1. 유전자 검출(RT-PCR)을 위한 시약 및 장비

RT-PCR를 수행하기 위해 필요한 시약 및 장비 목록은 표 1과 같다. 특히 모든 시약과 재료는 핵산분리에 적합한 것을 선택하여 사용하도록 한다.

표 1. 유전자 검출용 시약 및 장비 목록

구분	시약 및 장비	비 고
시료 전처리	Centrifuge tube (15㎖, 50㎖)
	Microcentrifuge tube (1.5㎖)
	Microcentrifuge
	Centrifuge (15, 50㎖ 用)
	Gloves	손에 알맞은 size 착용
	Microfilter tips (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)	Contamination 방지
	Micropipet (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)	RNA 및 DNA 전용 피펫 구비
	Serological pipettes (5㎖, 10㎖)
	Pipet aid
RNA 추출	RNeasy mini kit	RNA 분리 및 정제
	Microfilter tips (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)
	Micropipet (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)
	Ethanol (absolute)	․Working RPE buffer 제조 ․70% ethanol sol. 제조(핵산 추출용)
	Nuclease-free water	70% ethanol sol. 제조에 사용
	Centrifuge tube (15㎖)
	Microcentrifuge tube (1.5㎖)
	Vortexer
	Microcentrifuge
	Microcentrifuge 用 rack
	Gloves	Contamination 방지
	Safe mat
	70% ethanol solution (일반 소독 用)
	Ice & ice chamber
구분	시약 및 장비	비 고
RNA 보관	RNase inhibitor	RNA 분해방지 및 보관
	Microfilter tips (20㎕ or 10㎕)
	Micropipet (20㎕ or 10㎕)
	Storage box
	-70℃ deep freezer
PCR 반응	PRRSV 유전자 검출 키트
	Microfilter tips (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)
	Micropipet (1000㎕, 200㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕)
	PCR tube 用 rack
	PCR tube
	Positive control DNA
	Nuclease-free water
	Table top microcentrifuge
	PCR machine (Thermal cycler)
전기 영동	Agarose (핵산 전기영동용)
	50X TAE buffer
	1X TAE buffer
	Ethidium Bromide (EtBr) stock solution	10㎎/㎖
	Gel casting system (gel plates, combs 등)
	전기영동 탱크 & Power supply
	Micropipette(20㎕)	핵산 확인용으로 별도구비하여 사용할 것
	Microtips(20㎕)
	1Kb DNA ladder 또는 100bp DNA ladder
	DNA gel-loading buffer(6X)
	Micro 96 well plate or parafilm
판독장치	UV transilluminater
	유전자 촬영 및 영상분석 장치

2. 검사방법

가. 샘플 전처리

1) 유전자 및 RNAse의 오염을 막기 위하여 샘플과 직접적으로 접촉하는 모든 기구 및 시약은 미리 멸균처리한다.

2) 팁은 반드시 필터팁을 사용하여 유전자 및 RNAse의 오염을 최소화한다.

3) 정액시료를 2,000rpm에 10분간 원심분리한다.

4) 상층액 200㎕와 가라앉은 cell pellet을 잘 혼합하여 실험재료로 사용한다.

나. RNA 추출 : RNeasy Mini Kit(Qiagen) 이용

1) 에펜도르프 튜브에 전처리된 200㎕ 샘플과 400㎕ buffer RLT를 넣고 가볍게 pipetting

2) 400㎕ 70% EtOH를 첨가 후 가볍게 pipetting

3) kit내 spin column에 2)번 solution 500㎕를 옮긴 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

4) column을 통과한 collection tube의 solution을 비운 후 재 장착

5) 3번-4번 과정 반복

6) 700㎕ buffer RW1을 column에 첨가 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

7) column을 통과한 collection tube의 solution을 비운 후 재 장착

8) 500㎕ buffer RPE를 column에 첨가 후, 10,000rpm에서 15초간 원심

9) 7번-8번 반복

10) collection tube를 새것으로 교체한 후, 10,000rpm에서 1분간 원심하여 혹시라도 남아 있을 수 있는 buffer RPE를 확실히 제거한다.

11) Spin column을 새로운 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, 30㎕ RNase-free water를 spin column membrane에 첨가한 후, 실온에서 1-2분 방치

12) 10,000rpm에서 1분가 원심하여 RNA를 추출한다.

다. 유전자 증폭

1) PRRSV ORF7 RT- PCR : Median diagnostics kit 이용

: VDx PRRSV ORF7 RT-PCR premix 제품을 이용하여 검사 manual에 따라 검사를 실시한다.

①	건조된 PRRSV ORF7 RT-PCR(cat no.3024) Premix에 PCR grade water 15㎕를 넣고 추출한 유전자 5㎕를 넣어 아래의 PCR Program과 같이 PCR을 실시한다.

② PCR cycle이 종료되면 PCR 증폭산물 5㎕(제품에 loading dye가 첨가되어 있으므로 사용하지 않아도 됨)을 EtBr이 첨가된 1.5% Agarose gel에서 통상적인 방법으로 전기영동한 후 특이 유전자의 존재여부를 확인하다.

③ 정확한 확인검사를 위하여 PRRSV Nested PCR(cat no.3026)를 사용하여 검사한다.

2) PRRSV Nested PCR : Median diagnostics kit 이용

: VDx PRRSV ORF7 Nested PCR premix 제품을 이용하여 검사 manual에 따라 검사를 실시한다.

① 건조된 PRRSV Nested PCR(cat no.3026) Premix에 PCR grade water 19㎕를 넣는다.

② ①에 PRRSV ORF7 RT-PCR에서 증폭된 유전자 1㎕를 첨가하고 아래의 PCR Program과 같이 PCR을 실시한다.(20㎕ reaction)

③ PCR cycle이 종료되면 PCR 증폭산물 5㎕를 EtBr이 첨가된 1.5% Agarose gel에서 전기영동한 후 특이 유전자의 존재여부를 확인하다.

<PCR program>

Step	PRRSV ORF7 RT-PCR			PRRSV Nested PCR
	Temp	Time	Cycle	Temp	Time	Cycle
cDNA synthesis	50℃	30 min	1 cycle	-	-	-
RTase and Initial inactivation	95℃	15 min	1 cycle	94℃	5 min	1 cycle
Denaturation	94℃	20 sec	35 cycles	94℃	20 sec	25 cycles
Annealing	55℃	20 sec		55℃	20 sec
Extension	72℃	30 sec		72℃	30 sec
Final Extension	72℃	10 min	1 cycle	72℃	10 min	1 cycle

3. 결과판정

가. control DNA는 266bp의 증폭산물을 확인한다.

나. 아래표와 같이 특이유전자 밴드가 검출되면 양성으로 판정한다.

<PRRSV 증폭 유전자 판독>

RT-PCR/Nested	Virus	Target gene	PCR product
PRRSV ORF7 RT-PCR	PRRSV US strain	ORF7	433bp
	PRRSV EU strain	ORF7	398bp
PRRSV Nested PCR	PRRSV US strain	ORF7	296bp
	PRRSV EU strain	ORF7	287bp

메디-비스나 Maedi-Visna
면역확산법			AGID
		미국 NVSL, IDEXX

1. Agar 준비

1) 0.85% 생리식염수를 만든다.

NaCl	8g

0.05M Tris buffer, pH 7.2	100ml

2) 생리식염수에 0.7-1% agarose를 첨가하여 완전히 녹을 때까지 끓인다.

3) Agarose용액이 55～60℃로 식을 때까지 기다린 후, 직경 100㎜의 페트리디쉬에 15㎖ 붓는다.

4) 뚜껑을 살짝 덮은 후 실온(20～25℃)에서 1시간 가량 건조시킨다.

5) 한 플레이트당 7개 well로 구성된 pattern 4개를 만든다(그림 참조).

2. 시약 및 가검혈청 분주

1) 중앙의 well에 항원을 분주한다.

2) 둘레 6개의 well 중 교대로 3개의 well에 항혈청을 분주한다.

3) 3개의 well에 가검혈청을 각각 분주한다.

4) 페트리디쉬를 dry chamber에 넣어 뚜껑을 덮고, 실온(20～27℃)에서 24～72시간 동안 감작시키면서 관찰한다.

메디-비스나 AGID Pattern

Ab

Ab

A

Ag

B

C

Ab

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

Ab

Ab

A

Ag

Ab

B

C

부분양성시료

양성시료

음성시료

3. 결과판정 : 불빛 아래에서 먼저 대조혈청을 확인하고 가검혈청을 판독한다.

1) 음성 : 표준침강선이 항원과 항혈청사이에만 나타나고 항원과 가검혈청사이에는 보이지 않음

2) 양성 : 표준침강선이 항원과 가검혈청사이에 보임

3) 약양성 : 표준침강선이 항원을 향해 약간 구부러지거나 항원과 가검혈청사이에 완전한 침강선이 형성되도록 이어지지 않는 경우 (재실험 필요)

4) 강양성 : 표준침강선이 가검혈청에 도달하기전에 항원을 향해 구부러져서 항원과 가검혈청 사이의 모호한 또는 넓은 선으로 이어진 경우(명확한 선을 확인하기 위해서는 가검혈청을 1:4 또는 1:8로 희석하여 재검사한다).

5) 비특이적반응 : 대조침강선과 가검혈청침강선이 교차

메디-비스나 Maedi-Visna
경쟁적효소면역법				cELISA
		VMRD

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온에 꺼내놓는다.

나. 항원이 코팅되어있는 plate에 양성/음성 대조군 및 샘플 혈청을 50㎕씩 2개 well에 분주한 뒤 실온에서 60분간 반응시킨다.

다. 3회 세척한다.

라. conjugate를 모든 well에 50㎕씩 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시킨다.

마. 3회 세척한다.

바. substrate 50㎕씩 분주 후 실온에서 20분간 반응시킨다.

사. stop solution을 50㎕씩 분주한다.

아. ELISA reader기 620～650nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ 음성대조군  평균 OD ≥ 0.3

◦ 양성대조군 결과치 평균 ≥ 35% inhibition

3. 결과 판독

◦ inhibition % I = 100〔1-(샘플 OD ÷ 음성대조군 OD)〕

◦ 샘플혈청 < 35% inhibition 이면  음성

◦ 샘플혈청 ≥ 35% inhibition 이면  음성

메디-비스나 Maedi-Visna
경쟁적효소면역법				cELISA
		IDEXX

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온에 꺼내놓는다.

나. 항원이 코팅되어있는 plate 각 well에 양성/음성 대조군과 샘플혈청 10㎕과 세척액 90㎕을 분주한 뒤 부드럽게 섞어준 후 커버를 덮고 실온(18～25℃)에서 90분간 반응시킨다.

다. 3회 세척한다.

라. conjugate 100㎕를 각각의 well에 분주한다.

마. 커버를 덮고 90분간 반응시킨다.

바. 3회 세척한다.

사. 3회 세척한다.

아. substrate 100㎕씩 분주 후 실온(18～25℃)에서 15분간 반응시킨다.

자. stop solution을 100㎕씩 분주한다.

차. ELISA reader기 450nm에서 결과를 읽는다.

2. 결과의 유효성

◦ 양성대조군 OD치는 2.000을 초과하지 말아야 한다.

◦ 음성대조군 OD치는 0.500를 초과하지 말아야 한다.

◦ 양성대조군과 음성대조군의 차 ≥0.300

◦ stop solution을 첨가한지 2시간 이내에 측정하여야 한다.

3. 결과 판독

ODsample - ODneg

◦ Value(%) =                    × 100%

OD pos  - ODneg

	음 성	의 심	양 성
산 양	< 30%	≥ 30%～40% <	≥ 40%
면 양	< 50%	≥ 50%～60% <	≥ 60%

뉴캣슬병 Newcastle Disease
혈구응집억제반응	Hemagglutination Inhibition Assay
				OIE manual

1. 재료 및 시약

◦ V-bottomed microtitre plate

◦ PBS

◦ 1% 닭적혈구부유액

◦ 항원 : 25㎕당 4HA units가 되도록 희석

2. 실험방법

◦ V형 마이크로플레이트의 각 well에 PBS를 25㎕씩 분주한다.

◦ 첫째 열의 첫 well에 가검혈청 및 대조혈청을 각각 25㎕씩 분주한다

◦ 각 혈청을 2진 단계희석(twofold dilution)한다.

◦ 각 well에 4HA units의 항원을 25㎕씩 분주한다

◦ 4℃에서 60분 또는 실온에서 30분간 감작시킨다.

◦ 1% 닭적혈구부유액을 25μl씩 분주한 후 부드럽게 섞어준다

◦ 4℃에서 60분 또는 실온에서 40분 정치시킨다.

◦ 플레이트를 기울여 항원을 완전히 억제하는 혈청의 최대 희석배수를 HI titer로 기록하며, 혈청대조군의 혈구와 같은 비율로 혈구가 흘러 내릴 때 응집억제가 일어난 것으로 본다.

※ 매 실험마다 항원에 대한 Back titration을 실시하여 사용된 HAU 역가를 확인한다.

3. 결과판독

음성 대조혈청이 1/4(22 또는 log22)보다 큰 역가를 보이지 않아야하고 양성대조혈청은 알려진 역가의 2배수 이내에 있어야 유효하다.

뉴캣슬병 Newcastle Disease
원인체 동정		Virus Identification
				OIE manual

1. 재료 및 시약

◦ 9∼11일령 SPF란

◦ 1% 닭적혈구 부유액

◦ V형 마이크로플레이트

◦ 마이크로피펫

◦ PBS 등

2. 시료준비 및 전처리 방법

□ 조류의 경우, Oro-pharyngeal(또는 tracheal swab)과 총배설강 swab(또는 분변)을 채취하고 폐사체의 경우, 부검한 조직(폐, 간, 신장, 장(내용물 포함), 맹장 편도 등)도 무균적으로 채취한다. 채취가 매우 힘든 조류의 경우 신선한 분변을 적용할 수 있다.

- 채취한 시료는 즉시 냉장(4℃ 권장) 상태로 두고, 신속히 실험실로 운반한다.

- 시료는 항생제가 첨가된 PBS (Brain-heart infusion(BHI) 또는 Tris-buffered tryptose broth(TBTB) 등 배지 사용가능) 용액으로 처리하되, 분변이나 조직의 경우 10~20% (W/v) 유제액으로 만들어 1000g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다.

□ 부화용 시료란의 경우, 부란기에 넣고 7일간 부화시키면서 날마다 검란하고, 부화기간중 중지란과, 7일째 되는 날 중지란을 취하여 냉장(4시간 ~overnight) 후, 요막강액(allantoic fluid)을 무균적으로 채취하여 혈구응집능력을 검사하고, 동시에 혈액배지에 접종하여 세균 오염 여부를 검사한다. 채취한 요막강액은 원심분리한 후 상층액을 취한다.

◦ 바이러스 분리검사

- 전처리된 상층액을 필터하여 접종액을 준비하여 5개 이상의 9~11령의 SPF 발육란에 0.2ml씩 allantoic cavity에 접종하고 35∼37℃에서 4~7일간 배양한다.

- 배양기간동안 매일 검란을 실시하며, 죽은 종란과 배양완료일까지 살아남은 종란은 4℃에서 냉장(4시간 ~overnight) 후, 요막강액(allantoic fluid)을 무균적으로 채취하여 혈구응집능력(HA)을 검사한다.

- HA test에서 음성을 보인 시료는 최소한 한번 이상 계대 배양한다.

- HA test에서 양성 반응을 보인 시료는 양성혈청에 대하여 HI test를 실시하거나, RNA를 분리한 후, RT-PCR을 실시한다.

3. 부록

◦ 혈구응집반응검사

- V형 마이크로플레이트의 전체 well에 PBS를 25㎕씩 분주한다.

- 첫째 열의 첫 well에 검사대상 항원 또는 가검시료를 각각 25㎕씩 분주한다.

- 각각의 항원 또는 가검시료를 이진희석한다.

- 전체 well에 PBS 25㎕를 추가로 분주한다.

- 전체 well에 1% 닭적혈구를 25㎕씩 분주한다.

- Plate를 잘 섞어준다.

- 뚜껑을 덮고 4℃에서 60분 또는 실온에서 40분간 반응시킨다.

- 마이크로플레이트를 기울여 최종역가를 기록하며 각 열에서 적혈구가 움직이지 않는 마지막 well을 읽어 이때를 1HA unit로 기록한다.

닭전염성기관염 Avian Infectious Bronchitis
혈구응집억제반응법	Hemagglutination Test
				OIE manual

1.  재료 및 시약

◦ V-bottomed microtitre plate

◦ PBS (pH 7.0-7.4)

◦ 혈구부유액 : SPF 닭에서 채혈한 후 Alsever's solution에 모아 3회 세척(1,000g 10분 원심분리)한 후 검사 당일 1%로 희석하여 사용

◦ 항원 : 25㎕당 4HA units가 되도록 희석

◦ 혈청 : 56℃에서 30분간 비동화

2. 실험방법

◦ 25㎕의 PBS를 모든 well에 분주한 후 각 열의 첫 번째 well에 가검혈청 및 대조혈청을 25㎕씩 분주한다

◦ 각 혈청을 2진 단계희석(two-fold dilution)한다.

◦ 각 well에 4HAU의 항원을 25㎕씩 분주한다.

◦ 실온에서 30분간 감작시킨다.

◦ 혈구부유액을 25㎕씩 분주하고 잘 섞어준 후, 실온에서 40분간 정치시킨다.

※ 매 실험마다 항원에 대한 Back titration을 실시하여 사용된 바이러스의 역가를 확인한다.

3. 결과판독

◦ HI 역가는 4HAU 항원을 완전히 억제하는 혈청의 최대 희석배수이다.

◦ 혈청역가가 24 이상이면 양성으로 판정한다.

◦ 음성 대조혈청이 1/4(22 또는 log22)보다 큰 역가를 보이지 않아야하고 양성대조혈청은 알려진 역가의 2배수(one dilution) 이내에 있어야 유효하다.

닭전염성에프(F)낭병 Infectious Bursal Disease
면역확산법			AGID
		QIA

1. 재료의 준비

1) Gel medium의 제조

Sodium Barbital	6.98g

Barium chloride(anhydrous)	6.0g

1,000㎖의 증류수를 가하여 완전히 녹인 후, pH를 7.4로 맞춘다.

2)한천의 준비

NaCl	7.4g

Sodium Azide	1g

purified Agar	10g

Gel medium	1,000㎖

① Gel medium 1,000㎖에 NaCl과 Sodium Azide를 넣어 녹인다.

② purified Agar를 첨가하고 완전히 녹을 때까지 끓인 후 멸균 실험관에 22㎖씩 분주하여 5℃에 보관한다.

③ 사용직전 꺼내어 끓는 물에 중탕하여 완전히 녹인 후 페트리디쉬에 부어 평평한 장소에서 굳힌다.

2. 시험방법

① Gel 펀치(간격8㎜, 직경2㎜)를 이용하여 well을 뚫고 진공펌프로 빨아낸다.

② 항원을 중앙의 well에 볼록하게 솟아오르도록 넣고 humid chamber에서 30분～1시간 정도 둔 후 주변 well에 대조 혈청과 가검시료 혈청을 교대로 넣는다.

③ Gel이 건조되지 않도록 일정한 습도가 유지되는 용기(humid chamber)에 넣고 뚜껑을 덮은 후 실온에 둔다.

④ 24～72시간 동안 관찰하여 가검혈청과 항원 사이에 띠가 생기면 양성으로 판정하고 주변 표준혈청의 띠와 교차되면 양성으로 판정할 수 없다.

⑤ 판독 시에는 페트리디쉬를 전등빛에 비추어 관찰한다.

닭전염성F낭병 AGID Pattern

C

A

Ab

Ag

Ab

B

Ab

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

Ab

양성시료

C

Ab

Ag

Ab

부분양성시료

B

A

음성시료

닭전염성후두기관염 Infectious Laryngotracheitis
면역확산법			AGID
		OIE Manual

1. 재료의 준비

NaCl	80g

Sodium Azide	0.2g

Noble Agar	15g

DW	1,000㎖

① 증류수 1,000㎖에 NaCl과 Sodium Azide를 넣어 녹인다.

② Noble Agar를 첨가하여 고압멸균하고 식힌 후 페트리디쉬에 부어 평평한 장소에서 굳힌다.

2. 시험방법

① Gel 펀치(간격4㎜, 직경8㎜)를 이용하여 well을 뚫고 진공펌프로 빨아낸다.

② 항원을 중앙의 well에 볼록하게 솟아 오르도록 넣고 humid chamber에서 30분∼1시간 정도 둔 후 주변 well에 대조 혈청과 가검시료 혈청을 교대로 넣는다.

③ Gel이 건조되지 않도록 일정한 습도가 유지되는 용기(humid chamber)에 넣고 뚜껑을 덮은 후 실온에 둔다.

④ 24∼48시간 동안 관찰하여 가검혈청과 항원 사이에 띠가 생기면 양성으로 판정하고 주변 표준혈청의 띠와 교차되면 양성으로 판정할 수 없다.

⑤ 판독 시에는 페트리디쉬를 전등빛에 비추어 관찰한다.

닭전염성후두기관염 AGID Pattern

C

A

Ab

Ag

Ab

B

Ab

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

Ab

양성시료

C

Ab

Ag

Ab

부분양성시료

B

A

음성시료

닭전염성후두기관염 Infectious Laryngotracheitis
효소면역법				ELISA
		프랑스 SYNBIOTICS

I. 원리

1. 닭전염성후두기관염 특이항원이 코팅된 well에 가검혈청을 분주한다. 닭전염성후두기관염 항원에 대한 항체가 시료내에 존재하면 코팅된 항원에 특이적으로 결합한다.

2. 세척 후에 anti-ILT monoclonal antibody peroxidase conjugate를 분주한다.

conjugate는 황체와 결합하지 않은 항원과 결합할 것이다.

3. 세척하여 과도 conjugate를 제거한다. Substrate를 분주하여 발색을 관찰한다.

O.D.를 측정하여 다음에 따라 결과를 판독한다:

■ 시료에 항체가 존재하지 않으면 conjugate가 강하게 발색한다.

■ 시료에 항체가 존재하면 conjugate가 항원에 결합하는 비율이 적어져 발색이 흐리다.

Ⅱ. KIT의 구성물 및 보관

- KIT는 5℃±3℃에 보관하여야 한다.

Ⅲ. 필요한 시약 및 재료(KIT에 공급되지 않는 것)

- 증류수 또는 초순수

- 0~1000㎕ 피펫

- 매스실린더(100㎖ 및 1000㎖)

- 플레이트 세척기

- 플레이트 판독기(450㎚, 630㎚)

Ⅳ. 주의사항

- 유효기간이 지난 시약은 사용하지 말 것

- 다른 batch의 시약을 섞어서 사용하지 말 것

- 모든 시약은 사용하지 직전에 실온에서 1시간 동안 정치시켜 둔다.

- 시약은 조심하여 재부유시킨다.

- 사용하는 장비 및 기구는 완벽하여야 한다.

- 시료와 시료간의 오염에 주의해야 한다.

- 희석과 분주를 정확히 한다.

- 입으로 피펫팅하지 않는다.

- Substrate와 stopping solution에 접촉하지 않도록 주의한다.

- 모든 소모품 및 시료는 금방 제조한 5% sodium hypochlorite에 1시간 이상 담가 놓거나, 120℃에서 1시간 이상 고압 멸균하여 폐기한다.

- 다음의 조작 중에는 특히 주의한다.

■ 세척

제시된 최소한의 세척 횟수를 반드시 지킨다. 모든 well에 세척액을 300㎕가 되도록 분주하고 제거 시는 완벽하게 제거한다. 수동식보다는 자동 세척기를 사용하여 각 세척기마다 불필요하게 기다리는 시간 없이 연이어 세척한다. 세척 시 분주기를 이용하는 것은 좋지 않다.

■ 발색제 분주

발색제가 금속, 산화물, 세정제에 오염되지 않도록 한다. 모든 용기는 깨끗하여야 한다. Conjugate와 substrate를 같은 tip으로 분주하면 안된다.

■ 판독

이중필터를 이용한 측정이 권장된다. 단일필터로만 측정하는 경우에는 플레이트의 바닥을 반드시 깨끗이 닦아야 한다.

Ⅴ. 시료

혈청은 5℃±3℃에 보존한다. 장기간 혈청을 보관할 때는 -20℃에서 보관한다.

Ⅵ. 검사방법

아래의 검사방법을 엄격하게 따른다. 양성 및 음성혈청은 복수로 실험한다.

A. 준비단계

1. 플레이트 상에서 대조혈청과 시료의 위치를 정확히 기록한다.

2. 가검혈청 및 대조음성혈청을 dilution plate에 dilution buffer로 1:50으로 희석(혈청 6㎕ + buffer 300㎕)한다. 대조 양성혈청은 에펜도르프 튜브에 1:50으로 희석한다.

3. 희석 플레이트를 최소 5분간 정치하고 24시간내 실험한다.

B. 본 검사

1. AE 항원이 코팅되어 있는 검사 플레이트에 dilution buffer를 50㎕씩 분주한다.

2. 이미 1:50으로 희석된 대조혈청(음성 및 양성)과 가검혈청을 각 well에 50㎕씩 옮긴다. (최종적인 혈청희석 배수는 1:100)

3. 실온에서 30분간 반응시킨다.

4. 증류수로 1:20으로 희석한 세척액을 well당 300ul씩 분주하고 3분간 정치시킨 후 플레이트를 털어낸다. 이 과정을 2회 추가 실시한 후 플레이트를 가볍게 두드려 잔여 세척액을 완전히 제거한다.

5. Dilution buffer로 1:100 희석된 conjugate를 well당 100㎕씩 분주한다.

6. 실온에서 30분간 반응시킨다.

7. 4번과 같이 플레이트를 세척한다.

8. 발색액을 100㎕씩 분주하고 실온에서 15분간 반응시킨다.

9. 증류수로 1:5로 희석한 Stop solution을 10050ul씩 분주하고 405㎚ ~410㎚에서 흡광도를 측정한다.

Ⅶ. 검사결과 판정

- 교정 양성대조혈청 흡광도 : 양성대조혈청 흡광도 - 음성대조혈청 흡광도

- Sp ratio 계산법

가검혈청 흡광도 - 음성 대조혈청 흡광도

%Sp =  ------------------------------------------------------------------

교정 양성대조 혈청 흡광도

- 역가계산법

LOG10 Titre= (1.450 X LOG10 Sp) + 3.726

Titre = Antilog of LOG10 Titre

ex) 양성 대조혈청 흡광도 : 0.585, 0.61, 0.59인 경우 평균 0.595

음성 대조혈청 흡광도 : 0.078, 0.067, 0.057인 경우 평균 0.067

교정 양성 대조혈청 흡광도 : 0.595 - 0.067 = 0.528

Sp 값 : (0.56)- (0.067) / (0.528) = 0.934

역가계산 : LOG10 Titre = 1.45 x (Log10 0.934) + 3.726

Titre = ANTILOG 3.68

Titre = 4820

- 결과판정

Sp 값이 0.15와 같거나 낮으면 음성이며 0.15보다 높으면 양성으로 판정한다.

Ⅷ. 검사유효범위

1. 음성 대조혈청의 O.D.값이 0.2이하이고, 양성대조혈청의 O.D.값에서 음성대조혈청의 O.D.값을 뺀 값이 0.25~0.9사이여야 한다.

2. 이상적인 조건하에서 실험된 경우 음성 대조혈청의 O.D.값은 0.06~ 0.08이며, 양성대조혈청의 O.D.값에서 음성대조혈청의 O.D.값을 뺀 값은 0.4~0.75사이다.

닭전염성후두기관염 Infectious Laryngotracheitis
바이러스중화시험				VN Test
			미국 NVSL

1. 바이러스 중화시험은 9∼11일령의 계태아의 융모막에서의 ILT 바이러스에 의한 포크형성을 특징적으로 중화하는지의 여부로서 항체유무를 판단한다.

2. 또다른 방법으로는 배양세포에서의 바이러스로 인한 세포변성 효과의 중화여부로서 항체를 검사하며 바이러스 일정량과 이진희석한 혈청과 반응시켜 검사한다.

3. 두 검사방법 모두 100배의 50% 계란 평균 감염량 또는 100배의 50% 평균 세포감염량을 중화시험용 바이러스양으로 사용한다.

4. 바이러스와 혈청 혼합액을 중화가 일어나도록 37℃에서 1시간 배양하여 계란에서 중화시험을 수행할 경우에는 계란의 융모막에 접종하고 계란을 밀봉하여 37℃에서 6∼7일간 배양하여 융모막에서 포크가 억제되는 최고 희석배수를 중화 항체가로 판단한다.

5. 배양세포에서 중화시험을 할 경우에는 96well 세포배양 플레이트에서 혈청을 계단희석한 다음 바이러스를 혼합하여 중화시키고 계태아 간세포 혹은 계태아 신장세포를 넣어준다.

6. 37℃에서 배양하면서 약 4일 후에 중화여부를 판단하는데 바이러스 역가가 30~300 TCID50사이여야 하며 8배 희석배수부터 양성으로 판정한다.

닭뇌척수염 Avian encephalomyelitis
면역확산법				AGID
			QIA

1. 재료의 준비

1) Gel medium의 제조

Sodium Barbital	6.98g

Barium chloride(anhydrous)	6.0g

1,000㎖의 증류수를 가하여 완전히 녹인 후, pH를 7.4로 맞춘다.

2) 한천의 준비

NaCl	7.4g

Sodium Azide	1g

purified Agar	10g

Gel medium	1,000㎖

① Gel medium 1,000㎖에 NaCl과 Sodium Azide를 넣어 녹인다.

② purified Agar를 첨가하고 완전히 녹을 때까지 끓인 후 멸균 실험관에 22㎖씩 분주하여 5℃에 보관한다.

③ 사용직전 꺼내어 끓는 물에 중탕하여 완전히 녹인 후 페트리디쉬에 부어 평평한 장소에서 굳힌다.

2. 시험방법

① Gel 펀치(간격 8㎜, 직경 2㎜)를 이용하여 well을 뚫고 진공펌프로 빨아낸다.

② 항원을 중앙의 well에 볼록하게 솟아 오르도록 넣고 humid chamber에서 30분～1시간 정도 둔 후 주변 well에 대조 혈청과 가검시료 혈청을 교대로 넣는다.

③ Gel이 건조되지 않도록 일정한 습도가 유지되는 용기(humid chamber)에 넣고 뚜껑을 덮은 후 실온에 둔다.

④ 24～72시간 동안 관찰하여 가검혈청과 항원사이에 띠가 생기면 양성으로 판정하고 주변 표준혈청의 띠와 교차되면 양성으로 판정할 수 없다.

⑤ 판독시에는 페트리디쉬를 전등빛에 비추어 관찰한다.

닭 뇌척수염 AGID Pattern

C

A

Ab

Ag

Ab

B

Ab

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

양성시료

부분양성시료

음성시료

Ab

C

Ab

Ag

Ab

B

A

닭뇌척수염 Avian encephalomyelitis
효소면역법				ELISA
		프랑스 SYNBIOTICS

Ⅰ. 원리

1. 닭뇌척수염 특이항원이 코팅된 well에 가검혈청을 분주한다. 닭뇌척수염 항원에 대한 항체가 시료에 존재하면 코팅된 항원에 특이적으로 결합한다.

2. 세척후에 anti-AE monoclonal antibody peroxidase conjugate를 분주한다. 이 conjugate는 항체와 결합하지 않은 항원과 결합하는 것이다.

3. 세척하여 과도 conjugate를 제거한다. Substrate를 분주하여 발색을 관찰한다. O.D.를 측정하여 다음에 따라 결과를 판독한다:

■ 시료에 항체가 존재하지 않으면 conjugate가 강하게 발색한다.

■ 시료에 항체가 존재하면 conjugate가 항원에 결합하는 비율이 적어져 발색이 흐리다.

Ⅱ. KIT의 구성물 및 보관

KIT는 5℃± 3℃에 보관하여야 한다.

Ⅲ. 필요한 시약 및 재료(KIT에 공급되지 않은 것)

- 증류수 또는 초순수

- 0～1000ul 피펫

- 매스실린더(100ml 및 1000ml)

- 플레이트세척기

- 플레이트판독기(450nm, 630nm)

Ⅳ. 주의사항

- 유효기간이 지난 시약을 사용하지 말 것

- 다른 batch의 시약을 섞어서 사용하지 말 것

- 모든 시약은 사용하기 직전에 실온에서 1시간동안 정치시켜 둔다

- 시약은 조심하여 재부유 시킨다

- 사용하는 장비 및 기구는 완벽하여야 한다

- 시료와 시료간의 오염에 주의하여야 한다

- 희석과 분주를 정확히 한다

- 입으로 피펫팅하지 않는다

- Substrate와 stopping solution에 접촉하지 않도록 주의한다

- 모든 소모품 및 시료는 금방 제조한 5% sodium hypochlorite에 1시간 이상동안 담가놓거나 120℃에서 1시간 이상 고압멸균하여 폐기한다.

- 다음의 조작 중에는 특히 주의한다.

■ 세척

제시된 최소한의 세척횟수를 반드시 지킨다. 모든 well에 세척액을 400ul가 되도록 분주하고 제거시는 완벽하게 제거한다. 수동식보다는 자동 세척기를 사용하여 각 세척기 마다 불필요하게 기다리는 시간없이 연이어 세척한다. 세척시 분주기를 이용하는 것은 좋지 않다.

■ 발색제 분주

발색제가 금속, 산화물질, 세정제에 오염되지 않도록 한다. 모든 용기는 깨끗하여야 한다. Conjugate와 substrate를 같은 tip으로 분주하면 안된다.

■ 판독

이중필터를 이용한 측정이 권장된다. 단일필터로만 측정하는 경우에는 플레이트의 바닥을 반드시 깨끗이 닦아야 한다.

Ⅴ. 시료

혈청은 5℃±3℃에서 보존한다. 장기간 혈청을 보관할 때는 -20℃에서 보관한다.

Ⅵ. 검사방법

아래의 검사방법을 엄격하게 따른다. 양성 및 음성혈청은 복수로 실험한다.

A. 준비단계

1. 플레이트 상에서 대조혈청과 시료의 위치를 정확히 기록한다.

2. 가검혈청 및 대조음성혈청을 dilution plate에 dilution buffer로 1:50으로 희석(혈청 6㎕ + buffer 300㎕)한다. 대조 양성혈청은 에펜도르프 튜브에 1:50으로 희석한다.

3. 희석 플레이트를 최소 5분간 정치하고 24시간내 실험한다.

B. 본 검사

1. AE 항원이 코팅되어 있는 검사 플레이트에 dilution buffer를 50㎕씩 분주한다.

2. 이미 1:50으로 희석된 대조혈청(음성 및 양성)과 가검혈청을 각 well에 50㎕씩 옮긴다. (최종적인 혈청희석 배수는 1:100)

3. 실온에서 30분간 반응시킨다.

4. 증류수로 1:20으로 희석한 세척액을 well당 300㎕씩 분주하고 3분간 정치시킨 후 플레이트를 털어낸다. 이 과정을 2회 추가 실시한 후 플레이트를 가볍게 두드려 잔여 세척액을 완전히 제거한다.

5. Dilution buffer로 1:100 희석된 conjugate를 well당 100㎕씩 분주한다.

6. 실온에서 30분간 반응시킨다.

7. 4번과 같이 플레이트를 세척한다.

8. 발색액을 100㎕씩 분주하고 실온에서 15분간 반응시킨다.

9. 증류수로 1:5로 희석한 Stop solution 100㎕씩을 분주하고  405㎚m ~410㎚에서 흡광도를 측정한다.

Ⅶ. 검사결과 판정

- 교정 양성대조혈청 흡광도 : 양성대조혈청 흡광도 - 음성대조혈청 흡광도

- Sp ratio 계산법

가검혈청 흡광도 - 음성 대조혈청 흡광도

%Sp =  --------------------------------------------------------------

교정 양성대조 혈청 흡광도

- 역가계산법

LOG10 Titre= (0.717 X LOG10 Sp) + 3.906

Titre = Antilog of LOG10 Titre

ex) 양성 대조혈청 흡광도 : 0.585, 0.61, 0.59인 경우 평균 0.595

음성 대조혈청 흡광도 : 0.078, 0.067, 0.057인 경우 평균 0.067

교정 양성 대조혈청 흡광도 : 0.595 - 0.067 = 0.528

Sp 값 : (0.56)- (0.067) / (0.528) = 0.934

역가계산 : LOG10 Titre = 0.717 x (Log10 0.934) + 3.906

Titre = ANTILOG 3.88

Titre = 7669

- 결과판정

Sp 값이 0.3과 같거나 낮으면 음성이며 0.3보다 높으면 양성으로 판정한다.

Ⅷ. 검사유효범위

1. 음성 대조혈청의 O.D.값이 0.2이하이고, 양성대조혈청의 O.D.값에서 음성대조혈청의 O.D.값을 뺀 값이 0.25~0.9사이여야 한다.

2. 이상적인 조건하에서 실험된 경우 음성 대조혈청의 O.D.값은 0.06~ 0.13이며, 양성대조혈청의 O.D.값에서 음성대조혈청의 O.D.값을 뺀 값은 0.35~0.9사이다.

조류인플루엔자 Avian influenza
원인체 동정	Virus Identification
			OIE manual

1. 재료 및 시약

◦ 9∼11일령 SPF란 또는 SNF란

◦ HA 및 HI test 용 V형 플레이트, 닭 적혈구, PBS 등

2. 실험방법

◦ 샘플채취 및 전처리

〔조류〕

- 구강(oropharyngeal) swab과 분변(또는 총배설강(cloacal) swab)을 채취하고, 폐사체의 경우, 부검한 조직(기관, 폐, 신장, 맹장 편도 등)도 무균적으로 채취한다.

- 채취한 시료는 즉시 냉장(4℃ 권장) 상태로 두고, 신속히 실험실로 운반한다.

- 시료는 항생제가 첨가된 PBS등의 용액으로 처리하되, 분변이나 조직의 경우 10~20% (W/v) 유제액으로 만들어 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다.

〔가금육〕

-냉동상태의 시료를 해동하여 흘러나온 육즙을 멸균용기에 취하고 각각의 시료로부터 25g씩 채취· 분쇄하여 육즙(육즙이 없을 경우 항생제가 첨가된 PBS등의 용액)과 혼합한 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다.

〔종란〕

- 부화용 시료란의 경우, 부란기에 넣고 7일간 부화시키면서 날마다 검란하고, 부화기간중 중지란과, 7일째 되는 날 중지란을 취하여 냉장(4시간 ~overnight) 후, 요막강액( allantoic fluid)을 무균적으로 채취하여 혈구응집능력을 검사하고, 동시에 혈액배지에 접종하여 세균 오염 여부를 검사한다. 채취한 요막강액은 원심분리한 후 상층액을 취한다.

- 상층액은 신속히 실험하되, 남은 시료는 -70℃ 이하에서 보관하며, 잦은 동결과 해동은 피한다.

◦ 바이러스 분리검사

〔종란접종〕

- 전처리된 상층액을 필터하여 접종액을 준비하고 9~11령의 SPF(specific pathogen free) 또는 SAN(specific antibody negative) 발육계란에 0.2ml씩 allantoic cavity에 접종하여 37℃에서 4~7일간 배양한다.

- 배양기간동안 매일 검란을 실시하며, 죽은 종란과 배양완료일까지 살아남은 종란은 4℃에서 냉장(4시간 ~overnight) 후,  요막강액(allantoic fluid)을 무균적으로 채취하여 혈구응집능력(HA)을 검사한다. 접종 24시간 이내에 접종사로 죽은 란은 폐기한다.

- HA test에서 음성을 보인 시료는 최소한 한번 이상 더 SPF 또는 SAN 종란에 계대 배양한다.

- HA test에서 양성 반응을 보인 시료는 조류인플루엔자 양성혈청에 대하여 HI test와 AGID test를 실시하거나, 상층액에서 RNA를 분리한 후, 조류인플루엔자 NP (nucleoprotein) 특이 또는 M (Matrix) 특이 유전자에 대한 RT-PCR 또는 rRT-PCR을 이용하여 확인하고, 양성일 경우, H5 또는 H7형 조류인플루엔자 진단을 위한 유전자 검사를 실시한다.

- 시료는 3000rpm에서 10분동안 원심분리 후, -70℃에서 보관한다.

- 세균 오염여부 검사를 위해서는 혈액배지에 시료를 접종시켜 확인한다.

◦ 유전자검사

- 전처리된 시료 및 HA 양성 요막액을 RNA extraction kit (Qiagen, iNtRon  등)을 이용하여 RNA를 추출한 후 인플루엔자 공통항원에 대한 PCR 검사를 실시한다.

RT-PCR 반응

Target gene	Primer sequences	Product size	비고
NP gene	MMU42 CATCCCAGTGCTGGGAARGAYCCTAAGA MMU43 AGAGCTCTTGTTCTCTGATAGGTC	218bp
M gene	M52C: CTTCTAACCGAGGTCGAAACG M253R: AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA	244bp
RT PCR 조건	50℃ 30min, 95℃ 15min 35cycle (94℃, 20sec, 50℃ 20sec, 72℃ 30sec), 72℃ 10min	*One-step RT-PCR kit (Qiagen) 조건, 사용 kit에 따라 조건 변경 가능함.

* A형 인플루엔자에 대한 공통유전자검사가 가능한  시판 진단 kit 이용 가능.

- PCR 결과 판독

: 1.5% ~2% agarose gel로 전기영동하여 AIV 특이 유전자증폭을 확인하고, 양성일 경우, H5 또는 H7형 조류인플루엔자 진단을 위한 유전자 검사를 실시한다.

3. 부록

◦ 혈구응집반응검사

- V형 마이크로플레이트의 전체 well에 PBS를 25㎕씩 분주한다.

- 첫째 열의 첫 well에 시료를 각각 25㎕씩 분주한다(플레이트의 가로방향으로)

- 이진희석(twofold dilution)한다.

- 추가로 각각의 well에 PBS를 25㎕씩 분주한다.

- 각각의 well에 신선한 1%(v/v) 닭적혈구를 25㎕씩 분주한다.

- Plate를 부드럽게 흔들어 잘 섞어 준다.

- 뚜껑을 덮고 실온에서 40분간 또는 4℃에서 60분간 반응시킨다.

- 마이크로플레이트를 기울여 최종역가를 기록하며 각 열에서 적혈구가 움직이지 않는 마지막 well을 읽어 이때를 1HA unit로 기록한다.

- 검사용 항원에서 필요한 희석배수를 알려면 항원의 정해진 역가를 검사하기 위해 필요한 지정된 HA unit(4HAU)로 나눈다.

◦ 혈구응집억제반응검사

- V형 마이크로플레이트의 각 well에 PBS를 25㎕씩 분주한다.

- 첫째 열의 첫 well 및 두 번째 well에 검사대상 혈청과 대조군혈청을 25㎕씩         분주한다.

* 각각의 플레이트에는 혈청대조군과 항원대조군을 둔다.

- 두 번째 well부터 이진희석한다.

- 혈청대조군과 항원대조군을 제외한 모든 well에 희석된 항원(4HAU)을 25㎕씩 분주한다.

- 뚜껑을 덮고 4℃에서 60분 또는 실온에서 30분간 반응시킨다.

- 신선한 1%(v/v) 닭적혈구를 전체 well에 25㎕씩 분주하고 잘 섞어준다.

- 뚜껑을 덮고 4℃에서 60분 또는 실온에서 40분간 반응시킨다.

- 플레이트를 기울여 항원을 완전히 억제하는 혈청의 최대 희석배수를 HI titer로 기록하며, 혈청대조군(RBC25㎕와 PBS 50㎕ 첨가 well)의 혈구와 같은 비율로 혈구가 흘러 내릴 때 응집억제가 일어난 것으로 본다.

- 유효성 판정 기준: 음성 대조혈청이 1/4(22 또는 log22)보다 큰 역가를 보이지 않아야하고 양성대조혈청은 알려진 역가의 2배수 이내에 있어야 유효하다.

※ 매 실험마다 항원에 대한 Back titration을 실시하여 사용된 HAU 역가를 확인하며, 실험방법에 따라, 희석된 항원으로 8HAU 사용도 가능함.

참고자료

- 수출입 동물 및 축산물의 전염병 정밀검사 방법, 농림수산검역검사본부 예규 제77호 (제2012년 3월 26일)

- Avian Influenza, OIE terrestrial Manual 2002, chapter 2.3.4.

- Detection of Influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the Matrix gene. Foucheir et al., JCM, Nov.2000, p.4096-4101

- Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR-ELISA, Munch et al., Arch Virol (2001) 146: 87-97

, 2009.9.21.)

조류인플루엔자 Avian Influenza
면역확산법				AGID
			미국 NVSL

1. 준비물

° Agarose 또는 purified agar	10g

° NaCl	80g

° 0.1M Phosphate buffer, pH7.2	1ℓ

° Avian influenza AGID antigen and antiserum

- Agarose를 첨가한 후 완전히 녹을 때까지 끊인다.

- 배지를 petri dish에 2∼3mm 두께로 분주한 후 식힌다.

2. 실험

° Well의 직경이 5㎜, well간 간격이 2∼5㎜가 되도록 패턴을 만들어 진공펌프로 well내의 배지를 깨끗이 제거한다.

° 정해진 well에 항원과 대조혈청 및 가검시료를 분주한다.

° Humid chamber에 페트리디쉬를 넣고 뚜껑을 닫은 후 실온에서 24∼48시간 동안 감작시키면서 관찰한다.

3. 결과판정 : 불빛 아래에서 먼저 대조 혈청을 확인하고 가검혈청을 판독한다.

1) 음성 : 표준침강선이 항원과 항혈청사이에만 나타나고 항원과 가검혈청 사이에는 보이지 않음

2) 양성 : 표준침강선이 항원과 가검혈청 사이에 보임

3) 약양성 : 표준침강선이 항원을 향해 약간 구부러지거나 항원과 가검혈청 사이에 완전한 침강선이 형성되도록 이어지지 않는 경우(재실험 필요)

4) 강양성 : 표준침강선이 가검혈청에 도달하기 전에 항원을 향해 구부러져서 항원과 가검혈청 사이의 모호한 또는 넓은 선으로 이어진 경우(명확한 선을 확인하기 위해서는 가검혈청을 1:4 또는 1:8로 희석하여 재검사 한다).

5) 비특이적반응 : 대조침강선과 가검혈청 침강선이 교차

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

C

Ab

Ag

Ab

B

A

양성시료

부분양성시료

음성시료

Ab

마렉병 Marek's Disease
면역확산법				AGID
			OIE manual

1. Agar 준비

1) 8% NaCl이 첨가된 생리식염수를 만든다.

NaCl	80g

PBS	1000ml

2) 생리식염수에 1%의 Difco Bactoagar를 첨가하여 완전히 녹을 때까지 끊인다.

3) Agar 용액이 55-60℃로 식을 때가지 기다린 후 petri dish에 15ml 붓는다.

4) 뚜껑을 살짝 덮은 후 실온에서(20-25℃)에서 1시간 가량 건조시킨다.

5) Petri dish에 7개 well(직경5.3mm, 간격 2.4mm)로 구성된 pattern 4개를 만든다 (결과 판정 참조).

2. 시약 및 가검혈청 분주

1) 중앙의 well에 항원을 분주한다.

2) 둘레 6개의 well에 교대로 3개의 well에 항혈청을 분주한다.

3) 3개의 well에 가검혈청을 분주한다.

4) petri dish를 humid chamber에 정치하여 37℃에서 24시간 동안 감작시킨다.

3. 결과판정 : 불빛 아래에서 먼저 대조 혈청을 확인하고 가검혈청을 판독한다.

1) 음성 : 표준침강선이 항원과 항혈청사이에만 나타나고 항원과 가검혈청 사이에는 보이지 않음

2) 양성 : 표준침강선이 항원과 가검혈청 사이에 보임

3) 약양성 : 표준침강선이 항원을 향해 약간 구부러지거나 항원과 가검혈청 사이에 완전한 침강선이 형성되지 않는 경우(재실험 필요)

4) 강양성 : 표준침강선이 가검혈청에 도달하기 전에 항원을 향해 구부러져서 항원과 가검혈청 사이의 모호한 또는 넓은 선으로 이어진 경우(명확한 선을 확인하기 위해서는 가검혈청을 1:4 또는 1:8로 희석하여 재검사 한다).

5) 비특이적반응 : 대조침강선과 가검혈청 침강선이 교차

결과 판정

Ab : 표준 혈청

Ag : 표준 항원

A, B, C : 시료 혈청

Ab

Ab

A

Ag

Ab

B

C

부분양성시료

양성시료

음성시료

광견병항체가검사법 Rabies Antibody titer test
	형광 항체 바이러스 중화법
Fluorescnet Antibody virus Neutralisation Test(FAVNT)-OIE

1. 개요 및 목적

항체검사법은 혈청 중에 존재하는 광견병 바이러스에 대한 중화항체를 검출하는 방법이다. 항체검사법은 광견병 감염여무를 판별하기 위한 검사가 아니며, 동물의 국가 간 이동전 백신에 대한 견고한 면역반응이 형성되었는지를  확인하는 방법으로 규정되어 있다. 광견병 항체검사로는 fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVNT), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) ELISA를 공인검사법으로 인정하고 있다. 검사결과는 국제기준 혈청에 상응하는 International Unit(IU)으로 기재된다.

2. 실험방법

□ 형광항체중화시험(fluorescent antibody virus neutralisation test, FAVNT)

FAVNT은 rabies virus에 감수성이 있는 세포에 일정량의 rabies virus를 반응시킨 in     vitro 중화반응이다. 혈청의 역가는 virus 100%가 50%로 중화되었을 때의 희석역가이    며 같은 실험조건에서 dog origin의 OIE serum의 중화 희석역가와 비교하여 IU/ml로    산출된다.

가. 장비

Humidified incubator (37 ℃, 5% CO2)

Dry incubator (37 ℃)

Biocontainment cabinet

형광현미경(Fluorescence microscope)- x10 eye-piece and x10 objective

나. 시약

PBS buffer, pH7.2 (Ca2+과 Mg2+ 없는 것): 4 ℃ 보관

Trypsin ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)

80 % acetone(Deionised water로 희석): 4 ℃ 보관

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) + 10 % heat-inactivated FCS

FITC anti-rabies conjugate

백신주 ERA strain: -80 ℃ 보관

BHK-21 C13 cells (ATCC, CCL-10)

OIE 표준혈청 (개 유래, OIE Reference Laboratory for Rabies, Nancy, France):

4 ℃ 보관, 0.5 IU/mL로 희석

Naive serum (Negative dog sera): -20 ℃ 보관

다. 백신주 ERA strain 증폭

BHK-21 C13 세포 (ATCC, CCL-10) 배양 : 2X107의 세포를 75㎠ 세포배양 플라스크에 10% heat-inactivated FCS가 첨가된 배지 20~30 mL로 배양한다.

바이러스 접종 : 0.2~0.5 MOI(muLtiplicity of infection)의 바이러스를 35-37 ℃에서 1시간동안 배양하며 매 10~15분 간격으로 흔들어준다.

바이러스 증식 : virus/cell suspension을 800-1000 g로 15 분간 원심분리를 실시하고 cell pellet을 10 % FCS가 첨가된 배지로 다시 resuspension하고 바이러스는 2일 후에 harvest한다.

바이러스 harvest와 저장 : 4 ℃에서 800-1000 g로 15 분간 원심분리를 실시하여 바이러스 상층액을 분리하고 분주한 후 -80 ℃에 저장한다. 얼린지 3 일 후에 바이러스의 역가를 측정한다.

라. 바이러스 역가 측정(TCID50, 50  % tissue cuLture infective dose)

Cell suspension : BHK-21 C13 세포를 10 % FCS가 첨가된 배지로 섞어서 105 cells/mL로 만들고 96 well plate의 각 well에 200 μl씩 분주하고 35-37 ℃에서 24시간 배양한다.

바이러스 희석 : FCS가 없는 배지와 5 mL tube를 이용하여 계단희석을 한다. 10배 계단희석하여 10-1부터10-12까지 만든다 (0.9 mL 배지에 0.1 mL의 전계단희석액을 섞는다).

바이러스 접종 : 배지를 버리고 50 μl씩 바이러스 희석액을 넣어준다. 각 희석단계당 6 개의 well을 이용하고 5 % CO2, 35-37 ℃에서 1시간동안 접종한다. 그 후  5 % FCS가 첨가된 배지 200 μl을 넣어준다.

배양 :  5 % CO2, 35-37 ℃에서 3 일간 배양한다.

염색과 역가 측정 : FAT를 이용하여 세포를 염색하고 양성형관반응을 관찰한다. 역가계산은 neoprobit graphic method 또는 Spearman-Käber formuLa를 이용한다.

마. 실험방법

● 항체희석

Fig. 1처럼 96 well plate를 준비한다.

Plate 1는 백신주 ERA strain의 역가 측정(1~4줄), controls, standard sera와 naive dog serum을 위해 사용하고, 다른 plate는 모두 sera to be tested(테스트할 시료)를 위해 사용한다.

Plate 1의 1~4줄과 A9~A12 well에는 배지를 150 μl씩 넣고, plate 2의 6과 12

번째 줄에는 배지 200 μl씩 넣고 나머지 well에는 모두 100 씩 넣는다.

테스트할 혈청은 56 ℃ 30 분간 비동화를 시키고, fig. 1의 well 중에 50 μl이라고 적힌 well에 희석하지 않은 혈청 원액을 50 μl씩 넣는다.

OIE serum, internal control 또는 WHO standard serum과 naive dog serum : 50~200 μl multichannel pipette을 이용하여 첫 번째 희석배수의 well에서 혈청을 최소 8회이상  pipetting하여 잘 섞어주고 다음 well로 50 μl를 넘겨준다. 그래서 마지막 well까지 다다르면 잘 섞은 후 마지막 well의 50 μl를 버린다.

sera to be tested(테스트할 시료) : 최소 4개의 3-fold dilution이 필요하다. Fig. 1의 plate 2와 같이 첫 번째 well부터 잘 섞어주면서 다음 well로 50 μl씩 넘겨서 5와 11번째 줄까지 희석을 한다(10-2.39). 5~50 muLtichannel pipette을 이용하여 5와 11번째 줄의 희석 혈청의 10 μl를 다음 6과 12번째 줄로 넘긴다. 90 μl으로 맞춘 multichannel pipette을 이용하여 혈청을 잘 섞고 180 μl를 버린다. 그리고 나서 이 줄에 배지를 70 μl 넣는다.

Plate 1: Controls

	H	G	F	E	D	C	B	A
Challenge virus									1
standard									2
titration									3
									4
OIE	50 μL					50 μL			5	Naive dog
standard serum	50 μL					50 μL			6	serum
(0.5 IU/mL)	50 μL					50 μL			7	(negative)
	50 μL					50 μL			8
Serum or internal	50 μL								9
positive control	50 μL								10
or WHO standard	50 μL								11
serum	50 μL								12

log희석           0.48   0.95  1.43   1.91    2.39    2.87  CVS   Cells

virus   control

control

Plate 2: Sera to be tested

		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	A	50 μL						50 μL
Serum 1	B	50 μL						50 μL						Serum 3
	C	50 μL						50 μL
	D	50 μL						50 μL
	E	50 μL						50 μL
Serum 2	F	50 μL						50 μL						Serum 4
	G	50 μL						50 μL
	H	50 μL						50 μL

log희석      0.48  0.95  1.43   1.91  2.39  4.23   0.48   0.95   1.43  1.91   2.39   4.23

Fig. 1. FAVNT를 위한 96 well plate 디자인. 희석되지 않은 혈청을 넣는 well에는 ‘50 μL’로 표시되었다. 회색음영이 들어간 곳은 희석된 백신주 ERA strain을 50 μLl씩 넣는 곳이다. 희석율은 log10으로 나타냈다.

● 백신주 ERA strain 첨가

백신주 ERA strain를 1 mL씩 분주하여 -80 ℃에 보관한다. 분주한 tube 하나를 꺼내서 차가운 물에서 빠르게 녹이고 얼음에 박아둔다.

100 TCID50를 얻기 위해 백신주 ERA strain을 희석을 한다. Fig.1에서와 같이 혈청이 들어 있는 각 well에 희석한 백신주 ERA strain을 50 μL씩 넣는다. 백신주 ERA strain의 역가를 측정하기 위해 plate 1의 H1~H4까지 CVS를 50 μL씩 넣고 잘 섞은 후 50 μL씩 그 다음 줄로 옮겨준다. 그리고 마지막 줄(A1~A4)에서 잘 섞은 후 50 μL를 버린다. Control을 위해 A9~A12 well에는 바이러스를 넣지 않는다. 바이러스 역가의 범위는 30~300 TCID50/50 μl이다.

바이러스를 넣은 96 well plate는 5 % CO2, 35/37 ℃에서 1시간 동안 배양한다.

Cell의 첨가 : 3일 간 배양한 BHK-21 cell를 trypsin을 이용하여 떨어뜨리고 10 % FCS가 들어간 DMEM으로 4X105 cells/mL이 되게 suspension시킨 후 각 well에 50 μL씩 넣는다.

5 % CO2, 35-37 ℃에서 약 48 시간 동안 배양한다.

● 고정과 염색

48 시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS (pH7.2)로 한번 세척한 후 80 % acetone으로 세포를 실온에서 30 분간 고정한다. 그리고 실온에서 적어도 30 분 동안 건조시킨다.

FITC-conjugated anti-rabies를 희석하여 50 μl씩 넣고 부드럽게 rocking하면서 35-37 ℃에서 30 분 동안 배양한다.

● 결과 판독

각각의 well의 전체를 관찰하여 plus 혹은 minus score로 평가한다.

- Plus : 형광 양성 세포가 없는 경우

- Minus : 형광 양성 세포가 한 개 혹은 그 이상이 있을 경우

세포와 바이러스 control를 먼저 평가한다. 백신주 ERA strain 역가측정, naive serum, OIE standard serum의 평가는 Spearman-Käber 방법 또는 neoprobit graphic 방법을 이용한다.

백신주 ERA strain 역가측정 (TCID50), naive serum (D50[median dose]) 와 positive standard (D50)의 결과는 각각의 control에 대한 control card에 보고가 되어져야 한다. 그래서 그동안 축적된 기존의 control 결과들과 비교되어야 한다. 통계학적으로 (± 2 SD) 큰 차이가 없으면 이 실험방법 수행이 평가될 수 있다.

Formula to convert the log D50 value in IU/mL titre:

Serum titre(IU/mL)=[(10(serum log D50 value)) X theoretical titre of OIE serum 0.5 IU/mL]

(10(log D50 of OIE serum 0.5 IU/mL))

(5) Example of conversion:

* log D50 of the serum = 2.27

* theoretical titre of OIE serum 0.5 IU/mL = 0.5 IU/mL

* log D50 of OIE serum = 1.43

(log D50 of OIE 혈청은 측정한 날의 값이나 평균값으로 한다.)

Serum titre(IU/mL)=[(102.27) X 0.5 = 3.46 IU/mL]

(101.43)

● 주의사항

▪ Rabies virus: CVS-11strain만 사용되어야 한다.

▪ cell culture: BHK-21cells(ATCC number-CCL10)만 사용한다.

▪ FAVNT test는 96wells microplate에서 이루어져야 한다

▪ rabies virus, naive serum, dog origin의 positive standard에 대한 control chart 사용

▪ CVS virus에 대한 back titration이 control plate에서 이루어져야 한다

▪ 각 혈청은 최소한 4개의 3진 희석이 이루어 져야 한다. 결과해석은 "all or nothing"

▪ log D50 (IU/ml) conversion에서는 dog 유래의 positive standard serum의 log D50 value가     사용되어야 한다.

말파이로플라즈마병 Piroplasmosis
	효소면역법 cELISA
			미국 VMRD

1. 시약

⋅ antigen-coated plates

⋅ 100X primary & secondary antibody

⋅ secondary antibody-peroxidase conjugate

⋅ 10 × wash solution

⋅ serum diluting buffer

⋅ antibody diluting buffer

⋅ substrate & stop solutions,

⋅ Positive & negative controls

2. 실험과정

1) serum diluting buffer로 1:1 희석한 serum sample 50㎕을 각각 plate로 분주한 후 30분간 실온에서 반응시킨다.

2) wash solution으로 3번 세척한다.

3) primary antibody를 diluting buffer로 1X를 만든 다음 50㎕을 각각 plate로 분주한 후 30분간 실온에서 반응시킨다.

4) wash solution으로 3번 세척한다.

5) secondary antibody를 diluting buffer로 1X를 만든 다음 50㎕을 각각 plate로 분주한 후 30분간 실온에서 반응시킨다.

6) wash solution으로 3번 세척한다.

7) substrate solution을 50㎕씩 well에 넣고 30분간 실온에서 반응시킨다.

8) stop solution을 50㎕씩 well에 넣고 plate를 살짝 흔들어 섞어준다.

9) 파장 620,630,650㎚에서 OD값을 읽는다

3. 결과 해석

1) 유효조건

⋅ negative control의 OD 평균값이 0.30~2.00이어야 한다.

⋅ positive control의 inhibition %가 반드시 40% 이상이어야 한다.

2) 결과 계산

% inhibition = 100 - 〔(Sample O.D. × 100) ÷ (Mean Negative Control O.D.)〕

⋅ inhibition % = 40% 미만 : 음성

⋅ inhibition % ≥ 40% 이상 : 양성

말파이로플라즈마병 Piroplasmosis
	형광항체법 Fluorescent Antibody Test
			미국 NVSL, Fuller

1. 준비

가. 냉동 보관된 혈액도말 항원슬라이드를 꺼내어 30-45분간 두어 해동시키면서동시에 건조되도록 한다.

나. lot 번호나 다른 정보 등 슬라이드에 관한 정보들을 test sheet에 적어둔다.

다. 양성 및 음성 항혈청을 해동시키고 test sheet에 lot number를 기록한다.

2. 항혈청 및 가검혈청 희석

가. 항혈청과 가검혈청을 1% Goat serum를 첨가한 1X IFA PBS buffer (1㎖ Goat serum/100㎖PBS)로 아래와 같이 희석한다.

[항혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 1:10에서 1:80으로 희석한 다음, 단계희석하여 1:1280까지 희석한다.

(즉, 1:80 → 1:160 → 1:320 → 1:640 → 1:1280)

[가검혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 가검혈청을 1:80까지 희석한다. (cf. 소 파이로플라즈마병은 1:160)

나. 가검혈청의 accession/I.D. number를 확실히 test sheet에 기입해 둔다.

3. 항원 슬라이드 준비

가. 혈액도말 항원슬라이드에 메니큐어로 사각형을 그리거나, 4줄의 선을 긋는다.

단, 이때 반드시 슬라이드의 혈액이 도말된 면에 그린다.

I										II
□ □ □ □ □ □ □
□ □ □ □ □ □ □	혹은
□ □ □ □ □ □ □

4. 초기 배양 - 항원항체 반응

가. 희석된 혈청 0.01㎖ (10㎕)를 각각의 사각형 안에 떨어뜨린다. test sheet에 pattern을 기록해 둔다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 마지막 세척 후, 슬라이드 뒷면을 흐르는 수돗물에 가볍게 헹군다.

마. 슬라이드를 최소 30분 동안 37℃에서 건조시키거나, 헤어드라이어로 말려준다.

5. Fluorescein Labeled (FITC) Affinity Purified Antibody 준비

가. 냉장고에서 fluorescein labeled (FITC) affinity purified antibody를 꺼낸다.

나. FITC affinity purified antibody를 1X IFA PBS buffer로 1:10으로 희석한 후, 1:80으로 희석한다. ; Equine FITC antibody 1:80 dilution

(cf. Bovine FITC antibody 1:200 dilution)

6. 최종 배양 - Labeling Step

가. FITC affinity purified antibody를 10㎕씩 슬라이드의 각 네모칸 안에 떨어뜨린다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 빛을 완전히 차단한 37℃의 배양기에서 30분간 건조시키거나, 헤어드라이어를 사용하여 말려준다.

7. IFA 슬라이드 판독

가. 슬라이드가 완전 건조되었는지 확인한다.

나. X10, X100배의 형광현미경으로 검경한다.

구역 Dourine
	보체결합반응 Complement Fixation Test
			미국 NVSL

1. 각종 시약의 제조

A. Stock MgCl2(1M), CaCl2 (0.3M)용액

◦ Magnesium chloride, hexahydrate (MgCl2, 6H2O)	20.33g	또는

◦ Magnesium chloride, monohydrate (MgCl2, H2O)	9.5g

◦ Calcium chloride, dihydrate (CaCl2, 2H2O)	4.41g	또는

◦ Calcium chloride, monohydrate (CaCl2, H2O)	3.7g

◦ Distilled water	100㎖

- 상기 시약을 D.W. 100㎖에 완전 용해시킨 후 0.25㎛ 필터로 여과하여 냉장보관 하면서 사용한다.

B. Barbital sodium stock solution

◦ Sodium chloride (NaCl)	85g	42.5g

◦ Sodium 5.5～diethyl barbiturate	3.75g	1.875g

(Barbital sodium, C8H11N2O3Na)

◦ D.W.	1400㎖	700㎖

C. Barbital stock solution

◦ 5.5～diethyl barbituric aicd	5.75g	2.875g

(Barbital C8H12N2O3)

◦ D.W.	500㎖	250㎖

Barbital stock solution(C.용액)은 D.W를 가열시키면서 완전 용해시킨다.

(Magnetic stirrer를 사용)

- 뜨거운 D.W에 완전히 용해시킬 것.

- 실온에서 냉각시킨 다음 사용

D. Concentrated barbital buffer solution (CBBS)

◦ B.의 stock solution 1400㎖(700㎖)에 C.의 stock solution 500㎖(250㎖)를 혼합한다.

◦ 상기 A.의 stock 용액을 5㎖(2.5㎖) 첨가하여 혼합

◦ 전체 용량이 2,000㎖(1,000㎖)이 되도록 증류수를 첨가한다.

◦ 라벨링하여 냉장고에 보관

E. BBS working solution

◦ 상기 D.의 CBBS용액 1 volume에 cold D.W 4 volume을 혼합한다.

(1:4로 희석 ⇒ 5× 희석)

◦ 5× 희석용액을 냉장고에 보관 (희석용액은 매일 만들어 사용)

◦ 5× 희석용액의 pH는 7.3～7.4

※ 5× 희석액은 D.W 보다는 멸균된 0.04%의 gelatin 용액이 좀 더 우수한 희석액으로 보고되어 있음

※ CFT의 working solution의 복잡한 제조방법을 피하기 위한 수단

⇒ Complement Fixation Test diluent tablet : Oxoid Tablets

(oxoid Code BR 16)을 사용하면 아주 쉽게

CFT 용액을 만듬 : Oxoid tablets

⇒ Commercial tablets

1ℓ 병에 D.W 500㎖

⇓

CFT tablets 10개를 첨가

⇓

열을 가하여 완전 용해시킨다.

⇓

Cooling 후 D.W를 가지고 1ℓ에 맞춘다.

⇓

4℃에 보관하면서 사용 (시험시마다 새로 만들어서 사용)

2. Collection and Storage of Sheep blood(면양혈구 채혈 및 보존)

Alsever's solution

◦ Glucose (C6H6O6)	20.5g

◦ Sodium chloride (NaCl)	4.2g

◦ Trisodium citrate, dihydrate(Na3C6H7․2H2O)	8.0g

◦ Citric acid (C6H8O7)	0.6g

◦ D.W. or D.D.W.	1000㎖

◦ 가열 없이 상기 시약을 완전 용해시킨다.

⇓

115℃에서 20분간 멸균 또는 0.25㎛ 필터로 여과한 후 냉장고에서 보관하면서 사용

3. Washing the Sheep RBC (면양혈구 세척)

◦ 멸균된 alsever's 용액 30㎖를 50㎖ 원심 관에 담는다. (3～4개 준비)

◦ 면양혈액을 무균 적으로 채취하여 즉시 alsever's 용액과 혼합하여 아주 천천히 섞은 다음 냉장고에 보관(Alsever's 용액 30㎖+면양혈액 15-20㎖)

◦ Alsever's 용액과 혼합된 면양혈액은 반드시 냉장고에서 5일 이상 정치한 후 (혈구침전) 사용한다.

※ 이와 같은 면양혈구는 약 1달 정도 사용 가능함.

(단, 상층액에 용혈 현상이 육안적으로 관찰되지 않거나, 혈구의 오염이 의심 되지 않으면 계속 사용)

◦ 정치된 혈액을 일회용 15㎖ 원심분리 관에 4㎖ 정도씩 3～4개씩 분주 (반드시 15㎖ 원심 관에 사용)하여 CFT 희석용액을 적당량(9～10㎖) 첨가하여 혼합한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 1회

◦ 모세피펫을 사용하여 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ CFT 희석용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 2회

◦ 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ 다시 CFT 희석용액을 첨가하여 혼합 후 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 3회

※ 3회 원심 후에도 상층 액이 지속적으로 용혈 시에는 혈구를 버리고 다른 batch 또는 다시 채혈하여 사용함. (alsever's 용액 점검)

◦ 상층액 및 buffy coat층을 제거

◦ CFT 희석용액을 시험관에 15㎖씩 정도 첨가하여 잘 혼합

◦ 정확하게 1,000g에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층 액 제거

◦ 침전된 혈구를 사용하여 2% RBC 부유 액을 제조한다.

(필요시 요구되는 RBC의 부유액 제조)

4. Standardization of the RBC Suspension (표준혈구 제조)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

◦ RBC 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심분리 하여 침전된 RBC 1㎖에 CFT 희석액 49㎖를 첨가하면 2% RBC 부유액이 된다.

⇒ 가장 쉬운 2% RBC 부유액 제조법

[방법 2] 정확한 방법

◦ RBC의 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심 하여 침전된 RBC의 양이 얼마인지를 기록한다.

◦ 희석액을 사용하여 packed cell 양의 30배로 희석액을 첨가하여 골고루 희석한다.

◦ ELISA reader의 전원을 켜 놓는다.

◦ 작은 병에 상기의 희석용액 1㎖(300㎕)에 D.W 9㎖(2.7㎖)를 첨가하여 희석한다.

(1:10 희석)

◦ 96well ⊔자(평저)마이크로플레이트에 종으로 8개 well(duplicate)에 각각 100㎕씩 분주

◦ ELISA reader 540㎚ 필터에서 O.D치를 측정하여 16개 well의 평균 O.D치를 계산(Target O.D는 0.145)  ⇒  0.140～0.150

◦ 만약 16개 well의 O.D 평균값이 0.115 보다 높으면 다음 공식에 의거하여 혈구의 최종 희석 농도를 알아냄

O.D의 평균값(16개 well) × RBC 부유 액의 총용량	= 요구되는 최종 희석농도
0.145

※ 만약 O.D의 평균값(16개 well)이 0.255였고, RBC 부유액(30배 희석된 것) 용량이 60㎖라면 CFT 희석액을 얼마나 첨가하면 O.D의 수치가 0.145가 되는 sheep RBC의 농도를 얻을 수 있는가?

0.255×60		=		15.30	= 105.52㎖
0.145				0.145

상기 RBC 부유액 60㎖+희석액 45.52㎖를 첨가하여 희석하면 정확한 2% RBC

◦ 라벨링하여 4℃에 보관

5. Dilution of the Hemolysin (헤모라이신 희석)

(1:100 Stock 용액, 냉동고에 보관)

◦ Hemolysin 원액 1㎖+ 희석액 99㎖ (1:100 stock 용액) ～ 1㎖씩 에펜도르프 시험관에 분주하여 냉동보관

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
stock hemolysin (1:100배)	1㎖	1㎖
1:1000 hemolysin	-	-	시험관2번에서 2㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖
희 석 액	4㎖	9㎖	1㎖	1㎖	2㎖	4㎖	9㎖
Hemolysin 최종 희석 배수	500	1,000	1,500	2,000	3,000	5,000	10,000

※ 1:100 stock hemolysin dilution

VBD 99㎖ + 50% glycerinized hemolysin 1㎖

⇓

1㎖씩 소분하여 냉동고에 보관

6. Titration of the Hemolysin (헤모라이신 역가측정)

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
	(500×)	(1000×)	(1500×)	(2000×)	(3000×)	(5000×)	(10000×)
희석된 Hemolysin (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
2% Sheep RBC (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

◦ gently agitating

◦ 37℃에서 10분간 감작 (5분마다 약하게 혼합)

※ 1:250배 희석된 보체의 준비 ⇒ 원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖(1:10)

⇒ 희석액 7.2㎖+1:10 희석보체 0.3㎖(1:250×보체희석)↢ 최소한 20분간 냉장보관후 사용(2시간 이내 사용), 1:200 및 1:300도 준비

※ 희석보체의 결정은 혈구를 70～80% 정도 용혈을 일으키는 양으로 희석하여 사용(희석보체 여러 농도의 실험으로 결정해야 함).

⇒ 200, 250, 300× 희석하여 아래 표처럼 실시하여 보체의 농도 결정

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	··········4	5	6	7
Buffer (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
희석보체 (㎖) (4개 농도 희석)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
Hemolysin-RBC 희석액 (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ throughly mix

◦ 37℃ 항온수조에서 30분간 감작 (후반부 15분간은 gently shaking하면서 감작)

◦ 30분 감작 후 cold 희석액 2㎖를 각각 시험관에 첨가한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 (용혈 안 된 RBC는 침천)한 후 상층액의 100㎕를 ELISA reader의 540㎚ filter에서 O.D를 측정한다.

◦ 7개의 시험관 O.D 수치를 측정하여 아래 공식에 의거 계산된 용혈정도는 다음의 그래프에 표시하여 선을 연결한다.

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.145 (Target O.D)

◦ 연결된 선에 의거하여 본 실험에 사용될 Hemolysin 희석배수를 결정

Hemolysin 역가측정

용

혈

정

도

(%)

80

70

60

50

30

40

20

10000

5000

3000

2000

1500

1000

500000

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

시험관번호	1 (500×)		2 (1000×)	3 (1500×)	4 (2000×)			5 (3000×)	6 (5000×)	7 (10000×)
O.D치
		각 시험관의 O.D치×100					= 용혈정도 %
		0.145 (Target O.D)
용혈정도 %치

◦ 앞의 그림에서의 plateau 선은 1:1000배에서 시작(1000배에서 일직선상의 선이 나타남)

◦ 본 시험에 사용될 hemolysin 희석배수는 25% 보다 더 강한 배수 사용(약 750배).

Hemolytic sensitized cell 제조법

Titration된 hemolysin (1:100) stock을 가지고 상기의 800×로 희석하여 동량의 2% sheep RBC를 첨가하여 항온수조에서 30분간 감작한 후 사용

(5분마다 혼합하여 준다)

♣ Hemolysin의 역가측정은 크게 중요하지 않으나 역가측정의 시험 검사가 끝난 후의 계산에서 hemolysin의 희석배수가 500배 이하일시에는 사용하지 말고 역가 측정을 다시 할 것.

7. Titration of Complement (보체역가 측정)

◦ 3set의 희석보체 준비 (1:400, 1:500, 1:600)

원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖ (1:10배 희석)

⇒ 희석(1:10배)액 0.2㎖+희석액 9.8㎖(1:500배)

⇒ 1:500배 희석보체는 최소한 냉장고에 20분 방치 후 사용

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6
희석보체 (㎖)	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0	1.1
Buffer (㎖)	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1
H.S (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ Gently mixing

◦ Incubated in a water bath of 37℃ for 30minutes(15분에 한 번 정도 섞어줌)

◦ 30분 감작 후 cold 희석액 2㎖를 각각의 시험관에 첨가하여 3,000rpm에서 5분간 원심 한 다음 상층액의 100㎕를 ELISA reader 540㎚ filter에서 O.D치를 측정한다.

◦ 만약 각 시험관의 O.D 수치를 측정하여 다음의 공식에 따라 계산하여 용혈정도의 그래프를 그린 다음 50% 용혈(1C'H50)에 해당하는 보체의 농도를 결정

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.145 (Target O.D)

※ 보체 및 hemolysin 역가 산정 시 반드시 target O.D의 값이 같은 조건으로 나누어져야 함.

Calculation of the % of hemolysis in complement titration
Dose fo Complement	O.D	% Hemolysis (Y)	Y/(100-Y)
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1	0.05 0.06 0.07 0.08 0.10 0.11	34 41 49 55 71 76	34/66 = 0.52 41/59 = 0.70 49/51 = 0.96 55/45 = 1.22 71/29 = 2.45 76/24 = 3.17

보

체

농

도

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.1

0.1

0.4

0.6

0.8

1

1.4

1.6

1.8

2

4

6

8

×

×

0.76

×

×

y(100-y)

50% 용혈을 일으키는 보체역가 측정(1CH50)

※ 5.5C'H50의 계산법 (본 시험에 사용되는 보체의 희석)

- 전술한 도표 및 그래프에서 희석된 보체(1:400)에서 1C'H50의 O.D치가 0.76이었다면, 5.5C'H50은 얼마인가?

보체의 역가 희석배수	=	보체의 역가 희석(X)
5.5C'H50		0.4

X =	160		=	38
	4.18

- 희석 되지 않고 보존된 보체원액을 38배로 희석하여 사용하면 5.5C'H50이 된다.

8. Antigen (항원)

◦ 희석항원을 매일 만들어 사용한다.

◦ 항원은 반드시 제조자 또는 회사가 정해준대로 검사에 필요한 양만 희석하여 사용할 것.

9. Inactivation of Sera (혈청 비동화)

◦ 항온수조에서 또는 인큐베이터에(뚜껑 닫은 다음 tape로 부착) 58℃ 30분 동안 비동화.

(비동화는 반드시 희석하지 말고 혈청자체만 비동화 시킨 후 5배 희석하여 실험에 들어 갈 것)

◦ Anti-complementary activity (ACA)

① 혈청 속에는 자연적인 ACA가 있음 ⇐ 열처리에 의하여 파괴됨

② 세균의 감염 시 ACA ⇐ 혈청을 고속원심분리 후에 사용 (8,000g×5분)

10. Main Test (본시험)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

A. 양성/음성 대조군 plate

◦ 비동화 처리한 양성/음성 대조군혈청을 준비한다.（대조군 혈청은 희석하지 않는다)

◦ 양성/음성 대조군 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 플레이트의 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ A1 well에 양성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ B1 well에 음성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

B.  Complement control plate

◦ CFT 희석용액 25㎕를 G10-12, H10-12 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 G9-10, H9-10 well에 분주한다.

◦ 두 번째 well(G10, H10)에서부터 이진 희석한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well(G9-12, H9-12 )에 분주한다.

<양성/음성 대조군 & Complement Control plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	1/2,048	1/4,096	1/8,192
A	P.S
B	N.S
C
D
E
F
G									Complement control
H

C. 검사혈청 plate

◦ 비동화 처리한  검사혈청을  CFT 희석용액으로 5배 희석한다.

◦ 검사 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 검사혈청 25㎕를 해당 well에 분주한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 전 well에 분주한다.

<검사혈청 plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	시료1	시료9
B	시료2	시료10
C	시료3
D	시료4
E	시료5
F	시료6
G	시료7
H	시료8

D. 플레이트를 37℃에서 1시간 반응시킨다. (gently shaking)

E. Haemolytic system 준비 : 배양을 마치기 20분전에 2% RBC와 동량의 적정희석 된     Hemolysin을 섞은 후 10분 간 감작 시킨다.

F. Haemolytic system 50㎕를 전 well에 분주한 후 37℃에서 45분간 반응시킨다.    (gently shaking)

G. 플레이트를 1,840g 4분 원심분리 후 결과를 판독한다.

[방법 2] End-point titration : 검사혈청에서 양성결과를 보이는 경우 실시

시험관번호 (96 well)	1	2	3	4	5	6	7	8
Dilution	비동화 혈청	1:2	1:4 A/C	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Serum (㎕)	50
Buffer (㎕)		25	25	25	25	25	25	25
Dilute (㎕)		25	25	25	25	25	25	25	25버림
Buffer (㎕)			25
Antigen (㎕)				25	25	25	25	25
Complement			25	25	25	25	25	25
		◦ Plate는 여러 겹으로 쌓으면 안 됨 ◦ 처음 1분간 Shaking ◦ incubate at 37℃ 1시간 배양 ◦ 배양을 마치기 20분 전에 2%RBC와 동량의 적정희석 된 Hemolysin을 섞은 후 10분 간 감작하여 사용
H.S.			50	50	50	50	50	50	50
		◦ incubate at 37℃ 45분 ◦ 20분에 한번 Shaking ◦ 4℃ 에서 3-4시간 정치 또는 1840g 4분 원심 후 판독

11. 보체결합반응에 대한 시약 대조

번호	대조 목적	VBD	항원	보체	감작 RBC	2% RBC	결과
1	Ag anticomplementary	.025	.025	.025	.05		0
2	Ag-hemolysin-hemolytic	.05	.025		.05		4
3	C' 5.5(C'H50) units	.05		.025	.05		0
4	C' 2.75(C'H50) units	.05		(.025)	.05		+/-
5	C' 2.75(C'H50) units w/Ag	.025	.025	(.025)	.05		+/-
6	Hemolysin-hemolytic	.075			.05		4
7	Saline-hemolytic	.10				.025	4
8	C'-hemolytic	.075		.025		.025	4
9	Ag-hemolytic	.075	.025			.025	4

12. 판정기준

Percent Hemolysis	판 독	결 과
0%	4+	양성
25%	3+	의심
50%	2+	의심
75%	1+	의심
Few cells remaining	Trace	음성
100%	음성	음성

구역 Dourine
	형광항체법 Fluorescent Antibody Test
			미국 NVSL

1. 준비

가. 냉동 보관된 혈액도말 항원슬라이드를 꺼내어 30-45분간 두어 온도가 올라감과 동시에 건조되도록 한다.

나. lot 번호나 다른 정보 등 슬라이드에 관한 정보들을 test sheet에 적어둔다.

다. 양성 및 음성 항혈청을 해동시키고 test sheet에 lot number를 기록한다.

2. 항혈청 및 가검혈청 희석

가. 항혈청과 가검혈청을 1% Goat serum를 첨가한 1X IFA PBS buffer (1㎖ Goat serum/100㎖PBS)로 아래와 같이 희석한다.

[항혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 1:10에서 1:80으로 희석한 다음, 단계희석하여 1:1280까지 희석한다.

(즉, 1:80 → 1:160 → 1:320 → 1:640 → 1:1280)

[가검혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 가검혈청을 1:80까지 희석한다. (cf. 소 파이로플라즈마병은 1:160)

나. 가검혈청의 accession/I.D. number를 확실히 test sheet에 기입해 둔다.

3. 항원 슬라이드 준비

가. 혈액도말 항원슬라이드에 메니큐어로 사각형을 그리거나, 4줄의 선을 긋는다.

단, 이때 반드시 슬라이드의 혈액이 도말된 면에 그린다.

I										II
□ □ □ □ □ □ □
□ □ □ □ □ □ □	혹은
□ □ □ □ □ □ □

4. 초기 배양 - 항원항체 반응

가. 희석된 혈청 0.01㎖ (10㎕)를 각각의 사각형 안에 떨어뜨린다. test sheet에 pattern을 기록해 둔다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤 챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 마지막 세척 후, 슬라이드 뒷면을 흐르는 수돗물에 가볍게 헹군다.

마. 슬라이드를 최소 30분 동안 37℃에서 건조시키거나, 헤어드라이어로 말려준다.

5. Fluorescein Labeled (FITC) Affinity Purified Antibody 준비

가. 냉장고에서 fluorescein labeled (FITC) affinity purified antibody를 꺼낸다.

나. FITC affinity purified antibody를 1X IFA PBS buffer로 1:10으로 희석한 후, 1:80으로 희석한다. ; Equine FITC antibody 1:80 dilution

(cf. Bovine FITC antibody 1:200 dilution)

6. 최종 배양 - Labeling Step

가. FITC affinity purified antibody를 10㎕씩 슬라이드의 각 네모칸 안에 떨어뜨린다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤 챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 빛을 완전히 차단한 37℃의 배양기에서 30분간 건조시키거나, 헤어드라이어를 사용하여 말려준다.

7. IFA 슬라이드 판독

가. 슬라이드가 안전 건조되었는지 확인한다.

나. X10, X100배의 형광현미경으로 검경한다.

아나플라즈마병 Anaplasmosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
Wright-Giemsa Stain

1. 재료 및 시약

1) Wright-Giemsa Solution

⋅Powdered commercial Wright stain	61.85g

⋅Powdered commercial Giemsa stain	6.87g

⋅Glycerin	620㎖

⋅Absolute methyl alcohol	20㎖

2) Wright-Giemsa stain buffer solution

⋅Potassium phosphate monobasic (KH2PO4, M.W.=136.09)	5.418g

⋅Sodium phosphate dibasic 12-hydrate	4.515g

(Na2HPO4, 12H2O, M.W.= 358.16)

⋅D.W. upto	12㎖

3) Materials

⋅1×3 inch microscope slide

⋅Container

2. 시약의 제조

1) 정확히 무게를 측정.

2) Powder를 약절구에 넣고 glycerin을 반 정도 넣고 갈아서 Methyl alcohol를 소량 부어서 잘 녹이면서 저장 탱크에 담는다.

3) 만들어진 Wright-Giemsa Solution을 잘 혼합하여 냉암소에 3-6개월 성숙시킨 다음에 사용한다.

* commercial Wright-Giemsa Solution Mixture(cat.no. 938016)를 사용 할 수도 있음.

3. 검사방법

1) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 공기 중에 흔들어서 말린다.

2) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 3-5분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

3) 실온에서 슬라이드글라스를 완전히 말린다.

4) DW로 Wright-Giemsa Solution을 희석하여 10%의 용액을 만든 다음 동물별로 아래와 같이 염색시간을 둔다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

5) 염색 후 buffer solution에 12-15번 린스한다.

(dipping time : 1초)

6) 증류수에 12-15번 린스한다(dipping time : 1초):2회 반복

7) 슬라이드글라스의 뒷면을 거즈로 물기를 제거한 후 필요하다면 커버글라스를 씌운다.

8) 광학현미경 400배, 1,000배율로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

아나플라즈마병 Anaplasmosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
Giemsa Stain, modified

1. 재료 및 시약

1) Giemsa Stain (Sigma-Aldrich, Procedure No. GS-10)

-  Giemsa Stain, modified, 0.4% w/w, in a buffered methanol solution,        pH 6.9, with stabilizers

2) Materials

- 1×3 inch microscope slide

- Container

2. 검사방법

1) Standard Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 5-7분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

③ 슬라이드를 공기 중에 말린다.

④ Giemsa stain을 증류수로 1:20배 한 용액으로 15-60분간 염색한다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

⑤ 증류수로 린스한다.

⑥ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

2) Quick Stain Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 희석하지 않은 Giemsa stain에 1-2분간 염색한다.

③ 증류수에 2-4분간 둔다.

④ 증류수로 린스한다.

⑤ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

아나플라즈마병 Anaplasmosis
	효소면역법 cELISA Test
			미국 VMRD

1. 검사방법

1) 실험 전 kit를 미리 실온(18-26℃)에 꺼내놓는다.

2) undiluted serum sample 70㎕을 plate로 분주한 후 30분간 실온에서 반응시킨다.

3) serum 50㎕를 Anaplasma Antigen-Coated plate로 분주한 후 1시간 동안 반응시킨다.

4) wash solution으로 2번 세척한다.

5) 희석한 Antibody-Peroxidase conjugate(conjugate diluting buffer로 100배

희석)를  50㎕씩 각 well에 분주한 후  실온에서 20분 간 반응 시킨다.

6) wash solution으로 4번 세척한다.

7) substrate solution을 50㎕씩 분주하고  20분간 실온에서 반응시킨다. 이때

직사광선을 피해 어두운 장소에 둔다.

8) stop solution을 50㎕씩 well에 넣고 plate를 살짝 흔들어 섞어준다.

9) 파장 650㎚에서 OD값을 읽는다.

2. 결과 유효성

◦ Negative control의 OD 평균값이 0.40~2.10이어야 한다.

◦ Positive control의 inhibition %가 반드시 30% 이상이어야 한다.

◦ Calculation of % inhibition (%I) :

100-〔(Sample OD x 100) / (Mean Negative Control OD)〕

3. 결과 판독

◦ Negative : inhibition % < 30%

◦ Positive : inhibition % ≥ 30%

아나플라즈마병 Anaplasmosis
보체결합반응	Complement Fixation Test
			미국 NVSL

1. 각종 시약의 제조

A. Stock MgCl2(1M), CaCl2 (0.3M)용액

◦ Magnesium chloride, hexahydrate (MgCl2, 6H2O)	20.33g 또는

◦ Magnesium chloride, monohydrate (MgCl2, H2O)	9.5g

◦ Calcium chloride, dihydrate (CaCl2, 2H2O)	4.41g	또는

◦ Calcium chloride, monohydrate (CaCl2, H2O)	3.7g

◦ D.W.	100㎖

- 상기 시약을 D.W. 100㎖에 완전 용해시킨후 0.25㎛ 필터로 여과하여 냉장보관 하면서 사용한다.

B. Barbital sodium stock solution

◦ Sodium chloride (NaCl)	85g	42.5g

◦ Sodium 5.5～diethyl barbiturate	3.75g	1.875g

(Barbital sodium, C8H11N2O3Na)

◦ D.W.	1400㎖	700㎖

C. Barbital stock solution

◦ 5.5～diethyl barbituric aicd	5.75g	2.875g

(Barbital  C8H12N2O3)

◦ D.W.	500㎖	250㎖

Barbital stock solution(C.용액)은 D.W를 가열시키면서 완전 용해시킨다.

(Magnetic stirrer를 사용)

- 뜨거운 D.W.에 완전히 용해시킬 것.

- 실온에서 냉각시킨 다음 사용

D. Concentrated barbital buffer solution (CBBS)

◦ B.의 stock solution 1400㎖(700㎖)에 C.의 stock solution 500㎖(250㎖)를 혼합한다.

◦ 상기 A.의 stock 용액을 5㎖(2.5㎖) 첨가하여 혼합

◦ 전체 용량이 2,000㎖(1,000㎖)이 되도록 증류수를 첨가한다.

◦ 라벨링하여 냉장고에 보관

E. BBS working solution

◦ 상기 D.의 CBBS용액 1 volume에 cold D.W. 4 volume을 혼합한다.

(1:4로 희석 ⇒ 5× 희석)

◦ 5× 희석용액을 냉장고에 보관 (희석용액은 매일 만들어 사용)

◦ 5× 희석용액의 pH는 7.3～7.4

※ 5× 희석액은 D.W. 보다는 멸균된 0.04%의 gelatin 용액이 좀 더 우수한 희석액으로 보고되어 있음

※ CFT의 working solution의 복잡한 제조방법을 피하기 위한 수단

⇒ Complement Fixation Test diluent tablet : Oxoid Tablets

(oxoid Code BR 16)을 사용하면 아주 쉽게

CFT 용액을 만듬 : Oxoid tablets

⇒ Commercial tablets

1ℓ 병에 D.W 500㎖

⇓

CFT tablets 10개를 첨가

⇓

열을 가하여 완전 용해시킨다.

⇓

Cooling 후 D.W를 가지고 1ℓ에 맞춘다.

⇓

4℃에 보관하면서 사용 (시험시마다 새로 만들어서 사용)

2. Collection and Storage of Sheep blood(면양혈구 채혈 및 보존)

Alsever's solution

◦ Glucose (C6H6O6)	20.5g

◦ Sodium chloride (NaCl)	4.2g

◦ Trisodium citrate, dihydrate(Na3C6H7․2H2O)	8.0g

◦ Citric acid (C6H8O7)	0.6g

◦ D. W  or  D.D.W	1000㎖

◦ 가열 없이 상기 시약을 완전 용해시킨다.

⇓

115℃에서 20분간 멸균 또는 0.25㎛ 필터로 여과한 후 냉장고에서 보관하면서 사용

3. Washing the Sheep RBC (면양혈구 세척)

◦ 멸균된 alsever's 용액 30㎖를 50㎖ 원심 관에 담는다. (3～4개 준비)

◦ 면양혈액을 무균 적으로 채취하여 즉시 alsever's 용액과 혼합하여 아주 천천히 섞은 다음 냉장고에 보관(Alsever's 용액 30㎖+면양혈액 15-20㎖)

◦ Alsever's 용액과 혼합된 면양혈액은 반드시 냉장고에서 5일 이상 정치한 후(혈구침전) 사용한다.

※ 이와 같은 면양혈구는 약 1달 정도 사용 가능함.

(단, 상층액에 용혈 현상이 육안 적으로 관찰되지 않거나, 혈구의 오염이 의심 되지 않으면 계속 사용)

◦ 정치된 혈액을 일회용 15㎖ 원심분리 관에 4㎖ 정도씩 3～4개씩 분주 (반드시 15㎖ 원심관에 사용)하여 CFT 희석용액을 적당량(9～10㎖) 첨가하여 혼합한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 1회

◦ 모세피펫을 사용하여 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ CFT 희석용액을 첨가하여 혼합한 다음 3,000rpm에서 5분간 원심 - 원심 2회

◦ 상층액과 buffy coat층을 제거한다.

◦ 다시 CFT 희석용액을 첨가하여 혼합 후 3,000rpm에서 5분간 원심 - 3회

※ 3회 원심 후에도 상층 액이 지속적으로 용혈 시에는 혈구를 버리고 다른 batch 또는 다시 채혈하여 사용함. (alsever's 용액 점검)

◦ 상층 액 및 buffy coat층을 제거

◦ CFT 희석용액을 시험관에 15㎖씩 정도 첨가하여 잘 혼합

◦ 정확하게 1,000g에서 10분간 원심분리 시킨 후 상층액 제거

◦ 침전된 혈구를 사용하여 2% RBC 부유액을 제조한다.

(필요시 요구되는 RBC의 부유액 제조)

4. Standardization of the RBC Suspension (표준혈구 제조)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

◦ RBC 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심분리 하여 침전된 RBC 1㎖에 CFT 희석 액 49㎖를 첨가하면 2% RBC 부유액이 된다.

⇒ 가장 쉬운 2% RBC 부유액 제조법

[방법 2] 정확한 방법

◦ RBC의 3회 세척 후 1,000g에서 10분간 원심 하여 침전된 RBC의 양이 얼마인지를 기록한다.

◦ 희석액을 사용하여 packed cell 양의 30배로 희석액을 첨가하여 골고루 희석한다.

◦ ELISA reader의 전원을 켜 놓는다.

◦ 작은 병에 상기의 희석용액 1㎖(300㎕)에 D.W 9㎖(2.7㎖)를 첨가하여 희석한다.

(1:10 희석)

◦ 96well ⊔자(평저)마이크로플레이트에 종으로 8개 well(duplicate)에 각각 100㎕

분주

◦ ELISA reader 540㎚ 필터에서 O.D치를 측정하여 16개 well의 평균 O.D치를 계산(Target O.D는 0.115) ⇒ 0.140～0.150

◦ 만약 16개 well의 O.D 평균값이 0.145 보다 높으면 다음 공식에 의거하여 혈구의 최종 희석 농도를 알아냄

O.D의 평균값(16개 well) × RBC 부유 액의 총용량	= 요구되는 최종 희석농도
0.115

※ 만약 O.D의 평균값(16개 well)이 0.255였고, RBC 부유액(30배 희석된 것) 용량이 60㎖라면 CFT 희석액을 얼마나 첨가하면 O.D의 수치가 0.145가 되는 sheep RBC의 농도를 얻을 수 있는가?

0.255×60		=		15.30	= 105.52㎖
0.145				0.145

상기 RBC 부유액 60㎖+희석액 45.52㎖를 첨가하여 희석하면 정확한 2% RBC

◦ 라벨링하여 4℃에 보관

5. Dilution of the Hemolysin (헤모라이신 희석)

(1:100 Stock 용액, 냉동고에 보관)

◦ Hemolysin 원액 1㎖+ 희석액 99㎖ (1:100 stock 용액) ～ 1㎖씩 에펜도르프 시험관에 분주하여 냉동보관

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
stock hemolysin (1:100배)	1㎖	1㎖
1:1000 hemolysin	-	-	시험관2번에서 2㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖	시험관2번에서 1㎖
희 석 액	4㎖	9㎖	1㎖	1㎖	2㎖	4㎖	9㎖
Hemolysin 최종 희석 배수	500	1,000	1,500	2,000	3,000	5,000	10,000

※ 1:100 stock hemolysin dilution

VBD 99㎖ + 50% glycerinized hemolysin 1㎖

⇓

1㎖씩 소분하여 냉동고에 보관

6. Titration of the Hemolysin (헤모라이신 역가측정)

시험관번호	1	2	3	4	5	6	7
	(500×)	(1000×)	(1500×)	(2000×)	(3000×)	(5000×)	(10000×)
희석된 Hemolysin (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
3% Sheep RBC (㎖)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

◦ gently agitating

◦ 37℃에서 10분간 감작 (5분마다 약하게 혼합)

※ 1:250배 희석된 보체의 준비 ⇒ 원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖(1:10)

⇒ 희석액 7.2㎖ + 1:10 희석보체 0.3㎖(1:250보체희석)↢ 최소한 20분간 냉장보관 후 사용(2시간 이내 사용), 1:200 및 1:300도 준비

※ 희석보체의 결정은 혈구를 70～80% 정도 용혈을 일으키는 양으로 희석하여 사용(희석보체 여러 농도의 실험으로 결정해야 함).

⇒ 200, 250, 300× 희석하여 아래 표처럼 실시하여 보체의 농도 결정

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6	7
Buffer (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8
희석보체 (㎖) (3개 농도 희석)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
Shake the rack for mixing
Hemolysin-RBC 희석액 (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ throughly mix

◦ 37℃ 항온수조에서 30분간 감작 (후반부 15분간은 gently shaking하면서 감작)

◦ 30분간 감작 후 cold 희석액 2㎖를 각각 시험관에 첨가한다.

◦ 3,000rpm에서 5분간 원심 (용혈 안 된 RBC는 침전)한 후 상층액의 100㎕를 ELISA reader의 540㎚ filter에서 O.D를 측정한다.

◦ 7개의 시험관 O.D 수치를 측정하여 아래 공식에 의거 계산된 용혈정도는 다음의 그래프에 표시하여 선을 연결한다.

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.145 (Target O.D)

◦ 연결된 선에 의거하여 본 실험에 사용될 Hemolysin 희석배수를 결정

Hemolysin 역가측정

용

혈

정

도

(%)

80

700

60

50

30

40

20

10000

5000

3000

2000

1500

1000

500000

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

×

시험관번호	1 (500×)		2 (1000×)	3 (1500×)	4 (2000×)			5 (3000×)	6 (5000×)	7 (10000×)
O.D치
		각 시험관의 O.D치×100					= 용혈정도 %
		0.145 (Target O.D)
용혈정도 %치

◦ 앞의 그림에서의 plateau 선은 1:1000배에서 시작(1000배에서 일직선상의 선이 나타남)

◦ 본 시험에 사용될 hemolysin 희석배수는 25% 보다 더 강한 배수 사용(약 750배).

Hemolytic sensitized cell 제조법

Titration된 hemolysin (1:100) stock을 가지고 상기의 800×로 희석하여 동량의 2% sheep RBC를 첨가하여 항온수조에서 30분간 감작한 후 사용

(5분마다 혼합하여 준다)

♣ Hemolysin의 역가측정은 크게 중요하지 않으나 역가측정의 시험 검사가 끝난 후의 계산에서 hemolysin의 희석배수가 500배 이하일시에는 사용하지 말고 역가 측정을 다시 할 것.

7. Titration of Complement (보체역가 측정)

◦ 3set의 희석보체 준비 (1:400, 1:500, 1:600)

원액보체 0.2㎖+희석액 1.8㎖ (1:10배 희석)

⇒ 희석(1:10배)액 0.2㎖+희석액 9.8㎖(1:500배)

⇒ 1:500배 희석보체는 최소한 냉장고에 20분 보관 후 사용

시험관번호 (15㎖ 원심관)	1	2	3	4	5	6
희석보체 (㎖)	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0	1.1
Buffer (㎖)	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1
H.S (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8

◦ Gently mixing

◦ Incubated in a water bath of 37℃ for 30minutes(15분에 한 번 정도 섞어줌)

◦ 30분 감작 후 cold 희석 액 2㎖를 각각의 시험관에 첨가하여 3,000rpm에서 5분간 원심 한 다음 상층 액의 100㎕를 ELISA reader 540㎚ filter에서 O.D치를 측정한다.

◦ 만약 각 시험관의 O.D 수치를 측정하여 다음의 공식에 따라 계산하여 용혈정도의 그래프를 그린 다음 50% 용혈(1C'H50)에 해당하는 보체의 농도를 결정

각 시험관의 O.D치 × 100	= 용혈정도 %
0.155 (Target O.D)

※ 보체 및 hemolysin 역가 산정시 반드시 target O.D의 값이 같은 조건으로 나누어져야 함.

Calculation of the % of hemolysis in complement titration
Dose fo Complement	O.D	% Hemolysis (Y)	Y/(100-Y)
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1	0.05 0.06 0.07 0.08 0.10 0.11	34 41 49 55 71 76	34/66 = 0.52 41/59 = 0.70 49/51 = 0.96 55/45 = 1.22 71/29 = 2.45 76/24 = 3.17

보

체

농

도

1.4

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.1

0.1

0.4

0.6

0.8

1

1.4

1.6

1.8

2

4

6

8

×

×

0.76

×

×

y(100-y)

50% 용혈을 일으키는 보체역가 측정(1CH50)

※ 5.5C'H50의 계산법 (본 시험에 사용되는 보체의 희석)

- 전술한 도표 및 그래프에서 희석된 보체(1:400)에서 1C'H50의 O.D치가 0.76이었다면, 5.5C'H50은 얼마인가?

보체의 역가 희석배수	=	보체의 역가 희석(X)
5.5C'H50		0.4

X =	160		=	38
	4.18

- 희석 되지 않고 보존된 보체원액을 38배로 희석하여 사용하면 5.5C'H50이 된다.

8. Antigen (항원)

◦ 희석항원을 매일 만들어 사용한다.

◦ 항원은 반드시 제조자 또는 회사가 정해준대로 검사에 필요한 양만 희석하여 사용할 것.

9. Inactivation of Sera (혈청 비동화)

◦ 항온수조에서 또는 인큐베이터에(뚜껑 닫은 다음 tape로 부착) 58℃ 30분 동안 비동화.

(비동화는 반드시 희석하지 말고 혈청자체만 비동화 시킨 후 5배 희석하여 실험에 들어 갈 것)

◦ Anti-complementary activity (ACA)

① 혈청 속에는 자연적인 ACA가 있음 ⇐ 열처리에 의하여 파괴됨

② 세균의 감염 시 ACA ⇐ 혈청을 고속원심분리 후에 사용 (8,000g×5분)

10. Main Test (본시험)

[방법 1] Routine preparation (일반적인 방법)

A. 양성/음성 대조군 plate

◦ 비동화 처리한 양성/음성 대조군혈청을 준비한다.（대조군 혈청은 희석하지 않는다)

◦ 양성/음성 대조군 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 플레이트의 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ A1 well에 양성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ B1 well에 음성대조군 혈청을 25㎕ 분주한 후 이진 희석한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 A, B열 전 well(A1-12, B1-12)에 분주한다.

B.  Complement control plate

◦ CFT 희석용액 25㎕를 G10-12, H10-12 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 G9-10, H9-10 well에 분주한다.

◦ 두 번째 well(G10, H10)에서부터 이진 희석한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well(G9-12, H9-12 )에 분주한다.

<양성/음성 대조군 & Complement Control plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024	1/2,048	1/4,096	1/8,192
A	P.S
B	N.S
C
D
E
F
G									Complement control
H

C. 검사혈청 plate

◦ 비동화 처리한  검사혈청을  CFT 희석용액으로 5배 희석한다.

◦ 검사 혈청 titration 플레이트를 준비한다.

◦ CFT 희석용액 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 검사혈청 25㎕를 해당 well에 분주한다.

◦ 희석된 antigen 25㎕를 전 well에 분주한다.

◦ 희석된 complement 25㎕를 전 well에 분주한다.

<검사혈청 plate layout>

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	시료1	시료9
B	시료2	시료10
C	시료3
D	시료4
E	시료5
F	시료6
G	시료7
H	시료8

D. 플레이트를 37℃에서 1시간 반응시킨다. (gently shaking)

E. Haemolytic system 준비 : 배양을 마치기 20분전에 2% RBC와 동량의 적정희석 된     Hemolysin을 섞은 후 10분 간 감작 시킨다.

F. Haemolytic system 50㎕를 전 well에 분주한 후 37℃에서 45분간 반응시킨다.    (gently shaking)

G. 플레이트를 1,840g 4분 원심분리 후 결과를 판독한다.

[방법 2] End-point titration : 검사혈청에서 양성결과를 보이는 경우 실시

시험관번호 (96 well)	1	2	3	4	5	6	7	8
Dilution	비동화 혈청	1:2	1:4 A/C	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Serum (㎕)	50
Buffer (㎕)		25	25	25	25	25	25	25
Dilute (㎕)		25	25	25	25	25	25	25	25버림
Buffer (㎕)			25
Antigen (㎕)				25	25	25	25	25
Complement			25	25	25	25	25	25
		◦ Plate는 여러 겹으로 쌓으면 안 됨 ◦ 처음 1분간 Shaking ◦ incubate at 37℃ 1시간 배양 ◦ 배양을 마치기 20분 전에 2%RBC와 동량의 적정희석 된 Hemolysin을 섞은 후 10분 간 감작하여 사용
H.S.			50	50	50	50	50	50	50
		◦ incubate at 37℃ 45분 ◦ 20분에 한번 Shaking ◦ 4℃ 에서 3-4시간 정치 또는 1840g 4분 원심 후 판독

11. 보체결합반응에 대한 시약 대조

번호	대조 목적	VBD	항원	보체	감작 RBC	2% RBC	결과
1	Ag anticomplementary	.025	.025	.025	.05		0
2	Ag-hemolysin-hemolytic	.05	.025		.05		4
3	C' 5.5(C'H50) units	.05		.025	.05		0
4	C' 2.75(C'H50) units	.05		(.025)	.05		+/-
5	C' 2.75(C'H50) units w/Ag	.025	.025	(.025)	.05		+/-
6	Hemolysin-hemolytic	.075			.05		4
7	Saline-hemolytic	.10				.025	4
8	C'-hemolytic	.075		.025		.025	4
9	Ag-hemolytic	.075	.025			.025	4

12. 판정기준

Percent Hemolysis	판 독	결 과
0%	4+	양성
25%	3+	의심
50%	2+	의심
75%	1+	의심
Few cells remaining	Trace	음성
100%	음성	음성

아나플라즈마병 Anaplasmosis
	카드응집반응법 Card Agglutination Test
			미국 NVSL

1. 냉장고에 보존해둔 검사혈청을 꺼내어 실온에 30분~1시간 방치

2. 사용하기 전에 BSF(Bivine serum factor) 분주병을 흔들어 사용하고 BSF 검사용 카드 원형(18mm)의 상단에 BSF 희석액 30㎕(한방울)을 떨어뜨린다.

3. BAA(Buffered Anaplasma Antigen) 15㎕(1~2방울)을 옆에 섞이지 않도록 떨어뜨린다.

4. 검사혈청을 Capillary로 30㎕ 떨어뜨린다.

5. 위 세 가지를 면봉대로 잘 섞어 원 전체에 퍼지도록 한다.

6. Rocking machine에 얹어 4분간 흔든다.

7. 판독시 2~3회간 카드를 흔들어 판독

8. 실험결과

: 응집 없음

+ : 응집

9. 양성(강양성, 약양성) 표준혈청, 음성표준 혈청을 대조군으로 사용

※ BSF 제조방법

BSF 한 vial을 D.W 4.0㎖에 잘 용해시킨 후 분주병에 넣는다.

바베시아병 Babesiosis
	형광항체법 Fluorescent Antibody Test
			미국 NVSL

1. 준비

가. 냉동 보관된 혈액도말 항원슬라이드를 꺼내어 30-45분간 두어 온도가 올라감과 동시에 건조되도록 한다.

나. lot 번호나 다른 정보 등 슬라이드에 관한 정보들을 test sheet에 적어둔다.

다. 양성 및 음성 항혈청을 해동시키고 test sheet에 lot number를 기록한다.

2. 항혈청 및 가검혈청 희석

가. 항혈청과 가검혈청을 1% Goat serum를 첨가한 1X IFA PBS buffer (1㎖ Goat serum/100㎖PBS)로 아래와 같이 희석한다.

[항혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 1:10에서 1:80으로 희석한 다음, 단계희석하여 1:1280까지 희석한다.

(즉, 1:80 → 1:160 → 1:320 → 1:640 → 1:1280)

[가검혈청]

a. Working dilution 1:10

b. 가검혈청을 1:80까지 희석한다. (cf. 소 파이로플라즈마병은 1:160)

나. 가검혈청의 accession/I.D. number를 확실히 test sheet에 기입해 둔다.

3. 항원 슬라이드 준비

가. 혈액도말 항원슬라이드에 메니큐어로 사각형을 그리거나, 4줄의 선을 긋는다.

단, 이때 반드시 슬라이드의 혈액이 도말된 면에 그린다.

I										II
□ □ □ □ □ □ □
□ □ □ □ □ □ □	혹은
□ □ □ □ □ □ □

4. 초기 배양 - 항원항체 반응

가. 희석된 혈청 0.01㎖ (10㎕)를 각각의 사각형 안에 떨어뜨린다. test sheet에 pattern을 기록해 둔다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 마지막 세척 후, 슬라이드 뒷면을 흐르는 수돗물에 가볍게 헹군다.

마. 슬라이드를 최소 30분 동안 37℃에서 건조시키거나, 헤어드라이어로 말려준다.

5. Fluorescein Labeled (FITC) Affinity Purified Antibody 준비

가. 냉장고에서 fluorescein labeled (FITC) affinity purified antibody를 꺼낸다.

나. FITC affinity purified antibody를 1X IFA PBS buffer로 1:10으로 희석한 후, 1:80으로 희석한다. ; Equine FITC antibody 1:80 dilution

(cf. Bovine FITC antibody 1:200 dilution)

다. 희석된 항원을 잘 혼합한 후, 10-30㎕의 Evans Blue Counterstain (Sigma)을 최종 희석된 FITC affinity antibody에 넣어 반투명하게 만들어 준다.

6. 최종 배양 - Labeling Step

가. FITC affinity purified antibody를 10㎕씩 슬라이드의 각 네모칸 안에 떨어뜨린다.

나. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

다. 1X IFA PBS (without goat serum)로 각각 10분씩 2-3회 세척한다. 만약 결과를 좀 더 빨리 보고자 한다면 린스 시간을 단축시킬 수 있다.

라. 빛을 완전히 차단한 37℃의 배양기에서 30분간 건조시키거나, 헤어드라이어를 사용하여 말려준다.

7. IFA 슬라이드 판독

가. 슬라이드가 안전 건조되었는지 확인한다.

나. 동량의 IFA PBS (without goat serum)와 glycerol을 혼합하여 50% glycerol buffer를 만들어 X10, X100배의 형광현미경으로 검경한다.

바베시아병 Babesiosis
형광항체법 Babesia bovis IFA IgG Antibody Kit
	미국 FULLER

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온(18-26℃)에 꺼내놓는다.

나. 양성/음성 대조군 혈청 및 가검혈청을 PBS buffer로 아래와 같이 희석한다.

◦ 양성대조군 혈청 : 1:40 & 추가 희석 (1:160-1:640)

◦ 음성대조군 혈청, 가검혈청 : 1:40

다. 희석된 혈청 10㎕를 항원이 코팅된 슬라이드의 각 well에 분주하고,        test sheet에 위치를 잘 기록해 둔다.

라. 슬라이드를 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

마. 슬라이드를 PBS로 3회 세척한다.

바. Conjugate 1 drop(10㎕)을 슬라이드의 각 well에 분주한다.

사. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

아. 슬라이드를 PBS로 3회 세척한다.

자. Mounting medium을 3-4 drops 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮고  400×의 형광현미경으로 검경한다.

2. 판정

감염된 적혈구내에 appple-green inclusion bodies가 관찰되면 양성으로 판정한다.

바베시아병 Babesiosis
형광항체법 Babesia bigemina IFA IgG Antibody Kit
	미국 FULLER

1. 검사방법

가. 실험 전 kit를 미리 실온(18-26℃)에 꺼내놓는다.

나. 양성/음성 대조군 혈청 및 가검혈청을 PBS buffer로 아래와 같이 희석한다.

◦ 양성대조군 혈청 : 1:80 & 추가 희석 (1:320-1:1,280)

◦ 음성대조군 혈청, 가검혈청 : 1:80

다. 희석된 혈청 10㎕를 항원이 코팅된 슬라이드의 각 well에 분주하고,        test sheet에 위치를 잘 기록해 둔다.

라. 슬라이드를 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

마. 슬라이드를 PBS로 3회 세척한다.

바. Conjugate 1 drop(10㎕)을 슬라이드의 각 well에 분주한다.

사. 슬라이드를 빛이 닿지 않게 한 후, 습윤챔버에 넣고 37℃에서 30분간 배양한다.

아. 슬라이드를 PBS로 3회 세척한다.

자. Mounting medium을 3-4 drops 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮고  400×의 형광현미경으로 검경한다.

2. 판정

감염된 적혈구내에 appple-green inclusion bodies가 관찰되면 양성으로 판정한다.

<Babesia bigemina>

바베시아병 Babesiosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
	Wright-Giemsa Stain

1. 재료 및 시약

1) Wright-Giemsa Solution

⋅Powdered commercial Wright stain	61.85g

⋅Powdered commercial Giemsa stain	6.87g

⋅Glycerin	620㎖

⋅Absolute methyl alcohol	20㎖

2) Wright-Giemsa stain buffer solution

⋅Potassium phosphate monobasic (KH2PO4, M.W.=136.09)	5.418g

⋅Sodium phosphate dibasic 12-hydrate	4.515g

(Na2HPO4, 12H2O, M.W.= 358.16)

⋅D.W. upto	12㎖

3) Materials

⋅1×3 inch microscope slide

⋅Container

2. 시약의 제조

1) 정확히 무게를 측정한다.

2) Powder를 약절구에 넣고 glycerin을 반 정도 넣고 갈아서 Methyl alcohol를 소량 부어서 잘 녹이면서 저장 탱크에 담는다.

3) 만들어진 Wright-Giemsa Solution을 잘 혼합하여 냉암소에 3-6개월 성숙시킨 다음에 사용한다.

* commercial Wright-Giemsa Solution Mixture(cat.no. 938016)를 사용 할 수도 있음.

3. 검사방법

1) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 공기 중에 흔들어서 말린다.

2) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 3-5분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

3) 실온에서 슬라이드글라스를 완전히 말린다.

4) DW로 Wright-Giemsa Solution을 희석하여 10%의 용액을 만든 다음 동물별로 아래와 같이 염색시간을 둔다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

5) 염색 후 buffer solution에 12-15번 린스한다.

(dipping time : 1초)

6) 증류수에 12-15번 린스한다 (dipping time : 1초): 2회 반복

7) 슬라이드글라스의 뒷면을 거즈로 물기를 제거한 후 필요하다면 커버글라스를 씌운다.

8) 광학현미경 400배, 1,000배율로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

바베시아병 Babesiosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
Giemsa Stain, modified

1. 재료 및 시약

1) Giemsa Stain (Sigma-Aldrich, Procedure No. GS-10)

-  Giemsa Stain, modified, 0.4% w/w, in a buffered methanol solution,        pH 6.9, with stabilizers

2) Materials

- 1×3 inch microscope slide

- Container

2. 검사방법

1) Standard Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 5-7분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

③ 슬라이드를 공기 중에 말린다.

④ Giemsa stain을 증류수로 1:20배 한 용액으로 15-60분간 염색한다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

⑤ 증류수로 린스한다.

⑥ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

2) Quick Stain Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 희석하지 않은 Giemsa stain에 1-2분간 염색한다.

③ 증류수에 2-4분간 둔다.

④ 증류수로 린스한다.

⑤ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

타일레리아병 Theileriosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
	Wright-Giemsa Stain

1. 재료 및 시약

1) Wright-Giemsa Solution

⋅Powdered commercial Wright stain	61.85g

⋅Powdered commercial Giemsa stain	6.87g

⋅Glycerin	620㎖

⋅Absolute methyl alcohol	20㎖

2) Wright-Giemsa stain buffer solution

⋅Potassium phosphate monobasic (KH2PO4, M.W.=136.09)	5.418g

⋅Sodium phosphate dibasic 12-hydrate	4.515g

(Na2HPO4, 12H2O, M.W.= 358.16)

⋅D.W. upto	12㎖

3) Materials

⋅1×3 inch microscope slide

⋅Container

2. 시약의 제조

1) 정확히 무게를 측정한다.

2) Powder를 약절구에 넣고 glycerin을 반 정도 넣고 갈아서 Methyl alcohol를 소량 부어서 잘 녹이면서 저장 탱크에 담는다.

3) 만들어진 Wright-Giemsa Solution을 잘 혼합하여 냉암소에 3-6개월 성숙시킨 다음에 사용한다.

* commercial Wright-Giemsa Solution Mixture(cat.no. 938016)를 사용 할 수도 있음.

3. 검사방법

1) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 공기 중에 흔들어서 말린다.

2) 혈액도말 한 슬라이드글라스를 3-5분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

3) 실온에서 슬라이드글라스를 완전히 말린다.

4) DW로 Wright-Giemsa Solution을 희석하여 10%의 용액을 만든 다음 동물별로 아래와 같이 염색시간을 둔다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

5) 염색 후 buffer solution에 12-15번 린스한다.

(dipping time : 1초)

6) 증류수에 12-15번 린스한다 (dipping time : 1초): 2회 반복

7) 슬라이드글라스의 뒷면을 거즈로 물기를 제거한 후 필요하다면 커버글라스를 씌운다.

8) 광학현미경 400배, 1,000배율로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

타일레리아병 Theileriosis
혈액도말표본검사 Agent Identification
Giemsa Stain, modified

1. 재료 및 시약

1) Giemsa Stain (Sigma-Aldrich, Procedure No. GS-10)

-  Giemsa Stain, modified, 0.4% w/w, in a buffered methanol solution,        pH 6.9, with stabilizers

2) Materials

- 1×3 inch microscope slide

- Container

2. 검사방법

1) Standard Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 5-7분간 absolute Methanol에 고정시킨다.

③ 슬라이드를 공기 중에 말린다.

④ Giemsa stain을 증류수로 1:20배 한 용액으로 15-60분간 염색한다.

동 물 별	염 색 시 간
말	16분
소	16분
사슴	40분
양	30분

⑤ 증류수로 린스한다.

⑥ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

2) Quick Stain Giemsa

① 혈액도말 한 슬라이드를 공기 중에 말린다.

② 슬라이드를 희석하지 않은 Giemsa stain에 1-2분간 염색한다.

③ 증류수에 2-4분간 둔다.

④ 증류수로 린스한다.

⑤ 슬라이드를 공기 중에 말린 후, 광학현미경으로 혈구 내 기생충을 관찰한다.

트리코모나스병 Tricomonosis
	원인체 동정 Agent Identification
			미국 NVSL

A. 직접배양법 (Direct culture method)

1. 검사준비물

◦ 현미경 암시야	◦ Bovine sera(FBS)

◦ 슬라이드	◦ 파스퇴르 피펫

◦ Penicillin G(1,000,000 units/㎖)	◦ Streptomycin Sulfate

◦ Screw cap이 있는 Cultrue tubes	◦ 멸균된 D.W.

◦ Sodium hydroxide	◦ Methanol

◦ Giemsa's Stain Stock Soln.	◦ Bacto-Peptone

◦ D-Glucose	◦ Bacto Beef Extract

◦ Sodium Chloride	◦ Bacto Agar

◦ Sodium phosphate momobasic (NaH2PO4‧H2O)

◦ Disodium phosphate dibasic(Na2HPO4 Andydrous)

2. 시약 제조

◦ Fetal calf serum(또는 beef serum)의 비동화

① 56℃, 30분간 항온수조

② 멸균된 0.45㎛ Millipore filter(또는 이와 동등한)로 여과

③ 냉장고 또는 냉동고에 보관(2개월 이상 보관한 것은 사용하지 말 것)

◦ 1% NaOH Soln.

① NaOH 1g를 99㎖ D.W에 가하여 완전히 용해될 때까지 magnetic Stirrer로 젓는다.

② 시약병에 보관

◦ Penicillin-Strptomycin soln. 준비

① 멸균된 D.W 4㎖에 Streptomycin 1g을 가하고 용해되도록 진탕

② 멸균된 D.W 4㎖에 penicillin 1,000,000 units를 가하고 용해되도록 진탕

③ Streptomycin soln과 혼합하여 10㎖이 되도록 멸균 D.W를 가하고 잘 진탕

④ 1㎖ screw top vials에 분주하여 -20℃에서 보관

◦ Winters' Trichomonas Medium의 준비

① 1ℓ의 D.W에 3g beef extract, 10g bacto-peptone, 10g D-Glucose, 1g

Sodium Chloride, 0.9g agar를 가하고 가열하여 용해

② 1% NaOH로 pH7.4가 되도록 맞추고 flask를 멸균하여 실온에서 냉각

③ 비동화된 Fetal calf serum(또는 beef serum) 20㎖를 가한 후에 tube 10㎖씩 무균적으로 분주

④ tube에 penicillin-streptomycin 혼합액 0.1㎖를 가하여 사용(항생제를 가한지 2주가 지난 배지는 사용하지 말 것)

◦ buffered Saline transport medium의 준비

① buffer(pH 7.4)를 준비

- Sodium phosphate monobasic ....................................... 28.81g

- Sodium phosphate dibasic .............................................. 125.0g

- distilled water ................................................................... 1.0ℓ를 가함.

② bufferd salin soln의 준비

- buffer soln ........................................................................... 20㎖

- sodium chloride ................................................................. 8.5g

- distilled water .................................................................... 1.0ℓ를 가함.

③ Saline transport medium

- buffered saline soln 100㎖당 fetal calf serum 5㎖씩 가한다.

- tube에 10㎖씩 무균적으로 분주

◦ Giemsa's Stain soln의 준비

- Giemsa's soln은 사용하기 직전에 제조하고 Coplin jar에 D.W 50㎖를 넣고 Giemsa's stain stock soln. 1㎖를 가하고 잘 젓는다.

3. 검사절차

① 멸균된 Winters’ 배지나 수송배지에 시료 0.5㎖를 접종한다.

② 접종된 Winters’ 배지를 37℃에서 배양하고, 수송배지에 채취된 시료는 Winters’	배지에 1㎖씩 무균적으로 접종한 뒤 37℃에서 5일간 배양한다.

③ 배양 2일째, 3일째, 5일째 검경한다.

- 멸균된 파스퇴르 피펫으로 tube 밑바닥의 2～3방울을 슬라이드 위에 놓고, 암시야현미경으로 검경

※ 형태학적 검사를 위한 염색

① 슬라이드에 얇게 도말하여 공기중에 건조시킨 뒤 Coplin jar에 30초간 Methanol로 고정

② 슬라이드를 Giemsa's stain soln에 45분간 옮긴 뒤 공기중에 건조하여 검경

4. 결과 해석

① 원인체의 특이한 운동성, 전형적인 형태로 판정

(의심되는 경우 보관용 원인체와 비교)

② 원인체는 방추체 모양 또는 서양배 모양으로 길이 10~25㎛, 폭 3~15㎛이며, 3개의 전편모(Anterior flagellae), 1개의 후편모가 있고, 파동막은 몸 전체에 뻗쳐 있으며, 축색(axostyle)은 두껍고 몸의 후단으로부터 돌출되어 있음.

5. 원인체 보관

① 항생제를 첨가하지 않는 멸균된 Winters’ 배지를 사용

② 배양 tubes의 밑바닥에서 0.1㎖를 무균적으로 취하여 접종

③ 30℃, 37℃에서 3~4일간 배양한다.

부저병 Foulbrood
원인체 동정	Agent Identification

1. 아메리칸 부저병 (American Foulbrood, AFB)

A. 현미경 검사

1) 슬라이드글라스를 2～3장 깨끗이 닦는다.

2) 꿀벌 시료 중에서 죽었거나 또는 건강하지 않은 유충벌의 적당량(20～30마리) 을 Lab. blender 봉지에 채취한다.

3) 채취된 시료봉지에 멸균된 증류수를 10㎖ 정도 첨가하여 Lab. blender를 사용하여 균질화 시킨다.

4) 균질화된 시료액 25㎕ 정도를 슬라이드글라스 위에 직경 0.5㎝ 정도의 원형으로 도포한다.

5) 자연상태에서 슬라이드를 건조시킨다.

6) 알콜램프에서 슬라이드에 열을 가하여 화염 고정

7) 0.2% Carbol fuchsin 용액을 사용하여 30초간 염색

8) 수돗물로 세척

9) 자연상태로 건조 또는 blot dry

10) 현미경 1000×배율에서 슬라이드를 관찰하여 아포를 형성한 그람양성간균의 존재유무 확인

11) 양성 판정 : Bacillus larvae균 확인

B. 원인체 동정

1) 5부 유리시험관에 5개 증류수 9㎖ 분주

2) 죽은 유충벌 또는 성충벌 10마리 정도를 짓이겨서 시험관에 넣어 잘 혼합시킴.

3) 시료가 담긴 시험관은 70℃의 항온수조에서 15분간 방치시킨 다음 냉각

4) 상기의 현탁액을 1～2 loop씩 취하여 Brain heart infusion 평판배지에 도말 (표준균주도 같이 배양)

5) 페트리디쉬를 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 2～3일간 배양

6) 배양 2일째부터 plate를 검사하여 의심되는 집락(small and opaque) 선발

7) 의심되는 집락에 대하여는 다음의 간이검사 실시

구분	그람염색	Catalose검사	Nitrate reduction	Nutrient 평판배지	운동성
표준균주	그람양성 아포형성간균	-Ve	+Ve	비발육	+Ve

8) 상기 7번의 검사결과 표준균주와 동일시에 기타의 생화학적 성상검사와 비교(Bergey's manual of systematic Bacterilogy) 및 항혈청 응집반응검사를 실시하여 최종 판정

2. 유럽피안 부저병(European Foulbrood, EFB)

A. 현미경 검사

1) 슬라이드글라스를 2～3장 깨끗이 닦음.

2) 꿀벌 시료에서 추출한 mid-gut의 내용물을 슬라이드글라스 위에 놓는다.

3) 5% nigrosin 용액 20～30㎕을 시료 위에 적하 한 다음 1㎠ 정도의 크기로 도말한다.

4) 슬라이드를 자연건조

5) 알콜램프에서 슬라이드를 약하게 화염 고정

6) 현미경 1000×배율에서 슬라이드 관찰하여 시료중에 많은 0.5×1.0㎛ 크기의 lanceolate cocci가 관찰시 양성 판정

B. 원인체동정 (Melissococcus pluton)

1) Melissococcus pluton의 선택배지 제조

◦ Yeast extract	10g

◦ Cysteine 또는 Cystine	0.2～2g

◦ Glucose 또는 fructose	10g

◦ Soluble Starch	10g

◦ 1 M KH2PO4(pH 6.6)	100㎖

◦ Agar	15g

◦ D.W.	900㎖

2) 116℃ 20분(121℃에서1 5분간) 고압멸균후 페트리디쉬에 분주

3) 꿀벌 5마리 정도에서 적출한 mid-gut의 내용물을 상기의 배지 3장에 도말

(표준균주도 같이 배양)

4) 페트리디쉬를 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 2～4일간 배양

5) 배양 2일째부터 plate를 검사하여 의심되는 집락(small white opaque)을 선발

6) 의심되는 집락에 대하여는 다음의 간이검사 실시

구분	집락형태	그람염색
표준균주	small and opaque	lamceo late cocci

7) 상기 6번의 검사결과 표준균주의 성상과 동일시에 기타의 생화학적 성상검사와 비교

8) 항혈청 응집반응검사 실시하여 최종판정

※ 소비 시료

- 무균적으로 5×5cm2크기로 3곳의 소비 내 밀랍을 채취

- 채취된 소비밀랍을 1cm간격으로 절단

- 시료가 담긴 시험관에 멸균 D.W. 10ml 분주후 70℃ 항온수조에 15분간 방치 후 냉각

- 상기 현탁액을 1~2 loop씩 취하여 Brain heart infusion 평판배지에 도말 (표준균주도 함께 처리)

- 페트리디쉬를 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 인큐베이터에서 2~3일간 배양

- 배양 2일째 plate를 검사하여 의심집락 선발

부저병 Foulbrood
홀스트씨 우유검사	Holst's Milk Test

1. 4부 유리시험관에 1% Skim milk(탈지분유) 용액을 3㎖ 분주.

2. 죽은 유충벌 또는 성충벌 2～3마리를 상기의 시험관에 혼합하여 잘 혼합한다.

3. 37℃ 배양기에서 20분간 반응한 다음 판정.

4. 판정	양성 : 황갈색

음성 : Skim milk용액 색깔 변화 없음.

석고병 및 백묵병 Stone Disease & Chalkbrood Disease
	원인체 동정 Agent Identification

1. 실험재료 및 장비

◦ 꿀벌유충 및 성충	◦ Lab blender

◦ 현미경	◦ 인큐베이터

◦ 생리식염수	◦ 항온수조

◦ 알콜램프	◦ 각종 증균배지 및 선택배지

2. 곰팡이 분리 배지인 Sabraud Dextrose agar, MY40배지, 오토밀 맥아한천배지 중에서 2종을 제작

3. 꿀벌 50마리 정도를 무균봉지(Lab blender 백)에 담고 멸균생리식염수 20㎖ 정도 첨가

4. Lab blender를 사용하여 시료를 균질화

5. 균질화 된 부유액을 상기의 선택배지에 직접 도말하여 25～30℃ 배양기에서 3～4일간 배양(표준 진균대조군도 같이 배양)

6. 배양 3일째 의심되는 집락을 선발

7. 의심되는 집락을 성상 검사하여 판정

낭충봉아부패병/ 부저병 / 석고병/ 백묵병 Sacbrood Disease etc
	PCR 진단법

○ 시료 준비

- 벌 5마리를 준비한다.

- 유발에 5마리를 넣고 액체질소를 이용하여 벌을 곱게 간다.

- 벌이 있는 유발에 PBS 2㎖를 넣고 마저 간다.

- 벌이 다 갈렸으면 2ml tube에 담아 원심분리 한다. @13,000rpm 10min

- 1.5ml tube에 상층액을 분리하고 pellet은 버린다.

○ RNA 추출 키트를 이용하여 가검물(꿀벌, 애벌레 등)로부터 RNA를 추출하여 PCR

○ 결과 판독

1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 특이 유전자 증폭산물을 확인한다.

〈낭충봉아부패병〉

Primer	Nucleotide positions*	Primer Sequence(5’→3’)	Size (bp)	Anealing Temp(°C)
SBV	221‐708	Forward 5’‐ACCAACCGATTCCTCAGTAG‐3’	487	55
		Reverse 5’‐CCTTGGAACTCTGCTGTGTA‐3’
CSBV	7747‐8171	Forward 5’‐GGATGAAAGGAAATTACCAG‐3’	426	55
		Reverse 5’‐CCACTAGGTGATCCACACT‐3’
SBV‐R2	221‐479	Forward 5’‐ACCAACCGATTCCTCAGTAG‐3’	258	52
		Reverse 5’‐TCTTCGTCCACTCTCATCAC‐3’

*UK reference strain AF092924

# Reference: Grabensteiner et al.(2001,2007), Liu X et al.(2010), MS Yoo et al.(2007)

〈미국부저병, 유럽 부저병〉

Name	Primer Sequence(5’→3’)	size(bp)	Anealing Temp(°C)
AFB	Forward 5’‐GTG TTT CCT TCG GGA GAC G‐3’	233	55
	Reverse 5’‐CTC TAG GTC GGC TAC GCA TC‐3’
EFB	Forward 5’‐AAG AGT AAC TGT TTT CCT CG‐3’	564	45
	Reverse 5’‐ACG CCT TAG AGA TAA GGT TT‐3’

〈석고병, 백묵병〉

Name	Primer Sequence(5’→3’)	size(bp)	Anealing Temp(°C)
ASP	Forward 5’‐GTG TTT CCT TCG GGA GAC G‐3’	312	55
	Reverse 5’‐CTC TAG GTC GGC TAC GCA TC‐3’
ASCO	Forward 5’‐AAG AGT AAC TGT TTT CCT CG‐3’	994
	Reverse 5’‐ACG CCT TAG AGA TAA GGT TT‐3’

기생성 응애류 Parasitic Mites
	원인체 동정 Agent Identification

A. 꿀벌 내부기생충검사법(Acarapis woodi)

1. 재료 및 시약

◦ 실체현미경	◦ 배양기 (incubator)

◦ 메스	◦ Lactic acid (85%)

◦ 5% KOH

2. 실험방법

[검사법 1]

가. 날카로운 메스를 이용하여 첫 번째 한 쌍의 다리와 머리를 동시에 제거시키고, 흉부를 요부 가까이에서 절단한다.

나. 이것을 꿀벌의 기관이 노출되게 실체현미경에 놓고 Lactic acid 85%를 흉강내로 떨어뜨린다.

다. 현미경 관찰

라. 감염이 의심되면 기관을 분리하여 슬라이드글라스에 놓고, 커버글라스를 덮은 다음, 광학현미경으로 ×100 시야에서 관찰하여 확인한다.

[검사법 2]

가. 검사법1의 가.를 실시한 후(50마리), 5% KOH 용액에 담가서 37℃ 16～24시간동안 배양한다.

나. 각각의 시료에서 기관을 분리하여 현미경 관찰한다(×40～100).

B. 꿀벌 외부기생충검사법

1. 재료 및 시약

◦ Folbex V.A, 신등전훈연지 등	◦ 확대경

◦ Perizin (Coumafos), 마이캇트 등 분무제	◦ 실체현미경

◦ Apistan (Fluvalinate) 스트립	◦ 여과지

◦ 밀폐용기(주문제작) - 아크릴 박스

2. 실험방법

가. 수입용 벌통(Package bees)을 비스듬하게(약 5～10◦) 기울여서 망사로 된 부분이 상하로 되도록 놓되, 바닥 면에는 확대경으로 확인이 용이하도록 매끄러운 흰 종이 또는 여과지를 놓는다.

나. Folbex V.A 2～6장을 밀폐시킬 상자 또는 벌통에 걸어서 훈연시킨다. 이와 동시에 마이캇트 분무제를 벌통에 분무하면 효과적이다.(500배 희석) 페리진 분무제 사용할 때는 1:50 희석하여 사용한다.

다. 약 1～2시간이 지난 후 상자를 열고 벌통을 좌우로 흔들어 준다.

라. 낙하물을 확대경 또는 육안으로 확인한다.

마. 실체현미경으로 동정을 실시한다.

바. 응애류 동정을 위한 시료는 70% 에틸알코올에 넣어 보관한다.

3. 꿀벌 외부기생성응애류

◦ Acarapis externus	◦ Tropilaelaps claerae

◦ Acarapis dorsalis	◦ Tropilaelaps koenigenum

◦ Varroa jacobsoni	◦ Pyemotes ventricosus

◦ Euvarroa sinhai	◦ Leptus spp.

◦ Varroa underwoodi