[별표7] 발암성시험

① 시험동물

1. 시험동물은 6주령까지의 동일 주령의 동물을 사용하며 이유 후 가능한 한  빠른 시기에 투여를 시작하는 것이 바람직하다.

2. 시험동물의 종 및 계통을 선택할 때 감염성질환에 대한 저항성, 수명, 자연  발생종양의 발생빈도, 이미 알려진 발암물질에 대한 감수성 등을 고려한다.

3. 동일한 시험물질에 대하여 발암성 예비시험 및 본시험을 실시할 경우 동일  종 및 계통의 시험동물을 선택한다.

② 시험 종류

시험의 종류는 1종의 설치류에 대한 장기투여 발암성시험과 1종의 추가시험으로 한다. 1종의 설치류에 대한 장기투여 발암성시험에 사용되는 동물종은 확실한 근거가 없는 경우에는 랫드가 권장된다.

1. 추가시험은 다음 각호의 1을 말한다[주58].

가. 단기, 중기 설치류 시험계[주59]

종양발생을 지표로 한 생체내 시험.

(1) 설치류의 개시-촉진(Initiation promotion)모델

(2) 형질전환 설치류를 사용한 발암모델

(3) 신생아 설치류를 사용한 발암모델

나. 다른 1종의 장기발암성 시험

③ 예	비시험

발암성시험에서 이용할 투여량을 결정하기 위하여 발암성 예비시험을 실시할 수 있으며, 발암성 예비시험 기준은 다음 각호와 같다. 다만, 충분히 신뢰할만한 시험결과가 있는 경우 다음 시험의 전부 또는 일부를 생략할 수 있다

1. 단회투여 예비시험

반복투여 예비시험에 대한 최고용량을 결정하기 위하여 적절한 수의 동물을 이용하여 수행한다.

2 반복투여 예비시험

발암성시험에 대한 최고용량을 결정하기 위하여 수행한다.

가. 용량단계는 암․수 각각에 대하여 3단계 이상의 시험군을 설정하고 별도로 대조군을 둔다. 동물수는 각 군당 암․수 각 10마리 정도로 한다. 용량단계는 공비 2 또는 3으로 하는 것이 바람직하다. 최고용량은 독성변화가 나타나는 용량이어야 하나 기술적으로 투여 가능한 최대량에서도 아무런 독성변화가 나타나지 않는 경우에는 그 용량을 최고용량으로 한다.

나. 투여경로는 발암성시험과 동일한 투여경로로 한다. 경구투여의 경우에는 강제투여 또는 사료, 물 등에 혼합하여 자유롭게 섭취되도록 하며, 사료에 혼합하여 투여하는 경우 사료 중 시험물질의 농도는 최고 5%까지로 한다.

다. 투여기간은 90일로 하고 투여는 원칙적으로 주 7일로 한다. 그러나 지연성독성 또는 체내축적성이 있는 시험물질의 경우에는 장기간 투여가 요구될 수 있다.

라. 검사방법은 다음과 같다.

(1) 각 군의 모든 동물에 대하여 일반상태를 매일 관찰하고 체중을 주 1회 이상 측정한다.

(2) 투여기간 중 사망례가 발생할 경우는 즉시, 생존례에 대하여는 투여종료 시점에 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰을 행한다. 또한 육안적으로 변화가 인정되는 기관․조직에 대하여 병리조직학적 검사를 행한다.

3. 발암성시험에서 사용할 최고용량은 발암성 반복투여 예비시험결과 대조군에 비해 10% 이내의 체중증가를 억제하거나 중독에 의한 사망이 없고, 일반상태 및 부검소견에서 현저한 독성변화가 나타나지 않는 양으로 하며, 시험동물의 종 및 성별 등에 따라 결정하는 것이 바람직하다.

④ 용량단계

암․수 각각에 대하여 3단계 이상의 시험군을 설정하고 별도로 대조군을 둔다. 동물수는 암․수 각각에 대하여 1군당 50마리 이상으로 하며, 발암성시험의 용량단계는 다음 각호와 같다[주57].

1. 시험군에 있어서 최고용량은 발암성 반복투여 예비시험의 결과에서 정한 양으로 하고, 최저용량은 원칙적으로 해당 사용 동물 종에서 약리효과가 발현되는 양 또는 추정 임상용량을 기준으로 하며, 중간용량은 최고용량과 최저용량과의 등비중항으로 한다.

2. 예외적으로 사람의 치료량에 비해 현저히 저독성인 경우에는 최고용량을 추정 임상용량의 약 100배로 설정할 수 있으며, 이 경우 해당용량의 설정근거를 제시할 필요가 있다.

3. 일반적으로 최저용량은 최고용량의 10% 이상이 바람직하나, 추정 임상용량과의 차이가 클 경우에는 최고용량의 10% 미만의 용량으로 설정하여도 좋다.

4. 시험물질을 사료 또는 물에 혼합 투여하는 경우에는 투여기간 중 개별 또는 군당 사료섭취량 또는 물섭취량을 측정하여 시험물질 섭취량을 산출하며, 그 측정간격은 투여 개시 후 3개월간은 주 1회 이상, 그 후는 3개월에 1회 이상으로 하는 것이 바람직하다. 또한 시험개시전 및 시험 중에 시험물질의 순도, 안정성 및 불순물을 정성적 또는 정량적으로 분석한다.

5. 대조군은 음성대조군과 필요에 따라 비투여 대조군, 양성대조군을 둔다.

⑤ 시험방법

1. 투여경로는 원칙적으로 임상적용경로로 하고, 경구투여의 경우에는 강제투여 또는 사료, 물 등에 혼합하여 자유롭게 섭취하도록 하며 사료에 혼합하여 투여하는 경우 사료 중 시험물질의 농도는 최고 5%까지로 한다.

2. 투여기간은 랫드에서는 24개월 이상 30개월 이내, 마우스 및 햄스터에서는 18개월 이상 24개월 이내로 하고, 투여는 1일 1회, 주 7회 투여함을 원칙으로 한다.

3. 관찰기간은 시험물질 투여 종료시 또는 투여 종료 후 1-3개월까지로 한다.  저용량군 또는 음성대조군의 누적사망률이 75%가 되는 경우 그 시점에서 생존 동물을 도살하여 시험을 종료한다. 종양이외의 원인에 의한 사망률이 투여 개시 후 랫드에서는 24개월, 마우스 및 햄스터에서는 18개월의 시점에서 50%이내인 것이 바람직하다. 시험동물의 10% 이상이 서로 잡아먹거나 사육상의 문제가 발생하지 않도록 관리한다.

4. 검사방법은 다음 각호와 같다.

가. 각 군의 모든 동물에 대하여 일반 증상을 매일 관찰하고, 체중을 투여 개시 후 3개월간은 주 1회 이상, 그 후는 4주에 1회 이상 측정한다.

나. 시험기간 중의 사망례에 대하여는 신속히 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰 및 병리조직학적 검사를 실시한다.

다. 시험기간 중에 빈사상태의 시험동물에 대하여는 신속히 도살, 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰 및 병리조직학적 검사를 실시한다.  또한 도살시 필요에 따라 혈액을 채취하여 적혈구수 및 백혈구수를 측정하고, 도말검체를 제작하여 빈혈이나 림프절, 간장, 비장의 종대 등 혈액질환이 예상되는 동물에 대하여는 도말검체를 검사한다.

⑥ 결과의 관찰

1.  관찰 종료시의 생존례에 대하여는 각 군의 모든 동물에 대하여 기관․조직  의 육안적 관찰을 실시한다. 병리조직학적 검사는 최고용량군 및 대조군의  모든 동물에 대하여 실시한다. 단, 최고용량군과 대조군 사이에서 종양발생률에 차이가 있는 기관․조직에 대하여는 기타 시험군의 모든 동물에 대하  여도 해당 기관․조직의 병리조직학적 검사를 실시한다.

2. 도살시 필요에 따라서 혈액을 채취하여 적혈구수 및 백혈구수를 측정하고 도말검체를 제작하여, 빈혈이나 림프절, 간장, 비장의 종대 등 혈액질환이 예상되는 예에 대하여는 도말검체를 검사한다.

3. 육안적으로 확인되는 모든 종양성병변은 반드시 검사한다.

4. 원칙적으로 검사하여야 할 장기․조직은 다음과 같다. 피부, 젖샘(유선), 림프절,  침샘(타액선), 흉골, 척추 또는 대퇴골(골수포함), 가슴샘(흉선), 기관, 폐 및  기관지, 심   장, 갑상샘(선) 및 부갑상샘(선), 혀, 식도, 위, 소장, 대장, 간장, 췌장,  비장, 신장, 부신, 방광, 정낭, 전립선, 고환, 부고환, 난소, 자궁, 질, 안구 및 부속기, 뇌, 뇌하수체, 척수. 다만 육안적 소견 등의 판단에 의해 적절히 가감할 수도  있다.

⑦ 독성동태시험

투여용량, 투여방법 및 시험동물 종과 계통을 선택하기 위해 발암성시험 중   독성동태시험을 적용할 수 있다.

1. 용량설정시의 적용 : 선행된 독성시험에서 사용한 시험동물과 다른 종 및 계통을 사용하는 경우와 투여경로 및 투여방법이 다른 경우, 특히 시험물질을 사료에 혼합하여 투여하는 경우에는 독성동태시험 계획 수립시 특별한 주의를 기울여야 한다. 독성동태시험자료는 임상에서의 노출정도를 고려하여 발암성시험 용량을 설정하는데 참고가 되며, 비선형 약물동태에 의해서 시험결과의 해석이 곤란한 경우 용량설정에 도움이 된다. 원칙적으로, 발암성시험의 용량은 임상에서 사용하는 사람에서의 최대노출량을 초과하도록 설정하는 것이 바람직하나 ‘종특이성’이 고려되어야 한다. 발암성시험 각 단계 및 적절한 용량군에서 시험물질과 대사체의 전신노출을 측정하는 독성동태시험 결과는 동물모델과 사람간의 노출을 비교하는 관점에서 고찰되어야 한다.

2. 본시험에서의 적용 : 별도로 실시한 시험 또는 용량설정시험에서 결정된 시험물질의 독성동태양상과 발암성 본시험에서의 노출이 일치하는지를 모니터링을 통하여 재확인하는 것이 바람직하다. 이러한 모니터링은 시험기간중에 여러번 행하는 것이 적당하나 6개월을 초과하여 지속할 필요는 없다.