[별표3] 생식․발생독성시험

① 시험방법

1. 이 시험기준의 목적은 의약품등의 시험에 현재 사용되고 있는 시험계획들을 기초로 하여 시험 실시 방법을 통합 정리하는 것으로 차세대의 발생에 관여하는 의약품등의 안전성을 충분히 평가할 수 있어야 한다.

2. 동물의 생식․발생의 특정 단계에 시험물질을 투여하는 시험법은 사람에 대한 노출을 잘 반영하고 생식․발생단계별 위험성을 명확하게 식별할 수 있어야 한다. 이러한 접근은 대부분의 의약품등에서 유용하나, 저용량으로 장기간 투여하는 의약품에 있어서는 한 세대 또는 두 세대 시험법이 더 유용한 경우도 있다.

3. 실제 시험계획의 결정에 고려하여야 할 요인은 다음과 같다.

가. 특히, 생식과 관련되어 사용이 예상되는 의약품

나. 사람에게 적용이 예상되는 경로와 제형

다. 기존의 독성 자료, 약물동력학적, 약물동태학적, 구조나 활성에 있어서 다른 물질과의 유사성

4. 어떠한 기준도 가능한 모든 경우를 포괄하는 충분한 정보를 제공하지 못하므로 적절한 시험을 실시하기 위해서는 유연성이 요구된다[주7].  최신의 기술수준에 맞추어 사람과 동물시험의 윤리적 차원에 따라 시험법을 개량하는데 적극적으로 토의하고 고려하여야 한다.

② 시험단계별 검토사항

1. 생식․발생독성시험은 시험실시 및 결과의 해석에 모든 약리, 독성 자료를 사람에 대한 생식․발생의 위험성과 연관시켜 비교 검토하여야 한다.

2. 시험을 선택 또는 조합하는 경우 성숙동물 및 수정에서부터 성적 성숙에 이르는 발생의 전 과정에 걸쳐 약물이 노출되어야 한다. 이 경우 노출에 의해 즉시 또는 나중에 나타나는 영향을 검출하기 위해서는 하나의 완전한 생명주기 동안 즉, 한 세대의 수정에서부터 다음 세대의 수정까지 지속적으로 관찰하여야 한다. 시험실시의 편의상  연속적인 생식․발생과정을 다음과 같이 세분할 수 있다. 다만, 각 단계의 시기에 대하여는 “시기에 관한 결정”[주8]를 참고한다.

가. 교배전에서 수정까지 (성숙한 암․수동물의 생식능, 배우자의 발생 및 성숙, 교미행동, 수정)

나. 수정에서 착상까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 착상전 발생, 착상)

다. 착상에서 경구개가 닫히는 시기까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 배자 발생, 주요기관의 형성)

라. 경구개가 닫히는 시기에서 임신종료까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 태자의 발생과 성장, 기관 발생과 발달)

마. 출생에서 이유까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 출생자의 출생 후 생활에 대한 적응, 이유전 발달과 성장)

바. 이유에서 성적 성숙까지 (이유후 발달과 성장, 독자적인 생활적응, 완전한 성기능의 확립)

3. 생식․발생독성시험의 선택을 위해서 이 기준은 생식․발생에 대한 영향을 검사하기 위한 시험계획에 나타난 영향의 성격을 규명하기 위한 추가시험을 계획하여야 한다[주9].

4. 선택된 시험의 조합에 있어서는 논리적 근거를 제시하고 투여용량 설정사유도 설명하여야 한다. 최신의 기술수준에 맞추어 시험을 계획하고 화학구조 또는 약효가 유사한 물질의 생식․발생에 미치는 영향에 관한 정보를 고려하여야 한다.

5. 시험동물의 고통을 줄이고, 시험목적을 이루기 위하여 필요한 최소한의 동물을 사용하여야 한다.

6. 예비시험을 한 경우에 전반적인 시험평가에서 그 결과를 고려하고 고찰하여야 한다[주10].

③ 사용동물의 선택기준

1. 사용동물은 건강상태, 수태능, 생식능, 이상의 빈도, 배․태자 사망에 대하여 잘 알려져 있고 각 시험간에 균질한 동물을 선택하여야 한다. 동일시험 및 시험상호간에 있어서 시험 시작시기의 연령, 체중, 출산력 등이 거의 같은 동물을 사용하여야 한다. 교배시점에 젊고 성숙한 동물을 사용하고 암컷은 미교배 동물을 사용하도록 한다. 사용동물의 선택기준은 다음과 같다.

가. 동물 종의 선택과 동물수는 반드시 포유동물을 사용하여야 한다. 배․태자독성 시험에 한하여 두 종류의 포유동물 종이 사용되어져 왔는데 비설치류로서는 토끼를 많이 사용한다. 다만, 토끼가 부적절한 경우 다른 비설치류 또는 다른 설치류를 사용하여도 좋으나 상황에 따라 판단하여야 한다[주11].

나. 다른 시험계로는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 분리된 포유류 또는 비포유류의 세포, 조직, 기관, 또는 개체의 배양계가 고려된다. 이들 시험계는 동물시험과 조합하여 화학구조 또는 약효가 유사한 물질 중에서 의약품으로서의 우선순위를 선택하기 위한 시험 또는 작용기전을 규명하기 위한 이차적인 시험으로서 생식․발생독성시험에서는 일반사항에서 언급한 목적을 달성하기 위하여 현재까지 사용되고 있는 전동물(whole animal)이외의 대체시험계는 없다[주12].

④ 투여용량 등

1. 투여에 대하여 일반적으로 고려해야 할 사항은 다음과 같다.

가. 투여용량

(1) 얻을 수 있는 모든 시험 자료(약리, 단회투여 및 반복투여 독성시험,   독성동태시험, [주13])를 참고하여 고용량을 설정해야 한다.

(2) 2 내지 4주간의 반복투여독성시험과 표준시험법의 생식․발생독성시험  의 투여기간은 매우 유사하다. 충분한 정보가 없을 때에는 예비시험을 하도록 한다[주10].

(3) 고용량이 결정되면, 단계적으로 저용량을 결정하여 용량 간격은 독성동  태시험과 그 외의 독성에 근거하여 설정한다. 무해용량을 설정하도록 하고 용량반응관계를 밝힐 수 있도록 충분히 좁은 용량간격을 설정하는 것이 우선이다[주14].

나. 투여경로 및 빈도

(1) 일반적으로 투여경로는 사람에서의 투여경로와 동일하여야 한다.

(2) 다른 투여경로에 있어서도 같은 독성동태양상을 나타내는 경우에는 단  일투여경로로 받아들여질 수 있다[주15].

(3) 보통 1일 1회 투여하지만 독성동태 변수를 고려하여 투여회수를 조     절하는 것이 고려된다[주16].

다. 동태시험

(1) 생식․발생독성시험을 시작하기 전에 동태시험 정보를 얻는 것이 바람직하다.

(2) 이 시점에서의 정보는 상세하거나 임신 또는 수유중인 동물을 사용한 것일 필요는 없다. 단, 시험을 평가하는 시점에 있어서는 얻어진 시험결과에 따라서 임신 또는 수유동물에서의 상세한 동태시험 정보가 필요하다[주16].

라. 대조군

(1) 대조군 동물은 시험물질 투여군 동물과 같은 방법으로 용매만을 투여하는 것이 권장된다.

(2) 용매에 의한 영향의 가능성이 있거나, 용매가 시험물질의 작용에 영향을 미칠 가능성이 있는 경우 비투여대조군의 설정을 고려하여야 한다.

⑤ 시험계획 및 방법

1. 시험계획을 수립(시험의 조합)할 때는 시험물질과 화학구조 또는 약효가 유사한 물질에 대해 얻은 약리, 독성동태, 독성 자료를 고려하여 가장 적절한 시험계획 및 실시방법을 결정하여야 한다. 우선 의약품에 관한 기존의 기준과 크게 다르지 않은 계획(표준시험법)의 고려가 예상된다. 대부분의 의약품에 대해서는 보통 표준시험법이 적절하다.

2. 그 외의 시험계획, 시험의 조합 및 시험방법도 상황에 따라서는 “표준시험법”과 동등이상으로 유용할 수 있다. 중요한 점은 전체적으로 생식․발생과정의 모든 단계에 걸쳐 직접 또는 간접적인 평가가 이루어져야 한다[주17]. 이 경우 선택한 시험방법의 타당성에 대하여 기술하여야 한다.

가. 표준시험법(The most probable option) 수태능 및 초기배 발생, 출생 전․후 발생 및 모체기능, 배․태자 발생에 미치는 영향에 관한 시험의 조합을 고려할 수 있다.

(1) 수태능 및 초기배 발생시험

1) 암․수 동물에 대하여 교배전부터 교미, 착상까지 시험물질을 투여하여 나타나는 독성 및 장애를 검사한다. 이 시험은 생식․발생과정 단계 [별표3] 제2항 제1호 및 제2호 가목 및 나목의 평가를 포함한다. 암컷에서는 성주기, 수정, 난관내 수송, 착상 및 착상전 단계의 배자발생에 미치는 영향을 검사한다. 수컷에서는 생식기관에 대한 병리조직검사에서 검출되지 않는 기능적인 영향(예: 성적 충동, 부고환내 정자성숙)을 검사한다[주18].

2) 평가항목

(가) 생식세포의 성숙

(나) 교미행동

(다) 수정

(라) 배자의 착상전 단계

(마) 착상

3) 동물

최소한 1종 이상이며, 통상 랫드가 권장된다.

4) 사용 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로 한        다[주19].

5) 투여기간

(가) 특히 정자형성에 미치는 영향에 관한 시험에서는 독성시험에서 얻은 자료(병리조직소견, 생식기관의 무게, 어떤 경우에는 호르몬 측정 자료 및 유전독성 자료)가 유효하게 이용될 수 있다. 적어도 4주간 이상의 반복투여독성시험에서 영향이 없으면 교배전 투여기간을 암컷 2주, 수컷 4주로 설정할 수 있다[주18].

(나) 교배전 투여기간을 설정할 때는 그 이유를 명기하고 타당성을 기  재하여야 한다. 투여기간은 교배기간을 포함하여 수컷은 시험종료까지, 암컷은 적어도 착상까지는 계속 투여하여야 한다.

(다) 다른 시험 자료에서 암․수 동물의 생식기관의 무게 또는 조직소  견에 영향이 인정되는 경우 시험의 정밀도에 의문이 있거나 다른 시험자료가 없는 경우 보다 광범위한 시험 실시의 필요성에 대하여 검토하여야 한다[주18].

6) 교배

암․수 교배비는 1:1이 권장되며 차세대의 모체 및 부체를 식별할 수 있어야 한다[주20].

7) 최종부검

암컷동물은 임신중반 이후 적당한 시기에 부검한다. 수컷은 교미 후 적당한 시기에 부검할 수 있으나 임신성립을 확인한 후에 부검하는 것이 좋다[주21].

8) 관찰

(가) 시험중(모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 최소한 주 1회(교배기간은 제외)

4) 교미 혹은 교미성립전 기간에 미치는 영향 유무를 검사하기 위하여 최소한 교배기간 중에는 매일 질점막상피의 상태를 검사 기록한다.

5) 다른 독성 시험에서 관찰 의의가 인정된 항목

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안적 관찰)

2) 육안적 변화가 인정된 조직・기관을 보존하고 필요시 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위해 대조군의 동일 조직・기관을 충분하게 보존한다.

3) 상황에 따라 조직검사 및 평가를 위하여 모든 동물의 고환, 부고환, 난소, 자궁을 보존하고 병리조직검사와 평가를 한다.

4) 황체수, 착상수[주22]

5) 생존배(태)자수, 사망배(태)자수

정자검사는 관찰된 영향을 확인하기 위하여 또는 그 영향을 보다 상세하게 특징짓기 위하여 이용 가능한 검사이다[주18].

(2) 출생 전․후 발생 및 모체기능시험

1) 암컷에 착상부터 이유까지 시험물질을 노출시켜 임신/수유기의 암컷, 수태산물 및 출생자의 발생에 미치는 독성을 검사한다. 이 시험기간 동안에 유발된 영향은 뒤늦게 발현할 수 있기 때문에 출생자의 성적 성숙기까지 관찰이 계속되어야 한다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호 다목 내지 바목을 평가 : [주23, 24]).

2) 평가되어야 할 부작용

(가) 비임신 암컷동물과 비교할 때 독성의 증가

(나) 출생 전 및 출생 후의 배자․태자․출생자의 사망

(다) 성장 및 발달의 변화

(라) 행동, 성숙(성적 성숙) 및 생식기능(차세대)을 포함한 출생자의 기능장애

3) 동물

최소한 1종 이상이며, 통상 랫드가 권장된다.

4) 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로     한다[주19].

5) 투여기간

착상부터 이유기까지로 한다.

6) 시험방법

암컷을 모두 분만시켜 차세대를 포육하도록 한다. 이유시에 한배당 암․수 각 1마리씩을 선택하여(선택법을 기재할 것) 성적 성숙기까지 기른 후, 생식능을 평가하기 위해 교배시킨다[주25].

7) 관찰

(가) 시험중(모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 분만할 때까지 최소한 주 1회

4) 다른 독성시험 결과에서 관찰 의의가 인정되는 항목

5) 임신기간

6) 분만

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안관찰)

2) 육안적 변화가 인정되는 조직․기관은 보존하고 필요에 따라 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위하여 충분한 수의 대조군의 동일 장기 혹은 기관은 보존한다.

3) 착상[주22]

4) 형태이상

5) 출산자

6) 사산자

7) 출생시 체중

8) 이유전, 이유후의 생존율, 성장/체중[주26], 성숙 및 수태능

9) 신체적 발달[주27]

10) 감각기능 및 반사[주27]

11) 행동[주27]

(3) 배․태자 발생시험

1) 착상부터 경구개가 폐쇄되는 시기까지 임신중의 암컷에 시험물질을 투여하여 모체와 배・태자의 발생에 미치는 영향을 검사한다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호 다목 및 라목을 평가).

2) 평가되어야 할 부작용

(가) 비임신 암컷과 비교시 독성의 증가

(나) 배․태자의 사망

(다) 성장의 변화

(라) 형태학적인 변화

3) 동물

보통 2종을 사용한다. 1종은 설치류로 랫드가 바람직하다. 다른 1종은   비설치류로 토끼가 바람직하다[주11]. 1종만 사용할 경우에는 그에    대한 타당성을 설명하여야 한다.

4) 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로 한다[주19].

5) 투여기간

착상부터 경구개의 폐쇄까지 투여한다.

6) 시험방법

(가) 분만 하루전에 암컷을 모두 부검한다. 모든 태자의 생사와 이상 유  무를 검사한다. 다른 관찰 결과와의 관련성을 평가하기 위하여, 태자는 개체식별이 되어야 한다[주28].

(나) 내장 및 골격검사를 위하여 별도로 태자를 분류하는 경우 한배새  끼의 약 50% 태자를 골격염색에 사용한다. 내장이상에 있어서는 검사방법에 상관없이 최소한 50%의 태자를 검사한다. 내장검사를 위해서 미세절개방법(신선한 표본의 현미해부법)을 사용하는 경우에는 모든 태자에 대하여 내장과 골격의 이상을 검사하여야 한다.

7) 관찰

(가) 시험중 (모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 최소한 주 1회

4) 다른 독성시험 결과에서 관찰 의의가 인정되는 항목

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안적 관찰)

2) 육안적 변화가 인정되는 조직․기관은 보존하고 필요에 따라 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위하여 충분한 수의 대조군의 동일 장기 혹은 기관은 보존한다.

3) 황체수, 생존 태자수 및 사망배・태자수[주22]

4) 태자의 개체 체중

5) 태자의 이상[주28]

6) 태반의 육안적 관찰

나. 단일시험법(Single study design) :

(1) 설치류에서 수태능 및 초기배 발생시험과 출생 전․후 발생 및 모체기  능시험의 투여기간을 하나로 통합하면 생식․발생과정의 단계 제2호 가목에서 바목까지의 평가를 포함하게 된다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호를 참조).

(2) 이 시험에서 태자검사를 실시하고 충분히 높은 용량에서도 명백히 음성  이 나타나는 경우에 한하여 더 이상의 생식․발생독성시험은 요구되지 않는다.

(3) 태자의 형태이상검사로서 배․태자 발생시험을 추가할 수 있으며 이 경  우에는 조합시험법이 된다.

(4) 제 2종 동물의 배․태자 발생시험은 필요하다([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조).

다. 조합시험법(Two study design)

(1) 설치류에서 가장 단순한 조합시험법은 수태능 및 초기배 발생시험과 태  자검사를 포함한 출생 전․후 발생 및 모체기능시험으로 구성된다. 그러나 태자검사를 포함한 출생 전․후 발생 및 모체기능시험에 있어서 사람의 노출량을 초과한 고용량에 있어서도 출생전의 영향이 없는 경우에는 추가로 배․태자 발생시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조)을 시행하여도 사람에 대한 위해성을 평가하는데 큰 차이를 나타내지 않는다.

(2) 다른 시험법으로 수태능 및 초기배 발생시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (1) 참조)에서 암컷동물에 대한 투여를 경구개의 폐쇄까지 계속하고, 배․태자 발생시험방법([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조)에 따라 태자를 검사하여 출생 전․후 발생 및 모체기능시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (2) 참조)을 조합하면, 이것은 표준시험법에서 요구되는 모든 검사가 실시되어 사용동물수는 상당히 줄어들게 된다[주9, 17].

(3) 제 2종 동물의 배․태자 발생시험은 필요하다([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조).

⑥ 통계분석

통계분석은 시험성적을 해석하는 수단으로 기술통계 및 추측통계를 이용한다 [주 29].

⑦ 보고서 작성시 고려사항

보고서를 작성할 때 포함되어야 할 항목은 다음 각호와 같다[주 29-1].

⑧ 생식․발생독성 용어

생식․발생독성에 사용되는 용어는 [주 29-2]와 같다.

⑨ 독성동태시험

생식․발생독성시험 중 독성동태시험은 다음 각 호와 같이 적용할 수 있다.

1.  독성동태시험자료는 동물 종의 선택, 시험계획 및 투여방법을 조정할 필  요성을 제시할 수 있으므로, 생식․발생독성시험의 시작 전에 약물동태정  보를 입수하는 것이 바람직하다. 이때의 약물동태정보는 복잡하거나 또는  임신․수유동물에서 얻은 것일 필요는 없으나 시험결과에 따라서는 시험의 평가시점에 임신 또는 수유동물에서의 약물동태정보가 필요할 수도 있다.

2. 보통 생식․발생독성시험에서 노출의 한계는 모체독성에 따라 결정된다. 따라서 일부 생식․발생독성시험에서, 특히 저독성 화합물의 경우, 독성동태 모니터링의 가치가 있으나 모든 화합물에 대하여 일반적으로 필요한 것은 아니다.

3. 약리반응 또는 독성이 나타나지 않아, 전신적 노출이 충분히 이루어졌는가  의문이 생길 경우에 독성동태자료는 생식과정의 여러 단계에서 투여에 의  한 노출의 평가에 유효하게 응용할 수 있다.

4. 독성동태자료를 얻기 위하여 암컷동물의 여유동물군[주30]을 사용하는 것이 좋다.

5. 수태능시험 : 반복투여독성시험법의 일반적 원칙을 적용한다. 수태능시험을 모니터할 필요성은 사용되는 투여법 및 선택된 동물 종을 이용하여 실시한 그 이전의 시험에서 얻어진 정보에 의해 결정된다.

6. 임신․수유동물에서의 시험은 노출기간 동안의 투여계획은 독성관찰 결과  와 독성동태시험 원칙에 따라 결정되어야 한다. 임신동물과 비임신동물간  에 약물동태가 다를 가능성을 고려할 수 있다. 모체, 배자, 태자 또는 신생  자의 특정 일령에서의 노출평가를 독성동태시험에 포함하는 수도 있다[주31]. 신생자의 노출에 대한 역할을 명확하게 하기 위하여 유즙으로의 분  비를 측정할 수 있다. 어떤 경우에는 배․태자 이행 및 유즙으로의 분비를  조사하기 위하여 추가시험이 필요하거나 적절한 경우도 있다. 시험물질의  태반이행을 증명할 수 없는 동물 종에 대하여는 생식․발생독성시험의 해  석에 주의하여야 한다.