[별표5] 항원성시험

① 시험종류

1. 항원성시험으로 아나필락시스 쇼크 반응시험 및 수동 피부 아나필락시스   반응시험 등을 실시한다. 단, 피부외용제의 경우는 피부감작성시험을 실시한다[주44].

② 아나필락시스 쇼크 반응시험[주45]

1. 시험동물

시험동물은 기니픽을 사용한다.

2. 시험방법

가. 용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다[주46].

나. 투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.

다. 시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다[주47].

라. 시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여[주48] 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다[주48]. 대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다[주47].

마. 모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.

바. 감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에  는 양성대조물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다[주47].

사. 최종 감작 1-3주 후에 시험물질(야기항원)을 정맥내 투여하여 아나필락시스 쇼크 증상의 발현 유무를 검색한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.

3. 결과의 판정

시험결과는 아나필락시스 쇼크 반응시험 판정기준에 따라 판정한다[주49].

③ 수동 피부 아나필락시스 반응시험[주45]

１. 시험동물

이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청 제조에 C57BL/6계 마우스 또는 적당한 근교계 마우스를 사용하며, 반응 야기에는 랫드를 사용하고, 동종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청제조 및 반응 야기에 기니픽을 사용한다.

2. 시험방법

가. 용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다.[주46]

나. 투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.

다. 시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다[주47].

라. 시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여[주47] 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다[주48].  대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다[주47].

마. 모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.

바. 감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에는 양성대조 물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다[주47].

사. 최종 감작 1-3주 후에 채혈하여 항혈청을 개체별로 분리한다.

아. 반응 야기를 위하여 위에서 얻은 개체별 항혈청을 제모한 시험동물의 등부위에 피내주사한다. 항혈청은 적당한 배율까지 연속배수희석(4배, 8배, 16배,...)해서 약 0.05-0.1 ml정도 주사하며 이때 대조군 시험동물의 혈청도 동량 주사한다. 각 혈청당 2-3마리의 시험동물에 주사한다.  감작시킨 시험동물은 사육상자에 넣어 수용하며 24시간 후에 시험물질(야기항원)을 시험동물에 투여한다. 이때 투여할 시험물질 용액은 동량의 1-3%(w/v) Evans blue와 혼합하여 각 시험동물의 정맥내에 투여한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.

자. 야기항원 주사 30분 후에 시험동물 각 개체를 경추탈골 또는 마취하에 치사시켜 등부위 피부를 절취해서 피부안쪽의 청색 반점을 관찰한다.

3. 결과의 판정

출현한 청색반의 장경과 단경의 평균치가 5 mm 이상이면 양성으로 하고, 양     성을 나타내는 가장 마지막 혈청희석액의 희석 배수(최대 희석 배수)를 그      혈청의 최종 역가(항체가)로 정한다.

④ 피부감작성시험[주50]

1.  시험동물

가. 원칙적으로 기니픽을 1주정도 순화하여 사용한다. 암컷을 사용하는 경우에는 임신하지 않은 것 또는 임신의 경험이 없는 것을 사용한다.

나. 시험군은 각 군당 5마리이상으로 하며 원칙적으로 시험물질군, 용매대조군 및 양성대조군을 설정한다.

2. 시험방법

가. 시험물질이 고형제일 경우 증류수 또는 적절한 용매에 습윤시켜 균일하게 적용하며 반고형제 및 액제의 경우 희석하지 않고 사용한다. 에어로졸제는 필요에 따라 희석하여 사용한다.

나. 1차 감작 : 제모한 시험동물의 등부위 피부(약 2×4cm)에 다음과 같은 3종의 시료를 좌우 대칭으로 피내주사한다[주51].

(1) 증류수(또는 생리식염수)와 Freund's Complete Adjuvant(FCA)의 유화물(1:1 혼합물)

(2) 시험물질

(3) 시험물질과 FCA의 유화물(1:1 혼합물)

다. 2차 감작 : 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사했던 부위에 시험물질을  포함하는 패취(2×4cm)를 부착하여 48시간동안 폐색첩포한다[주52].

라. 야기 : 폐색첩포 2주 후 시험동물의 등부위 혹은 측복부(감작부위와는 다  른 부위여야함)를 제모하고 시험물질을 포함하는 패취(2×2cm)를 부착하여 24시간동안 폐색첩포하여 야기시킨다[주52].

3. 결과의 판정

패취제거 24시간 및 48시간 후의 피부반응을 평가[주53]하며 이에 기초하       여 시험물질의 피부감작성을 평가[주54]한다.

⑤ 독성동태시험

항원성시험 중 독성동태시험을 적용할 수 있다.