[별표 8]

이질균 시험법

Shigella sonnei의 試驗法(1)

		檢體25g(굴)을 스토마커 백에 평량
		Novobiocin을 첨가한 Shigella broth*1 225ml을 첨가한 후 때때로 손으로 비벼 교반한다.
		10分間 室溫放置(때때로 손으로 비벼 교반)
		10分間侯, 嫌氣條件下(가스發生 kit)에 둔다
		44℃ 20時間 嫌氣培養							PCR시험
		培養液을교반後,일(1)金耳를아래의 選擇分離平板培地 (MAC를 기본으로 각각의 배지에서 1종류씩 선택)에 접종
MAC1) (약한選擇力) 5個釣菌			CRT2)・DHL3)・XLD4) (中間的選擇力) 5個釣菌					에네츠5)・HEA6)・SS7) (강한選擇力 培地) 5個釣菌
			35～37℃ 18～24時間 培養
			普通寒天斜面에 劃線塗抹
			35～37℃ 18～24時間 培養
			確認試驗(生化學試驗/동정 kit)
			毒素遺傳子確認試驗(PCR)
			血淸型試驗

Shigella sonnei의 試驗法(2)

				檢體25g(굴)을 스토마커 백에 평량
				Buffered Peptone Water 225ml을 첨가한 후 때때로 손으로 비벼 교반시켜 가면서 10분간 실온 방치
				35～37℃ 18～24時間 培養
		培養液1ml을 Novobiocin을 첨가한 Shigella broth*1 10ml에 접종
				44℃ 20時間 嫌氣培養(가스發生 kit等)								PCR試驗
				培養液를교반後,일(1)白金耳를 下記의選擇分離平板培地 (MAC를 기본으로 각각의 배지에서 1종류씩을 선택)에 접종
MAC1) (약한選擇力) 5個釣菌					CRT2)・DHL3)・XLD4) (中間的選擇力) 5個釣菌						에네츠5)・HEA6)・SS7) (강한選擇力 培地) 5個釣菌
					35～37℃ 18～24時間 培養
					普通寒天斜面에 劃線塗抹
					35～37℃ 18～24時間 培養
					確認試驗(生化學試驗/동정 kit)
					毒素遺傳子確認試驗(PCR)
					血淸型試驗

이질균(Shigella sonnei)의 검사법 해설(참고)

1. 검체의 채취

1) 식품의 경우에는 200g이상을 채취한다. 또 표면오염이 우려되는 식품은 표면부 300～500㎠을 두께 0.2～0.3mm을 잘라 채취한다.

2) 물의 경우에는 채수병의 입구를 알콜솜 등으로 살균후 3L이상을 채수한다. 수조에서 직접 채수하는 경우에는 국자 등을 사용하고 염소 소독한 물은 치오염산나트륨으로 중화한다.

2. 시료의 조제

1) 식품

채취한 검체의 전체를 세절한 후 이것을 혼합하여 25g을 채취한 후  스토마커 bag (피펫이 막히는 검체에는 필터기능이 있는 것을 사용)에 평량하여 시료로 사용

2) 물

채취한 검체의 3L를 Membrane filter(Pore size 0.45㎛)로 여과한다. 필터가 도중에서 막히는 경우에는 새로운 filter를 추가사용한다. 검수 성분이 다르고 부유물 등으로 1매의 필터로 여과가 어려울 경우에는 물 시료(3L)을 적당히 나누어 여과한다.

3) 양성대조의 제작방법과 사용방법

이질균(shigella sonnei) 균주(보통한천사면보존주)의 일(1)백금이를 TSB(3ml)에 접종, 35～37℃에서 18시간 배양한다. 이 배양액 1ml을 0.1%Peptone첨가 멸균생리식염수(9ml)에 단계 희석하여 10-5배 희석용액을 만든다. 이 10-5희석액 1ml을 40ml의 0.1%peptone첨가 멸균생리식염수에 희석한 균액을 시료로 한다. 본 시료 200㎕을 검체 25g에 접종하여 양성대조균으로 한다. 양성대조에 사용되는 균주는 PFGE(DNA pattern)이 확인된 것을 사용한다.

3. 증균배양

1) 식품

스토마커 bag중의 시료에 증균배지  225ml을 첨가한 후 때때로 손으로 비벼가면서 10분간 실온에 방치한다. (스토마커처리는 하지 않는다.) 실온방치 후 증균배지가 BPW의 경우는 35～37℃에서 44℃에서 18-24시간 호기 배양한다. 증균배지가 Shigella broth인 경우 18-24시간 혐기배양을 한다. 단 식중독 검체의 검사에 있어서는 검사 검체수를 늘린다든지, 1차 및 2차 증균을 추가하고 Shigella broth를 이용한 3차증균이나 자기비즈법등을 첨가하여 분리 평판배지의 종류를 늘리는 것 등이 필요할 것으로 생각된다.

2) 물

여과한 필터를 필요에 따라서 세절하고, 중 시험관등의 적당한 멸균 용기에 넣어 증균배지가 BPW인 경우에는 배지 15ml을 첨가하고 35-37℃에서 18-24시간 호기배양한다. 증균배지가 Shigella broth의 경우 배지 15ml을 첨가하여 44℃에서 18-24시간 혐기 배양한다.

4. 증균용 배지

1) BPW(Buffered Peptone Water) (OXOID, MERCK, 榮硏. 기타)

Peptone	10.0g
NaCl	5.0g
Na2HPO4	4.0g
KH2PO4	1.5g
증류수	1000ml
pH	7.2±0.1

★ : 121℃, 15min 멸균 후 40℃정도로 냉각하여 사용한다. *인산완충제의 경우는, 배지 Maker에 따라 다르지만, 어느 Maker의 것을 선택해도 큰 차이는 없다.

2) Shigella broth (자가조제 OXOID)

Tryptone	2.0g
K2HPO4	2.0g
K2H2PO4	2.0g
NaCl	5.0g
Glucose	1.0g
Tween 80	1.5ml
Novobiocin	0.5ml
증류수	1000ml
pH	7.0±0.2

★ : Novobiocin 이외의 모든 조성(31.5g/L)을 플라스크에 넣어 1L의 정제수를 넣어 용해하고 121℃, 15분간 autoclave한다. Novobiocin 50mg을 1L의 정제수에 용해하고, 0.2㎛ Membrane filter에 여과멸균한다. 조제한 Novobiocin용액을 멸균한 배지 225ml에 2.5ml의 비율로 첨가한다.(ISO에서는 Novobiocin 25.0mg을 1L의 정제수에서 용해하고 5ml를 첨가하는 것으로 되어 있다. Tween 80의 비중이 1.08이기 때문에 1.5g/L로 첨가하여도 된다.

혐기배양

・혐기쟈(OXOID, MERCK, BBL, 미쯔비씨 화학, 기타)

・혐기성균용 가스 발생 키트 (OXOID, BBL, 미쯔미씨 화학, 기타)

★ 혐기쟈를 사용한 혐기배양의 수순

①혐기성균용가스발생 키트를 혐기쟈에 setting한다. 촉매가 필요한 경우에는 이것도 동시에 setting한다.

②배양하는 검체를 혐기자에 넣는다.

③혐기성지시약을 혐기자에 setting한다.

④혐기성균용가스발생키트를 활성화하여 혐기자에 setting한다

⑤쟈를 밀봉하고 인디케이터의 색으로 혐기가 된 것을 확인한 후 44℃에서 20시간 배양한다.

5. 분리배양

식중독 검사 등에 있어서는 표적균(赤痢菌: Shigella sonnei)을 분리하는 데는 많은 단리 집락이 출현할 필요가 있으므로 사용하는 분리배지의 종류나 평판수를 늘린다든지 또는 증균배양액을 희석하는 등의 조작을 하여야 한다. 조균(釣菌)하는 집락은 의심이 가는 집락을 가능한 한 많이 조균하지 않으면 의심되는 균을 얻는 것이 어려우므로 분리용배지로서는 아래의 것을 이용하여야 하나 배지조성은 메이커에 따라서 약간 다를 수 있으므로 각각의 연구실 또는 검사실에서 일상적으로 사용하는 데 익숙한 배지를 사용하도록 노력한다. 처음으로 사용하는 곳에서는 표준균을 이용하여 분리배지에 접종한 후 집락의 크기나 색조, 형상등을 확인해 두어야 한다.

1) MAC : MacConkey agar No.3 (OXOID, Difco, 榮硏, 日水, 기타) 조성

Peptone	20.0g
Lactose	10.0g
Bile Salt No.3	1.5g
NaCl	5.0g
Neutral Red	0.03g
Crystal Violet	0.01g
Agar	15.0g
정제수	1000ml
pH	7.1±0.2

★ : 모든 조성(51.5g/L)을 플라스크에 넣고 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 121℃․15분간 autoclave한 후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균샤알레에 분주한다.

2) CRT : CHROMagarO157 TAM (CHROMagar : 관동화학) 조성

Peptone과 NaCl	31.5g
Agar	12.0g
특수염색소혼합물	1.0g
정제수	1000ml
pH	7.2

★ : 모든 조성(44.5g/L)을 플라스크에 넣고 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균샤알레에 분주한다. autoclave를 사용하여 멸균하여서는 안된다.

3) DHL agar(日水, 榮硏, OXOID, MERCK, 기타) 조성

Meat Extract	3.0g
Peptone	20.0g
Lactose	15.0g
Saccharose	10.0g
Sodium Deoxycholate	1.0g
Sodium Thiosulfate	2.3g
Sodium Citrate	1.0g
Ferric Ammonium Citrate	1.0g
Neutral Red	0.03g
Agar	15.0g
증류수	1000ml
pH 7.0±0.2

★ : 모든 조성(63.3g/L)을 플라스크에 넣어 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균샤알레에 분주한다. autoclave를 사용하여 멸균하여서는 안된다.

4) XLD agar (OXOID, 榮硏, Difco. MERCK, 기타)

Yeast Extrate	3.0g
Lactose	7.5g
Saccharose	7.5g
Xylose	3.75g
L-Lysine(HCl)	5.0g
Sodium Deoxycholate	1.0g
NaCl	5.0g
Sodium Thiosulfate	6.8g
Ferric Ammonium Citrate	0.8g
Phenol Red	0.08g
Agar	12.5g
정제수	1000ml
pH	7.4±0.2

★ : 모든 조성(52.9g/L)을 플라스크에 넣어 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균샤알레에 분주한다. autoclave를 사용하여 멸균하여서는 안된다.

5) 에네츠 : Salmonella Agar acc. to Onoz(MERCK) 조성

Yeast Extract	3.0g
Meat Extract	6.0g
Meat Peptone	6.8g
Lactose	11.5g
Sacchorose	13.0g
Bile Salt Mixture	3.825g
Sodium Citrate	9.3g
Sodium Thiosulfate	4.25g
L-Phenyalanine	5.0g
Ferric Citrate	0.5g
Magnesium Sulfate	0.4g
Brilliant Green	0.00166g
Neutral Red	0.022g
Aniline Blue	0.25g
Metachrome Yellow	0.47g
K2HPO4	1.0g
Agar	15.0g
정제수	1000ml
pH	7.1±0.2

★ : 모든 조성(80.5g/L)을 플라스크에 넣어 1L 정제수를 첨가하여 가온 용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20m씩 멸균샤알레에 분주한다.

autoclave를 사용 하여 멸균하여서는 안된다. 본배지는 녹이기 어려우므로 주의할 것

6) HEA : Hektoen Enteric Agar (OXOID, Difco, 기타) 조성

Proteose Peptone	12.0g
Yeast Extract	3.0g
Lactose	12.0g
Saccharose	12.0g
Salicin	2.0g
Bile Salt No.3	9.0g
Nacl	5.0g
Sodium Thiosulfate	5.0g
Ferric Ammonium	1.5g
Acid Fuchsin	0.1g
Bromthymol Blue	0.065g
Agar	14.0g
정제수	1000ml
pH	7.5±0.2

★ : 모든 조성(76.0g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균사알레에 분주한다. autoclave를 사용하여 멸균하여서는 안된다. 본배지는 녹이기 어려우므로 주의할 것

7) SS Agar : Salmonella Shigella Agar (OXOID, 日水, 榮硏, MERCK, Difco)

Meat Extract	5.0g
Peptone	5.0g
Latose	10.0g
Bile Salt	8.5g
Sodium Citrate	8.5g
Sodium Thiosulfate	8.5g
Ferric Citrate	1.0g
Brilliant Green	0.00033g
Neutral Red	0.025g
Agar	13.5g
정제수	1000ml
pH	7.0±0.2

★ : 모든 조성(60g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

용해후 50℃정도까지 냉각하고 20ml씩 멸균샤알레에 분주한다.

autoclave를 사용하여 멸균하여서는 안된다.

6. 확인배양

분리 평판 배지상에 발육한 赤痢菌(Shigella sonnei)으로 의심되는 집락을 선택하여 보통 한천사면배지에 접종하고 35-37℃에서 18-24시간 배양한다. 이 배지를 기본 균주로 해서 그람염색, 옥시다제 및 카탈라제 실험을 실시한다. 또 보통부이온에 접종, 배양후 본배양액을 TSI 사면한천배지, LIM배지, 포도당첨가보통부이온(타람관넣은 것), 오르니틴배지, 시몬스구연산염사면한천배지 및 acetate 사면배지의 각각에 접종 하여 35-37℃에서 18-24시간 배양한다. 배양 후 TSI사면한천배지에서 고층부 황변, 사면부 적변(황변의 경우도 있음), H2S 음성, 당에서의 가스발생 음성(TSI에서 당으로부터 가스발생유무를 판별할 수 있으나 당의 종류를 특정하기가 곤란), 포도당에서의 가스발생 음성, LIM배지에서 운동성 없음, Indole 음성, H2S 음성, 리신디카르복실라제 음성, 오르니틴디카르복실라아제 양성, 구연산염배지 음성 및 acetate 배지 음성의 균주를 이질균 음성으로 확정하고 혈청학적 시험을 실시한다.

※ 赤痢菌(Shigella sonnei)의 중요한 생화학성상

Gram stain (-)

Cytochrome oxidase (-)

Catalase (+)

Motility(-)

Indole(-)

Lycine decarboxylase(-)

포도당에서의 가스발생 (-)

Lactose 분해성(-)양성의 경우 있음 (-)

Saccharose 분해성(-)양성의 경우 있음(-)

H2S발생 (-)

Ornitine decarboxylase (+)

Citrate (-)

Acetate 배지 (-)

Indole시험 (Kovac's 방법)

배양을 종료한 LIM배지에 운동성 및 라이신디카르복실라아제의 양성 음성을 관찰, 기록한 후 LIM배지에 클로로포름 약 1ml을 중층한다.(침투하여서는 안 된다) 다음 으로 Kovac's 시약 약 1ml을 적하한다. 양성의 경우 클로로포름의 층이 적색이 된다. 대장균은 양성이지만 이질균은 음성으로 변화하지 않는다. Kovac's 시약은 p-dimethylbenzaldehyde 5g을 아밀알콜 또는 이소아밀알콜 75ml에 녹이고 그 위에 농염산 25ml을 가하여 만든다. 냉장고에서 보존하면 장기간 사용할 수 있다.

Cytochorme oxydase의 확인법

한천평판배지상에서 이질균이라고 생각되어지는 집락을 선택하고, 그 균체를 정제수에 소량 혼탁시켜 시험용 여과지 위에 살짝 부착시킨다 cytochrome 양성균은 1분이내에 피검균의 부착부분에 짙은 푸른색을 나타낸다. 음성균은 변화하지 않는다. 색깔의 변화가 명확하지 않은 경우에는 유리봉을 이용하여 다시한번 실시한다.

・옥시타제 감별용 스틱(OXOID : 關東化學 No.714064・1) 100本 定價6,800엔

・옥시타제 테스트(BBL : No.261181) 50個 定價 7,500엔

Catalase 시험법

한천평판배지상의 이질균이라고 생각되는 집락을 선택하여 그 균체를 슬라이드글라스나 유리글라스에 부착시킨다. 부착시킨 부분에 3%과산화수소수를 캐필러리튜브 또는 주사기로 적하한다.  카탈라제양성균은 기포가 발생한다.

A) LIM배지 (日水, 榮硏, MERCK, 기타) 조성

Peptone	12.8g
Yeast Extract	3.0g
Glucose	1.0g
L-Lysine(HCl)	10.0g
L-Typtophan	0.5g
Bromcresol Purple	0.02g
Agar	2.7g
pH	6.8±0.1

★ : 모든 조성(30g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

작은 시험관에 분주하고, 121℃․15분간 autoclave한 후, 급냉하여 고층배지가 되도록 한다.

B) TSI 배지 (OXOID, 日水, 榮硏, MERCK, 기타) 조성

Meat Extract	5.0g
NaCl	5.0g
Peptone	15.0g
Lactose	10.0g
Saccharose	10.0g
Glucose	1.0g
Ferric(Ⅱ) Citrate	0.2g
Sodium Thiosulfate	0.2g
Phenol red	0.02g
Agar	15.0g
pH	7.4±0.1

★ : 모든 조성(61.4g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

작은 시험관에 분주하고, 121℃․15분간 autoclave한 후, 사면배지가 되도록 한다.

C) Ornithine 배지(메라)  (榮硏, 기타) 조성

Peptone	5.0g
Meat Extract	5.0g
Pyridoxal Phosphate	5.0mg
Glucose	0.5g
L-Lysine(HCl)	10.0g
Bromcresol Purple	0.02g
Cresol Red	0.01g
pH	6.0±0.1

★ : 모든 조성(60g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

작은 시험관에 분주하고, 121℃․15분간 autoclave 한다.

D) Simmons Citrate 배지 (榮硏, OXOID, MERCK, 日水, 기타)

Dipotassium Phosphate	1.0g
Ammonium Dihydragen Sulfate	1.0g
Sodium Citrate	2.0g
Magnesium Sulfate	0.2g
NaCl	5.0g
Bromthymol Blue	0.024g
Agar	15.0g
pH	6.7±0.1

★ : 모든 조성(24.2g/L)을 플라스크에 넣고, 1L 정제수를 가하여 가온용해한다.

작은 시험관에 분주하고, 121℃․15분간 autoclave한 후, 사면배지가 되도록 한다.

E) Acetate agar (자가조정)  조성

Sodium Acetate	2.0g
NaCl	5.0g
Magnesium Sulfate(7수염)	0.2g
Ammonium Phosphate	1.0g
KH2PO4	1.0g
Bromthymol Blue	0.08g
Agar	20.0g
증류수	1000ml
pH	6.7±0.1

★ : 황산마그네슘을 제거한 전체 조성을 플라스크에 넣고, 1L정제수를 가하여 가온용해한다. 용해후 황산마그네슘을 가하여 pH6.7로 조정한다. 만들어진 Acetate agar를 8ml씩 중 시험관에 분주․솜마개(실리콘 마개, 몰튼 마개, 기타)하여 121℃․15분간 autoclave한 후, 사면부가 5cm가 되도록 사면한천으로 만든다.

Acetate agar 양성균(E. coli) 및 음성균(S. sonnei)를 본배지사면에 접종하고, 35～37℃․24～72시간배양한다. 배양후 양성균은 사면부 또는 배지면 전체가 짙은 청색(남색)으로 된다. 음성균에서는 변화없다.

★ : 35～37℃․24～72배양후, 변화를 보이지 않는 경우에도, 즉 음성이라도 7일간 배양할 것을 추천한다.

7. 혈청학적 실험

이질균은 1949년의 Ewing의 제안을 기초로 하는 국제장내세균형별 소위원회 권고(1984년)에 따라 생화학적 성상과 균체항원(○항원)를 사용한 혈청학적 성상에 의해 분리한 Dysenteriae 이질균 (Shigella dysenteriae, A아군), Flexineri 이질균(Shigella flexineri, B아군), Boydii 이질균(Shigella boydii, C아군) 및 Sonnei 이질균(Shigella sonnei, D아군)의 4종류로 나누어져 있다. 또 항원형에 따라 S.dysenteriae는 다시 12혈청, S.flexneri는 형항원과 군항원 6혈청형․13아형, S.boydii는 18혈청형으로 나누어져 있고 S.sonnei의 경우 혈청형은 1종으로 S-R변이에 따라 Ⅰ相(Smooth)형과 Ⅱ相(Rough)형이 있다.

※ 실험방법

생화학적인 실험에 의해 赤痢菌으로 동정된 균주를 보통부이욘배지에 접종하여 35～ 37℃, 18～24h 배양한 후 보통한천평판배지에 획선접종, 호기배양하여 순수분리되었는지 확인한 후 여기서 5～6개의 집락을 따내어 0.5ml 생리식염수에 부유시켜 항원액으로 사용한다.

①슬라이드응집법

유리연필로 슬라이드글라스 또는 투명글라스를 구분하여 매 구획마다 각 다가혈청 및 생리식염수(30㎕)를 적하한다. 여기에 항원액을 1백금이(또는 마이크로피펫으로 5-10㎕)를 두어 잘 혼합한다. 슬라이드 글라스 또는 투명 글라스 전후, 사면으로 움직여 가며 응집반응을 확인한다.

②인자혈청

다가혈청에서 양성으로 판정되는 경우에는 그 다가혈청을 구성하는 인자혈청을 사용하여 같은 방법으로 실험을 실시한다.

③결과의 판정

응집의 관찰은 빛을 투과시켜 관찰한다. 우선 응집항원이 생리식염수와의 반응으로 응집하지 않는 것을 확인하고 각 혈청과의 반응에서 1분간이내에 강한 응집이 나타나는 것을 양성으로 한다.

★ 赤痢菌중에 생균으로 형별불능한 주가 있다. 이질균으로 동정된 균이 다가혈청에서 음성인 경우는 위의 실험과 같이 5～6개의 집락을 선택한 후 3ml의 생리식염수에 부유시킨 후 121℃․15min 또는 100℃․60min간 가열처리 후 3000rpm으로 10min간 원심분리 후 상등액을 버리고 침전물에 0.5ml의 생리식염수를 첨가하여 균일하게 부유시켜 항원액으로 사용한다. 복수의 다가혈청에 양성을 나타낸다든지, 복수의 혈청형에 양성을 나타내는 경우에는 순수배양되었는지를 확인한 후 생화학성상을 재확인 하여 가열항원을 조절하여 재실험 할 것. 또 다가혈청만으로는 이질균을 추정하지 말 것.

8. 이질균 및 장관 침입성 대장균인자 유전자의 PCR에 의한 검출

ipaH 유전자는 genome 또는 플라스미드의 어딘가에 존재하는 것으로 알려져 있고 대부분의 이질균주는 이 유전자가 양성이나 아직 그 기능은 알려져 있지 않다.

InvE 유전자는 플라스미드 상에 있는 침투성 유전자이므로 탈락하는 경우가 있다.

ipaH 유전자 양성주 중, 약 50%가 invE 유전자 양성주로 알려져 있다.

또한 이러한 유전자를 검출한다 하더라도 이질균과 대장균의 구별이 어려우므로 다른 생화학적인 성상으로 판정할 필요가 있다.

PCR를 위한 검체 DNA액 조정

①Broth 검체의 PCR

배양액 1ml을 1.5ml tube에  채취하여 5,000rpm, 2분간 원심분리후 상등액을 버리고(감염성이 있는 경우도 있으므로 분리한 액은 멸균하고 pipet 등으로 가능한 한 배양액만을 건져낼 것), 멸균증류수 100㎕를 첨가하여 교반후 95℃ 5분간 가열후 13,000rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 분리사용한다.

②Colony 검체의 PCR

1.5ml tube에 100㎕의 멸균수를 넣고 콜로니를 백금선으로 채취 혼탁시켜 ①의 가열로부터 같은 방법으로 처리한다.

PCR하는 방법

TaKaRa의 Ex Taq과 TaKaRa 특수세균검출용 Primer set (이질균 및 장관침입성 대장균 invE 및 ipaH 유전자검출용)을 사용.

①PCR 시약

TaKaRa Ex Taq (RR001)

②Primer set

TaKaRa invE 유전자검출용 Primer set INV-1/2(S016)

TaKaRa ipaH 유전자검출용 Primer set IPA-1/2(S017)

③반응액 조성

×10 Ex Taq 첨부 buffer          : 2㎕

첨부 dNTP Mixture(2.5mM each)  : 2㎕

Primer INV-1                    : 0.2㎕

Primer INV-2                    : 0.2㎕

Primer IPA-1                    : 0.2㎕

Primer IPA-2                    : 0.2㎕

Ex Taq                          : 0.1㎕

멸균증류수                       : 14.5㎕

Template DNA(검체 DNA액*)     : 1㎕

* 상기, 검체 DNA액 조정 ①, ②로 조정한 검체 DNA액을 사용

④PCR조건

열변성             : 94℃ 30sec

Annealing         : 55℃ 30sec

Elongation         : 72℃ 30sec

35cycle 후 72℃ 7min간 Elongation 후에 4℃로 온도를 낮추어 종료.

⑤결과판정

2% agarose(EtBr 0.5㎍/ml)에 의한 전기영동결과 목적의 유전자 INV-1/2 Primer set에 의해 293bp, IPA-1/2 primer set에 의해 242bp의 DNA band가 출현한 것을 양성으로 판정한다. ipaH는 이질균 및 장관침입성대장균의 존재를, 병원인자에서는 invE의 존재가 필요하므로 판정재료로서 생각할 수 있다.