[별표6]

유해성․위험성시험방법규정

순     서

제 1 장 건강영향평가시험

제 1항 급성경구독성시험(OECD 가이드라인 420)	58

제 2항 급성경피독성시험	68

제 3항 급성흡입독성시험	75

제 4항 급성피부자극성 및 부식성시험	82

제 5항 급성 안자극성 및 부식성시험	86

제 6항 피부감작성시험	90

제 7항 신경독성시험	94

가. 급성 지발성 신경독성시험	94

나. 아급성 지발성 신경독성시험	97

제 8항 아급성독성시험	100

제 9항 만성독성시험	110

제 10항 유전독성시험	116

가. 세균을 이용하는 복귀돌연변이시험	116

나. 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상시험	118

다. 설치류를 이용하는 소핵시험	120

제 11항 생식능 및 차세대 영향시험	126

제 12항 최기형성시험	131

제 13항 발암성시험	135

제 2 장 물리․화학적 특성평가시험

제 1항 UV-VIS 흡수 스펙트럼 시험	139

제 2항 녹는점/녹는 범위 시험	145

제 3항 끓는점 시험	155

제 4항 증기압 시험	163

제 5항 물에 대한 용해도 시험	181

제 6항 회분식 평형법에 의한 흡착, 탈착 측정 시험	190

제 7항 플라스크 진동법을 이용한 분배계수(n-옥탄올/물) 시험	245

제 8항 물에서의 복합체 형성능력 시험	251

제 9항 고체, 액체 밀도 시험	259

제 10항 입자크기분포/섬유길이 및 직경분포 시험	265

제 11항 pH 함수로 나타낸 가수분해 시험	276

제 12항 물에서의 해리상수 시험	302

제 13항 공기 중 안정성과 열안정성에 관한 스크리닝 시험	310

제 14항 액체 점성 시험	319

제 15항 수용액에서의 표면장력 시험	325

제 16항 고체, 액체의 지방용해도 시험	335

제 17항 HPLC 분배계수(n-옥탄올/물) 시험	342

제 18항 겔투과크로마토그래피법에 의한 고분자의 평균 분자량 및 분자량 분포 측정 시험	354

제 19항 겔투과크로마토그래피법에 의한 고분자의 저분자량 폴리머 함량 측정 시험	366

제 20항 수중 폴리머의 용해/추출 거동의 산정 시험	378

제 21항 HPLC법에 의한 토양 및 하수오니의 흡착계수 산정 시험	384

제 22항 완속교반법 분배계수(1-옥탄올/물)의 측정 시험	399

제 1 장 건강영향평가시험

제 1항  급성경구독성시험(OECD 가이드라인 420)

Ⅰ. 개요

1. 목적

시험자의 급성경구독성에 대한 이해를 돕고, OECD 가이드라인 401 급성경구독성 항목을 주지하여 더욱 효율적인 독성시험을 수행하고자 하는데 목적이 있다.

이 시험은 경구로 단기간 노출될 때 나타날 가능성이 있는 건강장해에 대한 정보와 화학물질의 분류와 표시의 기초자료를 제공하며 아급성 또는 타 연구에서의 용량결정을 위한 예비시험단계로서 화학물질의 독성발현 형태에 대한 최초의 정보를 제공하는데 그 목적이 있다.  주로 설치류에 대하여 규정하였으나 비설치류에도 적용된다.

2. 정의

2.1  급성경구독성

시험물질을 1회 또는 24시간내에 수회 경구투여시 짧은 시간내에 나타나는 악영향

2.2  용량

동물에 투여된 시험물질의 양. 용량은 중량(g, ㎎) 또는 시험동물의 단위체중당의 시험물질 중량(예를 들면, ㎎/㎏)으로 나타낸다.

2.3  LD50: (median lethal dose)

경구로 1회 투여시 시험동물의 50%를 치사시킬 수 있는 시험물질의 용량

2.4  용량-반응

규정된 영향을 보이는 시험개체의 비율과 용량과의 관계

2.5  단위

용량은 시험동물의 체중당 시험물질의 중량 (예, mg/kg)으로 표시         한다.

3. 고정용량법

3.1 일반사항

가이드라인 401과 같은 전통적인 급성경구독성을 평가하는 방법은 최종판단점으로써 동물의 사망을 사용하고 있으나 1984년 영국독성학회(BTS)에 의해 고정용량수법에 기초한 급성경구독성의 평가에 대한 새로운 제안이 제시되었다. 이 방법은 최종판단점으로 동물의 사망을 선택하지 않는 대신, 일련의 고정용량의 1용량으로 나타나는 명확한 독성발견을 관찰하는 것이다. 이 BTS에 의한 이론적인 방법에 대하여 영국에서 확인시험이 수행되었고, 계속해서 EC 공동체 및 영국정부기관을 스폰서로 하여 국제적인 확인시험이 OECD의 협조 하에서 행하여 졌다. 양자의 시험에 있어서 이 방법이 과학적으로 유효하다고 나타났다.

이 가이드라인에 서술하는 고정용량법은 유해성의 평가방법과 물질의 등급에 따라서 두 종류의 정보를 제공한다. 이 가이드라인 중에는 소수의 동물을 사용한 예비실험을 포함해 독성과 사망률의 용량반응을 평가하고 본 시험의 용량선택의 정보를 제공한다. 예비시험과 본 시험의 결과에 있어서 현재 사용되고 있는 각종의 분류체계에 화학물질을 등급을 매기는 것이 가능하다.

3.2 고려해야 할 사항

고정용량법에는 본 시험에서 중간의 독성용량만 사용하여 사망이 예측되는 용량을 투여하는 것을 원칙적으로 피하고 있다. 부식성 반응이나 강한 자극성 반응 때문에 현저히 고통을 일으키는 것이 알려져 있는 용량에서는 투여할 필요가 없다. 시험 중에 명백한 통증, 또는 심한 고통을 나타내는 동물에 대해서는 인도적으로 처리하여야 한다.

3.3 시험의 원리

예비시험은 성별이 동일한 실험동물에 여러 용량군의 시험물질을 투여했을 때 나타나는 반응을 단계적으로 비교한다. 예비시험은 최소치사량의 평가를 포함해 용량-독성상관관계에 대한 정보를 제공한다. 본 시험에서는 고정용량(5, 50, 500 및 2,000㎎/㎏)의 한 가지 용량 당 암수 각 5마리씩 투여한다. 투여량은 예비실험으로부터 결정한다. 사망이 예상되는 경우에는 즉시 한 단계 아래의 용량에서 실시한다. 만일 선택된 용량단계에서 명백한 독성이 나타나지 않으면 그 물질은 한 단계 더 높은 농도에서 재시험한다. 만일 최초용량에서 동물이 사망하든지 강한 독성반응을 나타내어 동물복지의 차원에서 처분할 필요가 있으면 그 물질은 한 단계 더 낮은 용량에서 재시험한다. 예비실험과 본 시험 양쪽의 자료를 고려하면 아래 제시된 표 1의 설명에 부합되는지와 재시험의 필요여부가 판단될 것이다.

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  동물종의 선택

주로 랫드를 많이 사용하며 통상 사용되는 시험용의 계통을 사용한다. 시험에 사용되는 동물의 체중차이는 평균체중의 ±20%를 초과해서는 아니 된다. 암컷은 임신한 경험이 없는 것을 사용한다.

1.2 사육 및 식이조건

동물사육실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70%가 적당하다. 동물은 성별로 나누고, 집단사육을 할 경우 케이지 당 마리 수는 동물 개체마다 관찰이 용이하도록 조정한다. 시험물질의 생리학적 특성 또는 독성작용(예 : 이환율과 흥분성)에 따라서 개별 케이지에서 사육해야 하는 경우도 있다. 조명의 조절은 12시간 점등, 12시간 소등으로 한다. 식이에 대해서는 보통 일반적으로 사용되는 실험용 사료를 공급하고 물은 자유롭게 제공한다.

1.3 동물의 준비

건강한 동물을 무작위적으로 선택하여 시험개시 전 적어도 5일간 시험환경에 순화시킨다.

1.4 투여액의 준비

필요에 따라서 시험물질을 적절한 매체에 용해 또는 현탁한다. 가능한 한 수용액을 사용하는 것이 바람직하지만 유지(예 : corn oil) 또는 다른 매체를 사용하여도 무방하다. 비수용성매체를 사용할 경우 독성이 이미 알려져 있는 매체를 사용해야 하며, 만일 알려져 있지 않으면 시험 전에 결정하여야 한다.

1.5 투여액의 투여

1) 위장튜브 또는 적당한 관을 사용하여 동물에 시험물질을 강제적으로 1회 투여한다. 1회에 투여 가능한 액량은 동물의 체중에 따라 결정한다. 설치류에 대해서는 수용액의 경우, 체중 100g 당 2㎖, 용량은 1㎖/100g을 초과해서는 아니 된다. 어떤 용량 단계에서도 농도를 일정하게 조정하여야 하며, 투여용량의 변동을 최소한으로 막는다. 만일 1회 투여가 불가능하면 24시간 이내에 소량씩 투여한다.

2) 동물은 투여 전 1일간 절식시킨다. 절식 후, 동물의 체중을 측정하여 시험물질을 투여한다. 시험물질 투여 후 사료는 3～4시간 동안 공급하지 않아도 된다. 시험물질을 일정 기간 동안에 소량씩 투여할 시에는 투여 기간에 따라서 사료 또는 물을 공급해야 할 경우도 있다.

2. 예비 시험

2.1 각 용량에 대한 작용을 1마리씩 조사한다. 구조활성관계로부터 얻어진 정보를 바탕으로 수컷의 감수성이 높은 것으로 알려지지 않았다면 통상 암컷을 사용한다. 투여는 연속적으로 이루어지지만 다음 동물의 투여까지 적어도 24시간의 간격을 둔다. 모든 동물에 대하여 적어도 7일간은 독성증상을 주의 깊게 관찰한다. 만일 7일째에 중간 정도의 독성이 남을 경우 동물을 다시 7일간 관찰한다. 최초의 용량은 5, 50, 500 및 2,000㎎/㎏으로 한다. 만일 최초에 선택된 용량에서 강한 독성을 나타내지 않고 다음 용량에서 사망이 일어나면 적절한 중간농도를 조사하여 선택하는 것이 필요하다. 이 방법으로 몇 가지의 증상을 나타내는 용량과 사망을 유발하는 최소용량에 대한 정보를 얻을 수 있다.

2.2 유사화학물질로부터 얻은 정보들을 기초로 하여 최초의 용량을 선택한다. 이러한 정보가 없을 경우라면 첫 번째로 500㎎/㎏의 용량을 선택한다. 만일 독성증상이 최초의 용량에서 발견되지 않으면 그 다음으로 높은 용량에서 실시한다. 만일 2,000㎎/㎏에서도 사망하는 동물이 없으면 예비실험을 종료하고 본 시험을 이 용량에서 수행한다. 만일 인도적으로 처분할 필요가 있을 정도로 강한 독성 작용이 최초의 용량에서 발견되는 경우에는 그 다음으로 낮은 용량을 별도의 동물에 투여하고, 이 동물이 생존할 경우에는 다음의 동물에 고정용량의 사이의 적절한 중간농도를 투여한다. 통상 이러한 수순으로 실험을 수행하면 5마리 이상의 동물을 사용하지 않게 된다.

3. 본 시험

3.1 동물수와 용량투여

1) 적어도 10마리의 동물(암수 각각 5마리)을 독성을 검토해야 할 용량 별로 각각 사용한다. 본 시험에 사용하는 용량은 5, 50, 500, 2,000㎎/㎏의 4가지 용량 중에서 1용량을 선택하여 예비실험을 실시하여 그 결과, 실험동물이 사망하지 않고 명백한 독성반응을 나타내는 것으로 판단되는 용량으로 실시한다. 만일 예비실험의 결과, 5㎎/㎏에서 사망한 경우 이 화학물질에 대해서는 그 보다 더 낮은 용량에서 실험할 수 있다.

2) 대부분의 경우 예비실험으로부터 얻어진 자료는 본 시험에서 사용할 적절한 용량(즉, 실험동물에서 명백한 독성반응을 나타내지만 사망하지 않는 용량)을 판단하는데 사용되는 것으로 충분하다. 그러나 최초의 용량에서 명백한 독성반응이 보이지 않을 경우 이 화학물질을 그 다음으로 높은 용량에서 재시험을 하여야 한다. 만일 최초 선택한 용량에서 실험동물이 사망하거나 인도적인 처분이 필요할 정도의 강한 독성반응을 나타내면 그 다음으로 낮은 용량에서 재시험한다.

3.2 관찰

시험에서 제외할 필요가 있는 동물 및 동물복지의 차원에서 인도적으로 처분한 동물을 제외하고 투여 후 적어도 14일간 관찰한다. 그러나 관찰기간은 엄격히 고정된 것이 아니다. 이것은 독성반응, 증상출현의 빠르기 및 회복기간에 의해 결정되며, 필요에 따라서는 더 연장되기도 한다. 독성증상이 발견되거나 사라지는 시간이 언제인가 하는 사실은 중요하며, 특히 독성증상이 늦게 나타날 경우에는 더욱 중요해 진다. 모든 관찰기록은 각 동물별로 기록하며, 체계적으로 기록한다.

3.3 임상관찰

임상관찰은 적어도 투여 당일에 2회, 그 이후에는 매일 1회 실시한다. 동물에 명백한 통증 또는 강한 고통의 증상이 보이는 경우에는 인도적으로 처분한다. 최초로 선택된 용량이 그다지 높지 않은 것으로 확인되더라도 시험을 종료하는 시기는 투여 후 수일간 추가적으로 관찰을 해본 후에 결정해야 할 필요가 있다. 케이지 면으로부터 관찰하는 것은 피부와 털, 눈과 점막의 변화, 호흡계, 순환계, 자율신경계 및 중추신경계 전신운동성 및 운동형태 등이다. 동물이 인도적인 이유에서 처분되거나 사망한 경우 사망시간은 될 수 있는 한 정확히 기록한다. 동물의 개체별 중량은 시험물질 투여직전과 직후 1회, 사망 시 측정하고 체중의 변화를 계산, 기록한다. 시험 종료 시 생존한 동물은 체중측정 후 처분한다.

3.4 병리

모든 동물(시험 중 사망한 동물 또는 동물복지의 차원에서 시험으로부터 제외된 동물을 포함)을 해부하여 육안적 병리변화를 기록한다. 24시간 이상 생존한 동물에 대해서는 육안적 병리소견이 있는 기관에 대한 현미경 관찰도 유익한 정보를 제공할 수 있다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

예비실험과 본 시험의 모든 자료는 각 용량 군당 사용동물 수, 독성증상을 나타내는 동물 수, 시험 중 사망한 동물 수, 인도적으로 처분한 동물 수, 독성작용의 기록 그리고 본 시험의 경우 명백한 독성의 관찰여부, 독성작용의 시간경과 및 해부소견을 표 형식으로 요약한다.

2. 시험 보고서

시험보고서는 예비실험 및 본 시험에 관해서 다음의 항목을 포함한다.

2.1 시험물질

물리적 성질, 필요 시 물리화학적 특성, 동정 자료

2.2 매체

매체 선택이유

2.3 시험조건

2.4 결과

성별 및 용량별 반응 자료집(즉, 사용한 동물 수, 사망, 일반증상, 작용의 강도와 지속시간을 포함한 독성증상의 가역성 여부, 해부소견 및 모든 조직병리학적 소견, 해당 용량에서 명백한 독성을 일으킨다고 판단되는 근거, 최소치사량 추정치와 사망을 일으키지 않는 최고용량을 포함한 결과의 논의 해석)

2.5  시험기관의 명칭 및 소재지

2.6  시험책임자 및 담당자 성명

2.7  사용된 동물의 종/계통/공급원 ; 사료 ; 환경조건

2.8  시험동물의 성별

2.9  용량군별의 반응성적표 (시험기간 중에 사망 또는 도살된 동물수,          독성의 징후를 나타낸 동물수, 노출된 동물수)

2.10  투여시간 및 투여후의 사망시간, 임상증상의 매일 관찰기록

2.11  14일후의 성별 LD50 (산출방법을 기록), 시험기간중 3회 이상의 체     중측정기록

2.12  LD50의 95％ 신뢰한계

2.13  용량-사망곡선과 구배 (계산방법에 따라 가능한 경우)

2.14  병리소견

육안적 해부소견이 관찰된 장기조직에 대하여 필요시 병리조직검사

2.15  다른 성별로 실시된 시험이 있으면 그 결과

표 1. 결과의 설명

용량	결 과	설 명
5㎎/㎏	100% 이하의 생존율	마셨을 경우 강한 독성(약 25㎎/㎏ 이하의 LD50치)의 가능성이 있는 화학물질
	100%의 생존율 명백한 독성 있음	마셨을 경우 독성(약 25~200㎎/㎏의 값)의 가능성이 있는 화학물질
	100%의 생존율 명백한 독성 없음	50㎎/㎏에서 시험하지 않았을 경우에는 50㎎/㎏에 시험
50㎎/㎏	100% 이하의 생존율	마셨을 경우 독성 또는 강한 독성의 가능성이 있는 화학물질. 5㎎/㎏에서 시험되지 않는 경우 5㎎/㎏에서 시험
	100%의 생존율 명백한 독성 있음	마셨을 경우 유독성(약 200~2,000㎎/㎏의 LD50값)의 가능성이 있는 화학물질
	100%의 생존율 명백한 독성 없음	500㎎/㎏에서 시험되지 않는 경우 500㎎/㎏에서 시험
500㎎/㎏	100% 이하의 생존율	마셨을 경우 독성 또는 유해성의 가능성이 있는 화학물질. 50㎎/㎏에서 시험되지 않을 경우 50㎎/㎏에서 시험
	100%의 생존율 명백한 독성 있음	약 2,000㎎/㎏이상의 LD50값이 있으나 요주의 화학물질
	100%의 생존율 명백한 독성 없음	2,000㎎/㎏에서 시험하지 않은 경우 2,000㎎/㎏에서 시험
2,000㎎/㎏	100% 이하의 생존율	마셨을 경우 상당한 주의를 요하는 화학물질. 500㎎/㎏에서 시험되지 않는 경우 500㎎/㎏에서 시험
	명백한 독성유무와는 관계없이 100%의 생존율	마셨을 경우 중요한 급성독성의 위험이 없는 화학물질

* 5㎎/㎏ 용량에서 사망한 개체가 상당히 많은 경우, 또는 예비시험 시 이 용량에서 사망하는 실험동물들의 있을 것으로 예상되는 경우, 보다 더 저용량의 시험물질로 시험한다. 선택용량은 명백히 독성을 일으키지만 실험동물의 사망은 없는 용량

주) 상기 설명은 다양한 시험방법의 변화를 적용하여 얻은 자료를 기초로 하여 작성된 것으로서, 25㎎/㎏ 이하, 25～200㎎/㎏, 200～2,000㎎/㎏, 2,000㎎/㎏ 이상의 범위의 LD50값에도 대응된다. 그러나 이 결과는 위 표의 설명이 적절한지 아닌지 (LD50값의 자연적인 오차와 용량 반응곡선의 경향의 오차에 유의), 또는 몇 가지의 조정이 있는지 아닌지를 판단한 다음 예비시험과 본 시험의 자료들 모두를 놓고 판단하여 이 표에 제시된 것 외의 범위를 이용할 수 있다.

제 2항  급성경피독성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 경피로 단기간의 노출에 의해 일어날 가능성이 있는 건강장해에 관한 정보를 제공하며 아급성 및 기타 독성시험의 용량을 결정하고 또한 경피흡수 및 경피경로에 의한 독성작용기전에 대한 정보를 제공하는데 그 목적이 있다.

2. 정의

2.1  급성경피독성

시험물질을 피부에 1회 도말 하였을 때 짧은 시간내에 나타나는 악영향

2.2  용량

동물에 적용된 시험물질의 양

2.3  LD50 (median lethal dose)

1회 투여시 시험동물의 50%를 치사시킬 수 있는 시험물질의 용량

2.4  용량-반응

규정된 영향을 보이는 시험개체의 비율과 용량과의 관계

2.5  단위

용량은 시험동물의 체중당 시험물질의 중량 (예, mg / kg)으로 표시한다.

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  예비사항

건강한 젊은 동물을 처리군에 무작위로 할당한 후 시험물질 적용전에 순화하기 위하여 적어도 5일간 시험용 케이지에서 사육한다.  시험시작 약 24시간 전에 시험동물의 구간배부의 피모를 면도기로 제거한다.  피부에 상처를 내면 투과성에 영향을 주므로 상처가 나지 않도록 주의한다.  적어도 체표면적의 10％를 시험물질의 적용을 위하여 잘 제모하여야 한다. 제모할 범위 및 적용할 범위를 결정할 때 동물의 체중을 고려하여야 한다.

만일 적당한 분말상태인 고체를 시험하고자 할 경우에는 시험물질을 피부와 잘 접촉시키기 위하여 물 또는 적당한 용매를 사용하여 충분히 습윤시켜야 한다.  용매를 사용할 경우 시험물질의 피부 투과성에 대한 용매의 영향에 대하여 고려해야 한다.  액상의 시험물질은 일반적으로 희석하지 않고 사용한다.

1.2  시험동물

1.2.1  동물종의 선택

성숙한 랫드, 토끼 또는 기니픽을 사용하고 다른 동물을 사용할 경우는 정당한 이유가 필요하다.  다음의 체중범위는 시험를 용이하게 할 수 있는 동물의 크기를 제공하는데 도움을 준다.

랫드  200～300g,   토끼  2.0～3.0kg,   기니픽  350～450g

1.2.2  동물수 및 성별

각 용량단계에서 상처가 없는 건강한 피부를 가진 암․수 동수의 동물이 필요하다. 각 용량단계에는 적어도 10마리의 동물 (암컷 5, 수컷 5)을 사용하여야 한다.  암컷은 출산의 경험이 없거나 임신하지 않은 동물을 사용한다.  토끼의 경우 가끔 동물수를 적게 사용할 수가 있으나  만족할 만한 LD50의 측정에 방해요인으로 작용할 수 있다.

1.2.3  사육 및 급이조건

동물은 개별적으로 사육해야 한다.  시험동물실의 온도는 설치류 22±3℃, 토끼 20±3℃을 유지하고, 상대습도는 30～70％로 하여야 한다.  조명은 인위적으로 조정할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다.

이는 일반실험용 사료와 함께 음료수를 자유로이 섭취시킨다.

1.3  시험조건

1.3.1  용량단계

용량단계는 충분히 설정하는데 적어도 3단계범위는 되어야 하며, 시험군에 어느 일정 범위의 독성효과와 사망율이 나타나도록 적절한 간격을 두어야 한다.  이들의 성적은 용량-반응곡선을 작성하는데 충분하지 않으면 안되며, 될 수 있는 한 적절한 LD50의 계산이 산출될 수 있는 것이어야 한다.

1.3.2  한도시험

이 시험방법을 이용하여 2,000mg/kg이상의 용량시험에서 시험물질로 인한 사망을 나타내지 않으면 3용량을 사용한 본시험은 필요하지 않다.  그러나 시험물질과 관련된 사망이 관찰되었을 때는 본 시험을 수행해야 한다.

1.3.3  관찰기간

관찰기간은 적어도 14일간이지만, 그 이상 관찰을 할 것인지는 엄격하게 규정지을 성질이 못된다. 그것은 독성 반응이나 증상이 출현했을 경우, 또는 회복기간의 길이 등에 의해서 결정될 일이다. 따라서 필요에 따라 연장되어야 한다.

특히 사망이 늦게 발생하는 경향이 보여질 때는 독성징후의 출현과 소실의 시간, 그들의 지속과 사망시간이 중요하다.

2. 시험방법

2.1  원리

시험물질을 여러 단계의 용량으로 군을 나누어 1군 1용량을 시험동물의 피부에 적용한 후 독작용 및 사망에 대하여 관찰한다.  시험기간중 사망한 동물은 부검하고 시험의 종료시 생존한 동물도 도살하여 부검처리한다.  동물이 심하게 지속적인 고통의 징후를 나타내는 경우는 안락사를 시킬 필요가 있다. 시험물질이 부식성과 자극성을 나타내어 동물에 현저한 고통을 일으키는 경우에는 시험할 필요가 없다.

2.2  시험물질 투여

시험물질은 전체표면적의 약 10％ 범위에 해당하는 투여면적에 균일하게 적용한다. 독성이 강한 물질은 도포면적을 보다 적게 하는 경우도 있으나 도포부위 전체를 가능하면 얇고 균일한 필름상태로 넓게 피복해야 한다. 시험물질은 24시간의 노출기간중 다공성의 거어즈, 비자극성 테이프를 사용하여 피부와 접촉을 유지시켜야만 한다.

시험적용 부위는 시험물질과 거어즈 붕대를 유지시키기 위하여 적당한 방법으로 다시 덮어주어 동물이 시험물질을 섭취하지 못하도록 해주어야 한다. 시험물질의 섭식을 방지하기 위해 보조장비를 사용할 수 있으나 완전히 부동구속하는 것은 권장할 만한 방법은 못된다.  노출기간의 종료시에는 남아있는 시험물질은 물이나 적당한 용매를 사용하여 제거한다.

2.3  임상검사

관찰사항은 정확히 계통적으로 기록한다.  각 동물에 대해 개개의 기록을 남겨둔다.  시험물질을 투여한 후 첫날은 일정시간 간격으로 3회 이상 관찰하고, 그후에는 적어도 매일 1회 주의깊게 관찰해야 한다. 시험에서 동물의 손실을 최소화하기 위하여 매일 적절하고 면밀한 관찰을 해야 한다. 예를 들면 사망된 동물이 확인되면 해부 및 냉장보존하고 쇠약 또는 빈사상태의 동물은  격리 또는 도살처분한다.

동물의 증상은 체모, 눈 및 점막, 호흡기계, 순환기계, 자율신경 및 중추신경계, 전신운동능력 및 행동패턴을 포함하여 관찰한다.  진전, 경련, 유연, 설사, 졸림, 수면 및 혼수에 대한 관찰은 특별한 주의를 해야한다.  사망한 시간은 가능한한 정확히 기록해야 한다.

시험동물의 체중은 시험물질의 투여직전, 투여 후에는 매주 및 사망시에 측정한다.  1일 이상 생존하고 있는 동물의 체중의 변화는 계산하여  기록해야 한다. 실험종료시에 생존동물은 체중측정을 행한 후 도살한다.

2.4  병리검사

모든 동물은 부검을 실시해야 하며 모든 육안적 병리 변화를 기록해야한다.  24시간 또는 그 이상 생존한 동물에 있어서는 육안적 병리소견을 나타내는 기관의 현미경 검사를 고려할 필요가 있는데 그것은 현미경 검사가 유용한 정보를 제공할 수 있기 때문이다.

2.5  암․수에 대한 독성평가

한쪽 성의 시험종료후 적어도 다른 쪽 성의 1군 5마리에 투여하여 다른 쪽 성의 동물이 시험물질에 대하여 특별하게 현저히 높은 감수성을 갖고 있지 않음을 확인한다.

이때에 보다 적은 동물수의 사용은 개개의 정황으로 용인될 수 있다.  어느 쪽의 성이 시험물질에 보다 높은 감수성을 갖는지 충분한 정보가 얻어지는 경우에는 다른 쪽의 시험을 생략해도 좋다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

성적은 표로써 요약한다.  기재내용은 각 시험군마다 시험시작시의 동물수, 각 용량군의 개개 동물의 사망시간, 독성의 징후를 보이는 동물수, 독성의 영향 및 부검소견이다.  시험물질에 의한 고통과 괴로움 때문에 동물을 안락사시킨 경우에는 시험물질에 의한 사망으로 기록한다.

LD50의 결정은 일반적인 방법, 예를 들면 Bliss (1), Litchfield and         Wilcoxon (2), Miller and Tainter (3), Weil (4) 등의 방법에 따라 구한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  사용된 동물종/계통/공급원의 환경조건

2.4  시험동물의 성별

2.5  용량군별의 반응성적표 (즉, 시험기간중에 사망 또는 도살된 동물           수, 독성의징후를 나타낸 동물수, 노출된 동물수)

2.6  투여시간 및 투여후의 사망시간

2.7  지정된 측정방법으로 14일째 산출한 동물성별에 대한 LD50

2.8  LD50의 95％ 신뢰한계 (산출될 수 있는 경우)

2.9  용량-사망율 곡선과 구배 (측정방법에 의해 가능한 경우)

2.10  병리소견

육안적 해부소견이 관찰된 장기조직에 대하여 필요시 병리조직 검사

2.11  다른 성에 대해 실시된 시험이 있으면 그 결과

제 3항  급성흡입독성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 흡입경로로 흡입가능한 물질(가스체, 휘발성 물질 또는 입자상물질)의 단기간 노출에 의해서 나타날 수 있는 건강장해를 평가하는데 그 목적이 있다.  이 시험 방법으로 얻은 성적은 시험 물질의 분류와 표시를 위한  기초자료로 이용되고 아급성과 기타 독성을 행하는 경우 용량을 설정하는데 이용될 수 있다.

2. 정의

2.1  급성흡입독성

흡입가능한 물질을 단기간(24시간이내)에 1회 흡입노출시켰을 때시험  물질에 의해 나타나는 악영향

2.2  LC50 (median lethal concentration)

시험물질에 노출후 일정시간 또는 노출중에 시험동물의 반수를 사망시킬수 있는 물질의 농도

2.3  단위

LC50은 공기의 표준부피당 시험물질의 무게(mg/ml) 또는 ppm으로 표시한다.

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  예비사항

건강하게 성숙한 동물을 시험전에 적어도 5일간 시험환경에 순화시킨후 시험시작전에 동물을 무작위로 나눈다. 공기중에 적당한 시험물질 농도를 조정하기 위하여 필요한 경우 적당한 용매를 가해도 좋다.

1.2  장 치

19％의 산소농도와 균일하게 분포되는 노출환경을 확보하며 시간당 12～15회의 환기가 유지되도록 고안된 적절한 흡입장치에서 시험한다.

쳄버내를 약간 음압으로 유지시켜 시험물질이 누출되지 않도록 한다. 쳄버를 사용하는 경우는 시험동물의 밀집을 최소한으로 하되, 시험물질의 노출이 최대한으로 되도록 고려하여야 한다.  쳄버내 환경의 안정성을 확실하게 하는 일반적인 방법으로 사용동물의 총용적을 쳄버용적의 5％ 이내로 하는 것이 좋다. 다른 방법으로서 입․피부노출, 두부노출, 전신개별쳄버노출법 등을 사용할 수가 있다.

적절한 농도분석 관리장치를 부착시킨 흡입장치를 사용해야 한다. 장치내 전체의 조건이 본질적으로 동일하게 유지되도록 공기의 유량을 조정해야 한다.

1.3  시험동물

1.3.1  동물종의 선택

여러 종류의 포유동물을 사용할 수 있으며 바람직한 종은 랫드이나 일반적으로 실험실에서 사용되는 계통을 사용하도록 한다. 시험에 사용하는 동물 개체간 또는 군간의 체중변동은 평균체중의 ±20％를 초과하지 않아야 한다.

1.3.2  동물수 및 성별

각 농도군에 적어도 10마리 (암컷 5마리, 수컷 5마리)를 사용한다.   암컷은 출산의 경험이 없거나 임신하지 않은 동물을 사용해야 한다.

1.3.3  사육 및 급이조건

시험동물실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70％를 반드시 유지시킨다. 인공조명으로 할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다.  사료는 일반적으로 널리 쓰는 것을 사용하며, 음료수는 자유로이 섭취시킨다.

동물은 성별 군으로 사육해야 하며, 케이지당 동물수는 개개의 동물을 충분하게 관찰할 수 있는 범위로 한다.

1.4  시험조건

1.4.1  노출농도

농도단계는 충분히 두도록 해야 하며 적어도 3단계, 또는 시험군에서 독작용이 나타나는 범위에서 농도-사망곡선이 그려지고 LC50의 산출이 가능하도록 설정한다.

시험물질이 폭발할 가능성이 있는 경우에는 폭발농도가 되지 않도록 주의한다.  적절한 노출농도를 설정하기 위하여 예비시험을 권장한다.

1.4.2  한계시험

호흡가능한 물질을 실제 농도가 5mg/L에서 4시간 노출시키는데 이것이 시험물질의 물리적․화학적 성상 때문에 불가능한 경우에는 얻어낼 수 있는 최고농도로 기술한 방법에 따라 시험하여 시험물질로 인한 사망이 발생하지 않을 경우에는 그 이상의 3용량 단계를 사용한 본시험을 할 필요가 없다.

1.4.3  노출시간

노출시간은 챔버내의 농도가 평행을 이룬 후 된 후부터 적어도 4시간으로 한다.  특별한 경우 시간을 변경할 수 있다.

1.4.4  관찰기간

관찰기간은 적어도 14일간으로 하나 엄격히 규정된 것은 아니다. 이는 독성 반응과 증상출현율의 비율, 그리고 회복기간의 연장등이 보일때 결정하되 필요에 따라 연장해도 좋다. 독성의 징후가 나타난 시간과 사망시간은 중요하며 특히 사망발현이 지연되어 일어나는 경향이 있는 경우에 중요하다.

2. 시험방법

2.1  원리

몇개의 군으로 나눈 시험동물에 1군 1농도로 시험 물질을 일정기간 노출하는데, 이때 노출환경중에서 적절하게 농도를 유지하기 위하여 용매를 사용하는 경우에는 용매 노출군을 설정해야 한다.  그 후에 여러가지 시험물질에 의한 영향이라든가 사망에 대한 관찰을 하며, 시험중에 사망한 동물은 부검하고 시험종료시까지 생존한 동물은 도살하여 부검한다.

2.2  시험물질투여

노출직전에 시험동물의 체중을 측정하고, 지정한 장치에서 시험농도로 4시간 노출한다. 시험온도는 22±2℃로 유지해야 한다. 이상적인 상대습도는 30～70％로 하지만 특별한 경우(예:aerosol의 시험)에는 이 조건은 실행할 수 없다. 노출중에는 먹이를 주지 않고 경우에 따라 물도 주지 않는다.

2.3  이화학적 측정항목

다음의 사항에 관하여 측정 또는 모니터링을 행한다.

2.3.1  공기의 유량 (연속적이 바람직함)

2.3.2  시험물질의 실제농도는 동물의 호흡구역내에서 측정하며, 노출중의 농도변동은 가능한 일정하게 해야 한다.  분진이나 에어로졸의 경우에는 이 조건범위의 변동을 유지하는 것이 불가능한 경우도 있으므로 보다 넓은 범위가 인정된다.

2.3.3  발생장치 (Generating System)의 작동에 있어서는 에어로졸 농도의 안정성을 확인하기 위하여 입자크기의 분석을 실시해야 한다.

노출중 입도분포의 항상성을 측정하고자 필요에 따라 반복 분석한다.

2.3.4  온도와 습도 (연속적인 측정이 바람직함)

2.4  임상검사

노출중 및 노출후의 관찰을 행하여 계통적으로 기록한다.  각각의 동물에 관하여 개별기록을 측정하여야 한다. 적어도 매일 1회 이상 주의깊게 임상적 관찰을 행하여야 한다.

시험동물의 손실을 최소화하기 위하여 매일 주의하여 관찰한다. 사망동물을 발견한 즉시 부검 또는 냉장보존하며, 쇠약 또는 빈사상태의  동물은 격리 또는 도살 등 적절히 처치한다.

관찰은 특별히 제한하지 않으나 아래 항목을 포함해야 한다. 피부, 눈, 점막, 호흡계, 순환계, 자율신경 및 중추신경계, 전신운동과 행동 패턴의 변화, 진전, 경련, 유연, 설사, 졸림, 수면 및 혼수의 관찰에는 특히 주의해야 한다. 사망시간은 가능한 한 정확히 기록해야 한다. 동물의 개별체중은 노출후 매주 1회와 사망시에 측정하고 1일 이상 생존한 경우에는 체중변화를 계산하고 기록해야 한다. 시험종료시 생존한 동물은 체중을 측정한 후 도살처분한다.

2.5  병리검사

동물의 부검은 특히 기도에 어떠한 변화를 일으켰는지 특별한 주의를 해야 한다. 다른 장기가 관여하고 있을 가능성을 보여주는 독성징후가 있는 경우에는 이들의 장기도 조사하는 한편 모든 육안적 병리변화는 기록하여야 한다. 표적 기관의 현미경적 검사는 유익한 정보를 제공하기 때문에 잘 고려해야 한다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

성적은 각군마다 시험개시시의 동물수, 개별동물의 사망시간, 독성징후를 나타낸 동물수, 독성변화 및 부검소견을 표로 정리한다.

LC50의 결정은 일반적으로 Bliss (1), Litchfield and Wilcoxon (2), Miller and Tainter (3), Weil (4) 등의 방법에 따라 구한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함해야 한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험조건

디자인, 형태, 크기, 공기원, 에어로졸 및 입자발생계, 환경공기조정의 방법, 배기의 처리, 그리고 이것을 사용할 때의 쳄버내 동물의 수용방법을  포함한 노출장치의 기록, 온도, 습도, 에어로졸 입자의 농도와 크기를 측정하는 장치에 관하여 기록하여야 한다.

2.4  노출성적

평균치와 변동치(표준편차)를 명기하고 성적에는 다음 항목을 포함하여 기록한다.

(1) 흡입장치의 공기 유량률 (Air flow rates)

(2) 공기의 온도와 습도

(3) 이론농도 (흡입장치내에 투여된 시험물질의 총량을 공기량으로              나눈값)

(4) 호흡구역에서의 실측농도

(5) 입자크기의 중앙치 (입경분포)

2.5  동물에 관한 성적

(1) 사용된 동물종 및 계통

(2) 성별 및 노출농도 군마다의 성적표 (즉, 사망동물수, 독성징후를            나타낸 동물의 수, 노출동물수)

(3) 노출기간중 또는 노출후의 사망시간

(4) 관찰종료시의 각 성별 LC50 (사용한 계산방법)

(5) LC50의 95％ 신뢰한계

(6) 용량-사망곡선과 구배 (계산방법에 따른 가능한 경우)

(7) 관찰되었던 장해와 이상을 포함하는 부검 및 병리조직소견

제 4항 급성 피부자극성 및 부식성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 화학물질을 실험동물의 피부에 도포한 후 발생하는 피부의 자극정도를 검색하는 것을 목적으로 한다. 동물의 피부에 심각한 부식성이 있는 물질, 피부를 통하여 노출시 강한 독성을 야기할 수 있는 물질 및 2,000㎎/㎏ 용량에서 피부자극을 야기하지 않는 물질에 대해서는 본 시험을 적용해서는 안된다.

2. 정의

2.1  피부자극 : 시험물질의 노출에 의한 피부의 가역적인 염증성 변화

2.2  피부부식 : 시험물질의 노출에 의한 피부의 비가역적인 손상

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1 시험동물

1.1.1  동물종의 선택

여러 종류의 포유동물을 사용할 수 있으나 바람직한 종은 뉴질랜드 화이트 래빗 또는 알비노 래빗이다.

1.1.2  동물수 및 성별

각 농도군에 3마리(암컷 및/또는 숫컷)를 사용하는 것이 원칙이나 한마리만 가지고 시험할 수도 있다.

1.1.3  사육 및 급이조건

시험동물실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70%를 반드시 유지시킨다. 인공조명으로 할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다.  사료는 일반적으로 널리 쓰는 것을 사용하며, 음료수는 자유로이 섭취시킨다.  동물은 성별 군으로 사육해야 하며, 케이지당 동물수는 개개의 동물을 충분하게 관찰할 수 있는 범위로 한다.

1.2  시험물질

투여량은 액체의 경우 약 0.5ml, 그리고 고체 또는 반고체의 경우 약 0.5g으로 한다.

2. 시험방법

2.1  원리

실험동물은 실험개시 24시간 전 주로 등뒤의 피부를 선택하여 피부가 손상받지 않도록 약 2.5 × 2.5 cm의 면적을 지닌 찰과부위와 비찰과부위를 만들어 시험물질을 적용한 다음 피부병변을 관찰한다.

2.2  시험물질투여

시험물질을 시험동물의 피부에 4 시간동안 노출시킨다. 도포후 시험물질의 증발 예방 대책을 세운다.

2.3  임상결과 및 피부반응 평가

도포 종료후 각각 1시간, 24시간, 48시간, 72시간후 피부에 나타나는 반응을 다음의 임상증상 및 피부반응 평가표에 따라 관찰한다.

임상증상 및 피부반응 평가표

홍반과 가피 형성		부종형성
반응	등급	반응	등급
홍반이 전혀 없음	0	부종이 전혀 없음	0
아주가벼운 홍반 (육안으로 거의 식별할 정도)	1	아주가벼운 부종 (육안으로거의 식별할 정도)	1
뚜렷한 홍반	2	경증의 부종(뚜렷하게 부어 올라서 변연부가 구별될 정도)	2
약간 심한 홍반	3	중증의 부종(약 1mm정도 부어 올랐을 경우)	3
심한 홍반(홍당무색)과 가피형성	4	심한 부종( 1mm 이상부어오르고 노출부위 밖까지 확장된 경우)	4
총 가능한 등급의 합; 4		총 가능한 등급의 합; 4

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

도포완료후 1시간, 24시간, 48시간, 그리고 72시간후에 관찰되는 홍반과 부종에 관한 등급을 임상증상 및 피부반응 평가표에 따라 표로 요약하여 나타낸다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 표시한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험물질: 물리화학적성상등

2.4  사용용매

2.5  실험동물: 실험동물의 종, 계통, 성, 수, 사육조건, 체중 등

2.6  실험조건: 도포방법, 도포후의 처치상황 등

2.7  결과: 관찰된 자극 정도와 성질에 대한 상세한 기술

피부자극 이외에 각종 임상증상, 조직병리학적 소견

제 5항 급성 안자극성 및 부식성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 화학물질이 안구나 점막에 노출되었을 때 나타나는 악영향을 평가하는 데 그 목적이 있다.  동물의 안구에 심각한 자극성이나 부식성이 있는 물질, 피부자극 시험결과 심한 피부자극이나 부식독성이 있는 물질은 본  시험을 적용해서는 안된다.

2. 정의

2.1  안자극(Eye irritation)

시험물질이 눈에 노출되었을 경우 일어나는 안구의 가역적 변화

2.2  안부식(Eye corrosion)

시험물질이 눈에 노출되었을 경우 일어나는 안구의 비가역적 조직장해로의 변화

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  실험동물

실험개시 24시간 전에 미리 안과학적 검사를 실시하여 안구손상이나 각막손상 등이 없는 건강한 개체를 사용한다.

1.1.1  종의 선택 : 주로 토끼 사용(2.0～3.0㎏)

1.1.2  동물의 수 : 우선 1마리를 대상으로 실시하고 이상이 없는 경우 3 마리를 대상으로 실시한다.

1.1.3  실험동물의 사육관리 : 온도 20～22℃(±3℃), 습도 30～70%, 조명 12/12시간(밝음/어둠)주기

2. 시험방법

2.1  원리

시험물질을 건강한 동물의 한쪽 안구에 1회 투여한 후 발생하는 독성을 관찰한다.

2.2  용량의 결정

2.2.1  액체인 경우 0.1㎖, 고체, 반고체, 입자상태인 경우 100㎎이 넘지 않도록 한다.

2.2.2  분무상태의 물질인 경우는 눈에서 약 10㎝ 거리에서 안구의 손상이 야기되지 않도록 주의하면서 1초간 분무한다.

2.3  관찰기간 : 보통 21일 이내로한다.

2.4  실험의 절차

2.4.1  시험물질의 적용 : 시험물질을 한쪽 눈에 점안하고 나머지 한쪽과 비교한다.

2.4.2  국소마취제의 사용

2.4.3  시험물질의 세척

(1) 정상적인 경우 24시간 세척하지 않는다.

(2) 눈을 자극시키는 물질은 점안 20～30초후 양쪽 눈을 무균생리식염수로 세척한다.

2.4.4  관찰기간 : 점안 완료후 1, 24, 48, 72시간

2.4.5  임상증상 및 안구반응 평가 : 임상증상과 다음에 명시된 표를 바탕으로 종합적 결론을 내린다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

결과는 표로 요약하며 각종 임상증상을 기록한다. 안구병변등급과 임상증상을 고려 종합적으로 평가한다 (별표).

2. 시험결과의 보고

결과보고서에는 다음의 사항을 기재한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  실험동물의 종 및 계통

2.4  시험물질의 물리화학적 성상

2.5  결과 요약표 및 채점법의 간결한 기술

2.6  안구병변의 임상적 설명

각막
A. 혼탁 : 안구의 농후한 정도(가장 농후한 지점을 관찰함)
ㅇ화농이나 혼탁이 없음	0
ㅇ혼탁이나 분산 혹은 밀집되어 있음, 홍채의 말단이 명확히 관찰됨	1
ㅇ반투명한 부분이 쉽게 관찰됨, 홍채의 말단이 약간 불명확함	2
ㅇ진주색깔을 나타냄, 홍채의 말단이 관찰 안됨	3
ㅇ각막이 불투명, 혼탁 때문에 홍채가 관찰 안됨	4
B. 혼탁된 각막의 범위
ㅇ1/4 이하(그러나 0은 아니다)	1
ㅇ1/4 이상 1/2 미만	2
ㅇ1/4 이상 3/4미만	3
ㅇ1/4 이상 1 까지	4
A×B×5 최대치 50
홍채
A. 반응치
ㅇ정상	0
ㅇ현저한 주름의 형성, 충혈, 종창, 각막 주위에 중등도의 충혈 이상과 같은 단독 혹은 혼합, 홍채는 빛에 대해 반응함(둔한 반응은 양성)	1
ㅇ빛에 반응 없음, 출혈, 대부분 파괴(이상과 같은 증상의 일부 혹은 전부)	2
A×5 최대치 = 10
결막
A. 발적(안검결막, 안구결막에 한함, 각막, 홍채 제외)
ㅇ혈관은 정상	0
ㅇ몇몇 혈관은 명확히 충혈	1
ㅇ넓은 범위가 진홍색 색조(diffuse, crimson color), 혈관은 쉽게 관찰 안됨	2
ㅇ넓은 범위의 쇠고기색조의 붉은색(diffuse beefy red color)	3
B. 결막 부종
ㅇ부풀지 않음	0
ㅇ정상보다 약간 종창(순막 포함)	1
ㅇ안검의 부분적 외전을 동반한 현저한 종창	2
ㅇ눈이 반쯤 감길 정도의 안검의 종창	3
ㅇ눈이 반이상 잠길 정도의 안검의 종창	4
C. 배출물
ㅇ배출물 없음	0
ㅇ약간의 배출물(정상동물의 내부 눈꼬리에서 관찰되는 작은 양 제외)	1
ㅇ속눈썹과 눈꺼풀을 적시는 배출물	2
ㅇ눈 주위의 상당 부위와 속눈썹과 눈꺼풀을 적시는 배출물	3
점수(A+B+C)×2

제 6항  피부감작성시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험의 목적은 시험물질이 충분한 알레르기 발현능을 가진 물질인지를 확인하기 위하여 선정된 방법에 따라 피부자극성을 조사하는데 있다(별표).

2. 정의

2.1  피부감작성

어떤 물질에 대해 면역학적으로 매개되어 나타나는 피부 반응

2.2  유도노출

과민상태를 유발하기 위해 시험물질을 시험개체에 실험적으로 노출시키는 것

2.3  유도기간

과민상태를 유발하는 유도노출 후 최소한 1주일 간의 기간

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1 시험동물

1.1.1  동물종 및 성

기니픽을 사용하도록한다.  그러나 정당한 이유가 있을 경우에는 다른 동물을 이용해도 상관없다. 암컷을 사용할 때는 임신하고 있지 않거나 출산 경험이 없는 것이어야 한다.

1.1.2  연령

건강하고 젊은 성숙동물을 사용한다.

1.1.3  동물수

시험법에 따라 각군당 적게는 6～8 마리에서 많게는 20～25 마리를 사용하는 시험이 있다(별표).

2. 시험방법

2.1  원리

시험물질을 피내주사하여 시험동물에 노출시킨다. 다음 10일에서 14일사이에 면역반응이 일어나며 시험용량을 적용한 다음 대조군과 피부반응 정도를 비교한다.

2.2  투여방법

감작노출시와 유발노출시의 투여방법이 시험방법에 따라 피내, 경피 등으로 다르다.

2.3  용량

시험법에 따라 다르나, 감작노출에 의해서 생체에 피부반응을 일으키나, 유발노출에 의해 피부에 1차자극이 나타나지 않는 농도를 각각 이용하도록 한다.

2.4  투여기간

시험법에 따라 각기 다르다(별표).

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

감작노출후 1시간 및 24시간 경과된 후, 또한 유발노출 24시간 및 48시간이 경과된 후에 각각의 동물피부에 나타나는 반응결과를 정리한다.  발적이나 부종은 그 정도를 측정하고 이상한 변화는 모두 기록한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함해야 한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  이용한 시험법

2.4  동물종/계통

2.5  사용동물수와 성별

2.6  실험개시시의 개별체중

2.7  시험종료시의 개별체중

2.8  채점법의 간결한 기술

2.9  개개 동물의 채점결과

별표. 시험방법의 주요특징

──────────────────────────────────────────

시험법    draize   Freunds    Mauer     buehler    open    maximisation    Split

Complete   Optimisation      epicutaneous              adjuvant

Ajuvant                         test

──────────────────────────────────────────

동물종     기니픽   기니픽    기니픽     기니픽    기니픽    기니픽      기니픽

경로     피내      피내      피내       피부      피부   피내,피부    피내,피부

동물수/군    20      8-10       10       10-20      6-8       20-25       10-20

시험군수     1       1          1           1       1-6         1           1

대조동물수   20     8-10        10       10-20      6-8       20-25       10-20

──────────────────────────────────────────

감작노출

경로    피내     피내      피내       경피      경피   피내, 경피  피내,경피

횟수     10        5         9         3        20-21   1(피내),1(경피)  4

노출기간    -        -      24시간   6시간/회     계속적     -, 48시간  48시간/회

첨 부 법   -        -         -        폐쇄법   개방법     폐쇄법      폐쇄법

시 험 군 시험물질 FCA중에  FCA중에 시험물질  시험물질  시험물질, FCA 시험물질

시험물질 시험물질                      FCA+시험물질

대조군     -      FCA         -         -        용매   FCA, FCA+ V.V.   -

처치부위 좌측복부 우측복부    배부     좌측복부  우측복부    어깨       어깨

노출빈도 매 2일   매 2일   하루걸러    매 7일      매일     0일,7일   0,2,4,7일

기간    0-18일    0-8일      0-21일      0-14일    0-20일    0-7일     0-7일

농도    첫회의   첫회와    0.1ml,     첫회와    동일군내는     -     일정농도

2-10배  동일농도    0.1%    동일농도  같고 군간에는

다름

──────────────────────────────────────────

유발노출

경 로    피내      경피       피내    경피       경피        경피        경피

횟 수     1         2           2      1           2           1          1

일 수    35       22,35       14,28     28        21,35         21         20

노출시간    -         -          24       6          -           24          24

첨 부 법    -      개방법        -     폐쇄법     개방법      폐쇄법       폐쇄법

시 험 군 시험물질 시험물질  시험물질  시험물질  시험물질     시험물질    시험물질

대 조 군    "       "            "        "         "           "            "

처치부위 우측복벽 좌측복벽  미처치복부  우측복부  좌측복부  좌측복부에    어깨

시험물질,

우측에 용매

농 도    첫회감작  4단계     0.1ml,    감작과  4 단계      2회째의    감작의 1/2                과 동일                      동일                감작과 동일

유발후의   24,48   24,48,72      24      24, 48    24,48,72     24, 48       24,48

판정시간

──────────────────────────────────────────

제 7항  신경독성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 유기인계 물질에 노출되었을 때 지속적 또는 지발성 운동실조의 신경독성작용이 나타나는지 관찰하는 것을 목적으로 한다.

2. 정의

2.1  급성지발성 신경독성

시험물질을 1회 투여하였을 때 나타나는 지속적이고 지발적으로 나타나는 보행성 운동 실조 등의 신경독성

2.2  아급성지발성 신경독성

시험물질을 수일동안 반복투여 하였을 때 나타나는 지속적이고 지발적인 운동으로 나타나는 보행성 운동실조 등의 신경독성

가. 급성 지발성 신경독성시험

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물종 및 성

산란용으로 키우는 성숙한 암탉으로 표준크기의 일반적인 계통 및 품종을 사용하고 질병 및 약물투여한 적이 없으며 시험시작 5일전에 실험실 조건에 순응시켜야 한다.

1.1.2  연령

8～14개월이 적당하다.

1.1.3  동물수

시험기간중 적어도 6마리가 생존할 수 있도록 충분한 닭을 준비        한다.

1.1.4  대조군

시험에는 적절한 대조군을 두어야하는데, 적어도 2마리 이상의 이미 알려져 있는 지발성 신경독 (tri-orthocresyl phosphate, TOCP)을 처치한 양성 대조군과 2마리 이상의 무처치 대조군을 둔다.

1.1.5  사육 및 급이조건

시험우리는 시험동물이 운동하기에 충분한 공간을 유지해야 하며      보행관찰이 용이해야 한다.  조명은 인공조명으로 하며 12시간 광주기 상태로 유지한다.

2. 시험방법

2.1 원리

시험물질을 암탉에 1회 경구로 투여하고 21일 동안 행동이상, 운동신경마비등 지발성 신경독성을 관찰한다.

2.2  시험물질

2.2.1 투여방법

시험물질의 투여는 보통 경구투여기, 젤라틴 캡슐 또는 그에 준하는 방법을 사용하여 경구적으로 투여한다.

2.2.2  용량

시험물질의 투여량은 보호제를 투여하지 않을 경우에 LD50이하로 내려가지 않는 양으로 한다. 시험물질에 의한 급성 콜린(choline) 작동성 신경작용에 의한 사망을 막기 위하여 아트로핀이나 시험을 방해하지 않는 다른 보호제를 사용해도 좋다. 시험물질의 용량이 5,000 mg/kg 이상을 넘어가는 경우는 실시하지 않아도 된다.

2.2.3  투여기간

1회 투여하고 21일간 매일 관찰하는데, 신경독성증상이 나타나지 않거나 불명확할 경우에는 동일용량을 재투여하여 다시 21일간 관찰한다.

2.3  관찰 및 측정사항

시험물질과 대조물질을 투여한 닭은 적어도 주 2회 사육 케이지에서 밖으로 꺼내 강제운동을 시켜보아야 하며, 이때 닭들의 행동이상, 운동실조, 마비 등의 항목에 대해 관찰하여, 그러한 독성의 징후와 그 발현시간, 정도 및 지속시간을 기록한다. 시험종료후 모든 동물은 부검하여 육안적 및 조직병리학적 검사를 실시한다.  체중은 주 1회 측정한다.

2.4  병리검사

시험에 사용된 닭의 장기는 모두 관류 고정하며 검사장기에는 연수, 척수 및 말초 신경이 포함되어야 한다.  척수는 상경부, 흉부 중앙 및 요  선부의 조직, 그리고 경골 신경의 근위부 및 분지부의 조직도 검사해야   한다.  염색은 myelin 및 축삭 특수 염색법을 기본적으로 실시한다.

III. 시험결과의 보고

1. 결과의 처리

시험군당 사용동물수, 반응형태, 반응을 보인 동물의 비율등을 대조군과 비교하여 신경독성 정도를 테이블 형태로 종합한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함해야 한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  각군에 대하여 신경계 장해의 임상적증상을 기재한 독성반응의 성           적

2.4 각종 동물에 대한 시험기간중의 사망시기 혹은 실험 종료시의 생존의 유무

2.5  이상소견이 나타난 시기 및 그 경과

2.6  체중변화

2.7  시험종료시의 각 동물의 부검소견

2.8  병리조직학적 소견

2.9  시험결과의 통계학적 처리

나. 아급성 지발성 신경독성시험(90일 시험)

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1. 시험동물

1.1.1  동물종 및 성

산란용으로 키우는 성숙한 암탉으로 표준적인 계통 및 품종을 사용하고 질병 및 약물투여한 적이 없으며 시험시작 5일전 실험실 조건에 순응시켜야 한다.

1.1.2 년령

8～14개월이 적당하다.

1.2.3  동물수

처리군과 대조군에 각각 10마리를 준비한다.

1.2.4  대조군 : 급성지발성 신경독성시와 동일

1.2.5  시험환경 : 급성지발성 신경독성시와 동일

2. 시험방법

2.1 원리

몇가지 용량의 시험물질을 암탉에 90일동안 경구로 투여한 후 행동 이상, 운동신경마비등 지발성 신경독성을 관찰한다. 시험기간이 완료되면 특정 부위의 신경조직의 병리검사를 실시한다.

2.2 시험물질

2.2.1  투여방법

적어도 1주에 5일간은 계속 경구투여하도록 하는데, 강제투여나 젤라틴 캡슐에 의하여 투여한다.

2.2.2  용량

대조군이외에 적어도 3단계의 용량군을 두도록 한다. 최고용량은 독성효과를 나타내지 않은 양으로 사망을 일으키지 않는 지발성 신경독성을 나타내는 양이 제일 좋다.  최저용량은 어떠한 독성증상도 나타내지 않는 양으로 한다.

2.2.3  투여기간

투여기간은 90일이다.

2.3  관찰 및 측정사항

시험물질과 대조물질을 투여한 닭에 대해 행동이상, 운동실조, 마비등의 항목에 대해 관찰하는데 그외의 미세한 반응의 관찰을 보강하기 위하여 적어도 주 1회 정도 닭을 케이지 밖으로 꺼내어 강제운동을 시켜 보아야 하며, 이때에 나타나는 독성징후와 그 발현시간, 정도 및 지속시간을 기록한다. 시험종료후 모든 동물은 부검하여 육안적 검사와 병리조직학적 검사를 실시한다.  체중은 주 1회 측정한다.

2.4  병리검사

시험에 사용된 닭의 장기는 모두 관류 고정하며 검사장기에는 연수, 척수 및 말초 신경이 포함되어야 한다. 척수는 상경부, 흉부 중앙 및 요선  부의 조직, 그리고 근위부의 경골 신경과 그 분지부 및 좌골 신경도 검사  한다.  염색은 적절한 myelin 염색이나 축삭 특수염색을 실시한다. 고용량  투여군에서 시험물질의 영향에 의한 병변이 발견되었을 때에는 저용량군 및 중간 용량군의 관찰 장기에 대해서도 현미경 검사를 해야한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

시험군당 사용동물수, 반응형태, 반응을 보인 동물의 비율 등을 대조군과 비교하여 신경독성 정도를 테이블 형태로 종합한다. 관찰된 모든 결과를 시험계획 당시에 선정된 통계기법으로 대조군과 비교한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고는 다음의 항목을 포함해야 한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명 - 투여량(mg/kg)

2.3 각군마다의 신경계장해에 관한 임상적 징후를 기재한 독성반응의   성적

2.4  시험기간중의 사망시기 및 시험종료시의 생존의 유무

2.5  각종의 이상증상이 나타난 시기와 그 후의 경과

2.6  체중변화

2.7  시험 동물의 부검 및 조직병리학적 소견

2.8  시험결과의 통계학적 처리

제 8항  아급성독성시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험방법은 포유동물에 시험물질을 1～3개월 동안 매일 반복투여했을 때 나타나는 생체의 기능 및 형태의 변화를 관찰함으로써 시험물질의 독성을 측정하는데 목적이 있다.

2. 정의

2.1  아급성독성

시험물질을 1～3개월 동안 반복투여 하였을 때 나타나는 악영향

2.2  용량

투여된 시험물질의 양

2.3  무영향농도

시험물질이 투여되었을 때 악영향을 나타내지 않는 최대농도

2.4  축적독성

시험물질을 지속적으로 투여함으로써 특정 장기에 시험물질 또는 그 대사체의 농도가 증가함으로써 나타나는 악영향

2.5  단위

용량은 시험동물의 체중당 시험물질의 중량 (예, mg/kg)으로 표        시한다.

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물의 종 및 성

원칙상 랫드의 암컷 및 수컷을 사용한다.

1.1.2  연   령

5 또는 6주령 (주 1)으로 하고, 체중이 고른 동물을 사용한다. 체중의 변동은 평균체중의 ±20％ 이내로 한다.

1.1.3  동물수

각군은 암수 각 5마리 이상으로 한다.  또 중간에 도살하여 검사를 하는 경우 거기에 필요한 수를 미리 추가한다.  또 원칙적으로 회복시험을 하는 군(회복군)을 설정할 수 있다(주 2～4).  회복군의 동물수는 1군당 암수 각 5마리 이상으로 한다.

2. 시험방법

2.1  원리

몇가지 용량의 시험물질을 1～3개월 동안 경구로 투여하고 독성징후를 매일 관찰하고 시험기간중 죽은 동물 및 끝까지 살아남은 동물을 부검하여 병리조직학적, 임상적 검사를 실시한다.

2.2  시험물질

2.2.1  투여방법

원칙적으로 경구투여하며 다만, 시험물질의 성상에 따라 경구투여 할 수 없는 경우는 비경구투여로 한다.

2.2.2  용  량

투여량은 3단계 이상을 설정한다.  고용량은 시험물질에 의한 독성영향이 명백하게 인정되는 양으로 하고, 저용량은 시험기간을 통하여 시험물질에 의한 독성영향이 발현하지 않는 양으로 한다.  또 고용량과 저용량 간에 1단계 이상의 중간용량을 두고 별도로 대조군을 둔다.

실제 시험물질 취급량은 동물의 섭이량 또는 섭수량과 시험물질의 농도로부터 산출한다.

또, 강제경구투여의 경우는 체중 kg당 1g의 용량으로 하고 사료 또는 음료수에 첨가하여 투여하는 경우는 사료 또는 음료수로부터 섭취되는 시험물질의 양이 체중 kg당 1g에 상당하는 용량 (주 5)으로 한다.  어떤 독성도 인정할 수 없는 때는 3용량을 사용하는 시험을 필요로 하지 않는다.

2.2.3  투여기간 :  1～3개월간 투여한다.

2.3  관찰 및 측정사항

매일 적어도 1회 동물의 일반상태를 세밀히 관찰한다 (주 6).  한편  서로 잡아 먹거나 조직의 자기융해, 그리고 군마다의 동물수를 항상 확인하여 시험동물의 실종이 없도록 한다.

또 다음 사항에 대하여 검사를 행한다.

2.3.1  사망율

2.3.2  체중, 섭이량 및 섭수량 (시험물질을 음료수에 첨가한 경우)                (주 7)

2.3.3  혈액검사

(1) 혈액학적 검사 (주 8)

(2) 혈청생화학적 검사 (주 9)

2.3.4  뇨검사 (주 10)

2.3.5  병리학적 검사

(1) 육안적 검사 및 기관중량 (주 11)

(2) 조직학적 검사 (필요에 따라 전자현미경을 이용한 검사, 조직학적 검사를 한다) (주 12)

2.3.6  그 밖의 필요한 사항

시험중 사망한 동물에 대해서는 가능한한 그 사인을 조사한다.  또 일반상태가 극히 불량하게 되어 죽음이 임박한 동물은 신속하게 도살․부검한다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

시험 결과는 양식 1에 따라 정리하고 최종보고서를 첨부한다.

또한, 가능한 항목에 대해서는 적당한 통계적 수법을 이용하여 처리한       다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물의 종/계통/공급원, 사료 및 환경조건

2.4  시험동물의 성별 및 용량군별의 반응성적표

2.5  시험기간중에 사망 또는 도살된 동물수, 시간, 독성의 징후

2.6  사료 및 체중에 관한 자료

2.7  혈액학적 분석자료

2.8  혈청생화학적자료

2.9 부검소견

2.10 병리학적 소견의 기록, 성적에 대한 동계적 처리

주 1 ) 5 또는 6주령의 동물을 얻을 수 없는 경우에는 이유 후 8주령을 넘지 않는 것이 좋다.

주 2 ) 시험물질의 투여를 종료한 후 회복시험을 2주간 행한다.

주 3 ) 회복군의 용량은 고용량군의 용량으로 한다.  동물의 관찰․검사는 1～3개월 동안 투여시험에서 인정된 고용량군에 있어서의 독성영향에 관하여 행한다.

주 4 ) 회복군의 관찰․검사를 생략할 수 있는 경우는 다음과 같다.

1) 투여종료시까지 중대한 독성이 인정되는 경우

2) 고용량군에 있어서 독성영향을 인정할 수 없는 경우

주 5 ) 랫드의 경우 체중 1kg당 1g의 용량에 상당하는 사료 또는 음료수 중의 농도는 투여기간 등에 따라 변하는 경우도 있으나 어떤 경우에도 5％를 기준으로 한다.

주 6 ) 일반상태로서 다음의 항목을 관찰한다.

피부․피모, 안․점막, 호흡기계, 순환기계, 자율신경계, 중추신경계,         운동 및 행동 패턴 등에 대하여 상태의 발현시간, 정도, 지속시간을         본다.  필요에 따라 기구, 기계 등을 사용한다.

주 7 ) 주 1회 이상 측정한다.

주 8 ) 혈액학적 검사로서 다음 항목을 검사한다.

적혈구수,  헤모글로빈,  헤마토크릿,  백혈구수 및 백혈구백분율, 혈소판수, 그밖에 혈액응고 등의 지표로서 혈액응고시간, prothrombin 시간, thromboplastin 시간 등이 있다.  그밖에 화학구조 등으로 보아 독성영향이 시준되는 항목, 예를 들면 망상적혈구수 등에 대해서도 검사한다.

주 9 ) 혈청생화학적 검사로서 다음 항목을 검사한다.

총단백, A/G비, 혈당, triglyceride, 총 cholesterol, 요소질소, creatinine, Na, K, Cl, Ca, P, GOT, GPT, γ-GTP, alkaline phosphatase 등  그밖에 화학구조등으로 보아 독성영향이 시작되는 항목, 예를 들면 LDH, cholinesterase, hormone, 산/염기평형, methemoglobin, ornithine carboxylase, 총 bilirubin 등에 대해서도 검사한다.

주 10 ) 요의 외관, pH, 잠혈, 단백질, 당, ketone체의 검사, 필요에 따라서 요량 측정 및 침사의 현미경을 이용한 검사릍 실시한다.

요검사는 투여기간중 1회 이상 한다.

주 11 ) 시험에 사용된 모든 동물은 체표, 개구부, 두개, 흉강, 복강과 그 내용의 관찰을 포함한 육안적 검사를 충분히 한다.  조직병리학적 검사를 위해서 다음의 기관․조직을 적당한 보존액중에 보존한다.

뇌*, 뇌하수체, 안구, 갑상선(상피소체를 포함한다), 심장, 폐, 간장*, 신장*, 비장, 부신*, 위, 정소* 또는 난소*, 방광, 골수 (대퇴골)부 및 육안 소견, 장기중량 등으로부터 표적기관이라고 인정된 기관․조직  또 * 표시를 한 모든 기관은 그 중량을 측정한다.

주 12 ) 병리조직학적 검사는 고용량군과 대조군에서 채취하여 보존한 기관․조직중에서 적어도 다음의 기관 및 장기에 대하여 검사한다.  심장, 간장, 신장, 비장, 부신 및 육안소견, 장기중량상으로부터 표적기관이라고 인정된 기관․조직 이밖에 관찰․검사의 결과 및 화학구조 등에 의하여 독성영향이 시작되는 것에 대해서도 검사한다.

고용량군에서 변화가 인정된 기관이나 조직에 대해서도 다른 용량군 및회복군에 대해서도 실시한다.  고용량군의 병리조직학적 관찰에서 어떤 변화가 관찰되어 더욱 면밀한 검사가 필요한 경우에는 기타 용량군에 대해서도 관찰하도록 한다. 회복군에 대한 관찰은 조직학적 변화가 관찰된 기관이나 조직에 대해서는 특히 주의하여 조직학적 관찰을 하여야 한다.

별표.  포유류를 이용하는 1～3개월간의 반복투여 독성시험 결과보고서

1. 일반적 사항

신규화학물질의 명칭 (IUPAC 명명법에 의함)
별 명				분자량
구조식 또는 시성식 (어느 것도 불명확한 경우에는 그 제법의 개요)			물리화학적성상	상온에서의 성상
				안정성
				융점		℃
				비점		℃
				증기압
시험에 제공된 신규화학물질의 순도	wt %
				분배계수		℃
				용해성
				용해도	물
					DMSO
불순물의 명칭 및 농도	wt %				acetone
					기타( )

[비고] 물리화학적 성상은 참고자료이므로 가능한한 기입할 것.

1. ⌈안정성⌋ 난에는 물, 그밖의 용매, 열, 광 등에 대한 안정성을 기입할        것

2. ⌈증기압⌋ 난에는 25℃에서의 시험물질의 증기압을 기입할 것

3. ⌈분배계수⌋ 난에는 분배계수, 측정온도 및 분배계수의 측정에 이용된 용매  명을 기입할 것.  37℃에서의 분배계수가 있는 경우에는 이를 기입할 것

4. ⌈용해성⌋ 난에는 수용성 또는 지용성의 여부를 기입할 것

5. ⌈용해도⌋ 난에는 각각의 용매에 대한  25℃의 용해도를 기입할 것

2. 독성시험결과 요약표

시험물질 투여기간
사용동물 종․계통											1군당의 동물수 웅 : 자 :
투 여 경 로
시험물질의 순 도 (%)	투여량	ppm mg/kg			대조군	저용량군		중용량군Ⅰ		중용량군Ⅱ	고용량군	회복군
체 중 변 화
섭 이 양
일 반 상 태
요 소 견
혈액생화학적소견
혈액형태학적소견
장 기 증 량 변 화
부 검 소 견
조 직 학 적 소 견
기 타
NOEL (mg/kg)
NOEL에 근거한 변화

*NOEL : No Oberved Effect Level

제 9항  만성독성시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험방법은 동물에 시험물질을  장기간 연속투여 했을 때 나타나는 생체의 기능 및 형태 등의 변화를 관찰함으로써 시험물질의 독성을 명확히 하는 것을 목적으로 한다.

2. 정의

2.1  만성독성

시험동물에 시험물질을 6～24개월 동안 경구로 반복투여하였을 때 나타나는 악영향

2.2  용량

투여된 시험물질의 양

2.3  무영향농도

시험물질이 투여되었을 때 악영향을 나타내지 않는 최대농도

2.4  단위

용량은 시험동물의 체중당 시험물질의 중량 (예, mg/kg)으로 표        시한다.

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물종 및 성

1～3개월 정도의 아급성 독성시험에서 이용한 것과 동종의 랫드   나 개, 원숭이 등 설치 및 비설치류를 이용한다.

1.1.2  연령

랫드와 같은 설치류에서는 5～6주령의 체중이 고른것을 이용하고,  수명이 비교적 긴 동물종에서는 랫드에서와 대응하는 연령의 것을 이용한다.

1.1.3  동물수

랫드에서는 각군에서 암수 각각 20마리 이상을 둔다. 비설치류에서는 각군에서 암수 각각 4마리 이상을 둔다.  그러나 중간 도살을 하여 검사를할 경우에는 그만한 수의 동물을 미리 더 배치한다.

2. 시험방법

2.1 원리

몇가지 용량의 시험물질을 6～24개월 동안 경구로 투여하고 독성증후를 매일 관찰하고 시험기간중 죽은 동물은 부검하고 살아남은 동물은 죽여서 부검하여 병리적, 임상적 검사를 실시한다.

2.2  시험물질

2.2.1  투여방법

원칙적으로 매일 경구투여한다.  시험물질은 사료나 음료수에 첨가하여 투여하는 것이 좋다.  사료에 첨가하는 시험물질의 농도는 5 w/w% 이하로 한다.  단, 시험물질의 성상에 따라 경구투여로 할 수 없는 경우는 비경구투여한다.  강제투여를 할 때에는 매일 일정한 시각에 투여한다.

2.2.2  용량

용량과 작용과의 관계를 알기 위하여 투여량은 3단계 이상으로 한다. 예비시험에서 너무 많은 수의 사망례가 나오지 않으면서 시험물질에 의한 어떤 독성영향이 나타나는 양을 최고용량으로 한다. 최저용량은 시험기간 동안에 동물에 어떤 영향도 나타나지 않는 양으로 한다. 그리고 별도로 대조군을 둔다. 실제로 시험물질 섭취량은 동물의 섭이량이나 섭수량과 시험물질의 농도로 산출한다.

2.2.3  투여기간

6～24개월 동안으로 한다(주 1).

2.3  관찰 및 측정사항

원칙적으로 다음의 사항에 대하여 관찰을 한다.

2.3.1  일반 상태, 사망율 (주 1)

2.3.2  체중, 섭이량 및 섭수량, 식이효율(주 2)

2.3.3  혈액검사

(1) 혈액학적 검사(주 3)

(2) 혈청생화학적 검사(주 4)

2.3.4  뇨검사(주 5)

2.3.5  병리학적 검사

(1) 육안적 관찰 및 기관 중량(주 6)

(2) 조직학적 관찰(필요에 따라 전자현미경적 혹은 조직화학적 검        사를 함)(주 7)

2.3.6  기타 필요한 사항

시험중 사망한 동물에 관해서는 그 원인을 조사한다. 또 일반 상태가 매우 좋지 않아서 사망직전에 처해 있는 동물은 빨리 도살 해부를 한다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

아급성 독성시험과 동일한 양식으로 처리한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물의 종/계통/공급원, 사료 및 환경조건

2.4  시험동물의 성별 및 용량군별의 반응성적표

2.5  시험기간중에 사망 또는 도살된 동물수, 시간, 독성의 징후

2.6  사료 및 체중에 관한 자료

2.7  혈액학적 분석자료

2.8  혈청생화학적자료

2.9  해부소견 및 조직병리학적 소견

2.10 통계처리 방법

주 1 ) 적어도 1일 1회 주의깊게 임상적 관찰을 한다. 사망동물은 즉시 부검하든지 냉장 보관한다. 또 쇠약이나 빈사상태의 동물은 격리하거나 부검처리 하도록 한다. 사망율은 물론 신경증상, 안구검사소견 등을 모든 동물에 대하여 기록하고, 독성의 발현시간이나 진행상태, 그리고 종양유무에 관해서도 기록한다.

주 2 ) 음수량에 대해서는 시험물질을 음료수에 섞어서 투여할 때에만 측정한다. 동물개개의 체중은 시험개시후 13주 까지는 주 1회, 그 이후는 적어도 4주에 1회 측정하며, 섭이량에 대해서도 시험 개시후 13주 까지는 매주 측정하고, 그 이후는 건강상태와 체중에 변화가 없는 한 3개월 마다 측정한다.

주 3 ) 국제적으로 빈번히 사용되는 방법과 측정단위를 사용하며 투여 3개월 후, 6개월 후 및 이후 6개월 간격으로 암수 각 10마리 이상에 대해 아래의 항목을 검사한다.  적혈구수, 망상적혈구수, 헤모글로빈, 헤마토크릿트, 백혈구수, 백혈구백분율, 혈소판 등

주 4 ) 국제적으로 빈번히 사용되는 방법과 측정단위를 사용하여 투여 후 6개월 간격으로 암수 각 10마리 이상에 대해 아래의 항목을 검사한다.  총단백, A/G비, 혈당, 트리글리세라이드, 인지질, 총 콜레스테롤, 뇨소질소, 크레아티닌, 뇨산, Na, K, Cl, P, GOT, GPT, LDH, ALP, creatinphosphokinase, γ-GPT, 오르니틴 디카복시라제 등

주 5 ) 뇨소, pH, 잠혈, 총단백 당, 케톤체, 유로비리노겐 및 빌리루빈의 반정량 시험을 하며, 필요에 따라 침사의 현미경적 검사를 실시한다.

주 6 ) 시험에 사용된 모든 동물(도중에 사망하거나 도살한 동물 포함)을 부검하여 육안관찰을 하고, 고정액에 고정시킨다. 뇌, 하수체, 폐, 심장, 간장, 비장, 신장, 부신, 정소 및 난소의 중량을 측정한다.

주 7 ) 병리조직학적 검사는 아래의 장기에 대해서 실시한다. 최고용량군과 대조군에 대해서 검사하는데, 최고 용량군에서 조직학적 변화가 관찰된 장기에대해서는 다른 용량군에서도 조직학적 관찰을 해야한다.

뇌, 척수, 말초신경, 하수체, 안구, 비강*, 폐, 혀, 식도, 위, 소장, 대장, 피부, 타액선, 임파절, 갑상선(상피소체 포함), 흉선, 심장, 간장, 췌장, 비장,신장, 부신, 방광, 정소, 정낭, 전립선, 유선(암), 난소, 자궁, 흉골(골수포함), 측골 또는 대퇴골(관절 포함)

* 흡입시험의 경우에는 비강, 인두, 후두 및 기관

제 10항  유전독성시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험은 시험물질의 유전독성 및 발암원성을 예측하는데 그 목적이       있다.

2. 정의

2.1  복귀돌연변이성

히스티딘을 필요로 하는 박테리아가 히스티딘이 필요 없는 종으로 변화되는 유전자 변화

2.2  염색체이상

포유류 배양세포를 이용한 염색체의 구조나 숫자 변화

2.3  소핵

세포분열의 말기상태에서 염색체의 조각들로 구성된 작은 입자들

가. 세균을 이용하는 복귀돌연변이시험

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험균주

Salmonella typhimurium(TA 1535, TA 1537, TA 98, TA 100) 및 Escherichia coli (WP 2 uvr A)를 이용한다.  과학적 근거가 있을 때에는 다른 균주를 추가할 수 있다.

2. 시험방법

2.1  원리

박테리아를 시험물질에 노출시키고 최소배지에 이식한 후 적정기간 동안 배양하고 형성된 콜로니수를 대조군과 비교한다.

2.2  용량

시험물질의 최고농도는 항균작용과 용해도를 고려하여 설정한다.  원칙적으로 항균작용이 나타나는 농도를 상한선으로 하여 적어도 5단계의 간격으로 용량을 설정한다(주 2). 항균성이 나타나지 않을 경우에는 원칙적으로 5 mg/plate를 최고한도로 한다.

2. 시험방법

프리인큐베이션 법, 플레이트 법 어느 것으로라도 실시할 수 있다(주3). 각용량에 대해서 2매 이상의 플레이트를 이용한다.  동시에 적절한 대사활성화  계(랫드, 9,000g 상등액등)를 첨가한 조건에 있어서도 동일한 시험을 실시한다.(주 4) 음성대조로서 원칙적으로 용매를 이용한다. 양성대조로서 적절한 기지의 변이원성 물질을 이용한다.(주 5)

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

복귀 돌연변이 집락수의 실측치와 평균치 및 표준편차를 표시한다. 복귀 돌연변이 콜로니의 수가 음성대조에 비하여 명확히 2배 이상이면서, 용량의존성을 가지며, 그 작용에 재현성이 인정될 경우 양성으로 판정한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험균주의 종

2.4 시험조건 : 시험농도 및 시험농도 설정의 근거, 시험당 플레이트수, 배지조성, 대사활성시스템, 처리과정, 음성양성대조군

2.5  플레이트당 복귀돌연변이균주의 수

2.6  통계처리법

나. 포유류 배양세포를 이용하는 염색체 이상시험

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  사용세포

초대 또는 계대배양세포 가운데에서 1종을 선택한다. Chinese               hamster-섬유모세포주(CHL 혹은 CHO 등)를 이용하는 것이 바람        직하다.

2. 시험방법

2.1  원리

포유류 배양세포를 시험물질에 노출시킨 다음 콜히친이나 콜세미드로처리하여 세포분열의 중기상태로 만들어 염색체 이상을 관찰한다.

2.2  용량

세포증식 혹은 세포분열을 50% 이상 억제하는 농도를 최고농도로 하고, 단계적으로 수개 농도에 대해서 시험한다(주 6). 세포독성이 인정되지 않는 경우에는 최고농도를 5mg/ml(또는 10mM 상당의 농도)로 한다(주 7).

2.3  시험물질의 처리 및 표본의 제작

1차 시험시는 활성대사효소계존재 (+S9) 및 부재 (-S9) 모두에서 실시하며 시험물질은 세포에 적어도 3～6시간 적용시킨후 적어도 세포의 1.5증식주기 이후에 염색체 표본을 제작한다.  1차 시험에서 활성대사효소계 존재 및 부재 모두에서 음성인 결과가 얻어지면, 활성대사효소계 부재하에서 세포에 시험물질을 24～48시간 연속적용(세포 1.5 증식주기이상 시험물질적용)시킨 추가 실험 즉 직접법을 시행한다.  각 용량당 적어도 2매 이상의 플레이트를 제작한다. 염색체 표본에 앞서 1～3시간 전에 콜세미드 (혹은 콜히친) 처리를 한 후 염색체 표본을 만든다.

2.4  염색체 이상의 관찰

용량당 200개의 분열중기상을 현미경 하에서 관찰하고 염색체의 구조이상(염색체형 및 염색분체형으로 구분)을 가진 세포 및 배수체의 출현율을 구한다. 또 별도로 갭만을 가진 세포를 제외한 출현율을 구한다. 음성대조는 원칙적으로 용매를 이용한다. 양성대조로서는 적절한 기지의 염색체 이상 유발물을 이용한다(주 9).

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

염색체 이상을 가진 세포수의 실측치와 평균치 및 표준편차를 표시한다.  염색체 이상을 가진 세포의 출현율이 음성대조에 비하여 확실히 증가하고 또, 그 작용에 재현성을 가지며 용량 의존성이 인정될 때에는 양성으로 판정한다. 적절한 통계처리를 하도록 한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  사용한 세포

2.4  시험조건

배지조성, CO2농도, 배양시간, 시험물질 농도 및 시험농도 설정의 근거, 처리기간, 콜히친 처리 기간 및 농도, 대사활성시스템, 음성양성대조군

2.5  세포배양의 수, 분석에 이용한 중기(metaphase)의 수, 유사분열지            수

2.6  염색체 이상의 판단 기준, 염색체 이상의 종류와 수

다. 설치류를 이용하는 소핵시험

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  사용동물

마우스 등의 설치류 가운데에서 1종을 선택하는데 각용량당 6마리 이상의 수컷을 이용한다.

2. 시험방법

2.1  원리

시험동물을 시험물질에 노출시키고 골수를 채취하여 다염성 적혈구의 소핵을 현미경으로 관찰한다.

2.2  용량

체중의 증가억제 등, 어떠한 독성증상이 나타나는 용량을 최고용량으로 하며, 원칙적으로 공비 2로서 적어도 3단계의 용량을 설정한다(주 11).

2.3  방법

복강내(또는 경구)투여한다. 1회 투여를 원칙으로 하지만, 필요에 따라  연속투여를 할 수도 있다. 음성대조로서 용매를, 양성대조로서 기지의 소핵유발물질을 투여한다(주 12). 시험물질 투여후, 적절한 시기에 각군의 전동물로부터, 골수도말 혹은 말초혈액 망상적혈구 표본을 제작한다(주 13).  원칙적으로 1개체당 2,000개의 적혈구를 계수하여 그 가운데 소핵의 유무를 조사한다.  골수 세포의 경우 정염성 적혈구도 같이 카운트하여 다염성 적혈구수와 정염성 백혈구수와의 비율을 구한다(주 14).

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

골수세포의 경우는 소핵을 가지는 다염성 적혈구의 출현빈도, 그리고 다염성 및 정염성 적혈구수의 비율을 표시한다. 말초혈액의 경우는 소핵을 갖는 망상 적혈구의 type 별로 표시한다. 다염성 적혈구 중의 소핵수가 용량에 비해 증가하거나 typeIII까지의 소핵을 갖는 망상 적혈구수의 증가가 통계적으로 유의성이 있을 때 또는 적어도 1개 이상의 용량군에서 통계적으로 유의한 재현성이 관찰될 때 양성으로 판정한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물:종, 계통, 체중, 주령, 성 및 사용수

2.4  시험조건: 시험물질 처리 및 시료채취에 관한 상세한 서술등

2.5  소핵판단 기준

2.6  용량/반응관계 (가능한 경우)

주 1 ) 유전독성 혹은 암원성을 예측하는 시험방법에는 아래와 같은 각종 단       기시험법이 있다.

1. 유전자 돌연변이 유발성을 지표로 하는 시험

1) 미생물을 이용하는 유전자 돌연변이 시험

2) 포유류 배양세포를 이용하는 유전자 돌연변이 시험

3) 곤충류를 이용하는 유전자 돌연변이 시험

4) 마우스를 이용하는 스폿트 시험

5) 마우스를 이용하는 특정좌위 시험

2. 염색체 이상 유발성을 지표로 하는 시험

1) 포유류 배양세포를 이용하는 염색체 이상 시험

2) 설치류의 골수세포를 이용하는 염색체 이상시험

3) 설치류를 이용하는 소핵시험

4) 설치류의 생식세포를 이용하는 염색체 이상시험

5) 설치류를 이용하는 우성치사시험

6) 마우스를 이용하는 상호전좌시험

7) 식물세포를 이용하는 염색체 이상시험

3. DNA 손상성을 지표로 하는 시험

1) 미생물을 이용하는 phage 유발시험

2) 미생물을 이용하는 DNA 수복시험

3) 포유류 세포를 이용하는 부정기 DNA합성(UDS)시험

4) 포유류 세포를 이용하는 자매염색분체 교환(SCE)시험

4. 기타 시험

1) 효모를 이용하는 유사분열 승환 및 유전자 교환시험

2) 마우스를 이용하는 정자형태 이상시험

3) 포유류 배양세포를 이용하는 형질전환시험

주 2 ) 공비가 2～3으로 하는 것이 바람직하다.

주 3 ) 과학적으로 정당한 이유가 있으면 다른 방법을 이용해도 좋다.

주 4 ) 포유류(보통은 랫드)에 적절한 약물대사효소계의 유도체(PCB alachlor 혹은 페노바비탈과 5,6-벤조후라본의 병용 등)를 투여한 후, 간장균질액에서 9,000g로 원심분리하여 얻은 S9을 조제한다. 이 S9에 보조인자 등을 첨가한 S9 Mix를 이용한다.

주 5 ) 세균을 이용하는 복귀 돌연변이 시험용의 양성대조 예

1. 직접법의 경우

Salmonella typhimurium

TA 1535 : ENNG, 나트륨 아지드

TA 1537 : ICR-191, 9-아미노 아크리딘

TA 98   : AF-2, 4NQO, 2-Nitrofluorene

TA 100  : AF-2, ENNG, 4NQR, 나트륨 아지드, MMS

Escherichia coli

WP 2 UvrA : AF-2, ENNG, 4NQO

2. 대사활성화법(S9법)의 경우

Salmonella typhimurium

TA 1535 : 2-AA

TA 1537 : 2-AA, B(a)P

TA 98   : 2-AA, B(a)P

TA 100  : 2-AA, B(a)P

Escherichia coli

WP 2 uvrA : 2-AA

주 6 ) 적어도 공비 2의 3단계 농도를 이용하는 것이 바람직하다

주 7 ) 용해는 시험물질이 수용성인 경우에는 생리식염수를 이용하고, 불용성인 경우에는 원칙적으로 DMSO를 이용한다. 시험물질에 따라서는 CMC 나트륨염에 의한 현탁액을 이용하는 경우도 있다

주 8 ) 적절한 간격을 두어 표본을 2 회 이상 제작하는 것이 바람직하다

주 9 ) 포유류 배양세포를 이용하는 염색체 이상 시험용의 양성대조 예

1. 직접법인 경우

MMC, MMS, Ethylnitrosourea, EMS, 4-NQO 등

2. 대사활성화법(S9법)인 경우

B(a)P, CP 등

주 10 ) 2-6의 출현율을 기준으로 종합적으로 판정한다

주 11 ) 독성이 낮은 경우는 투여 가능한 최대량을 이용하는데 2g/kg을 최고한도로 한다.

주 12 ) 설치류를 이용하는 소핵시험용의 양성대조물질(예)

mitomycin C (MMC)

cyclophosphamide(CP)

Ethylmethanesulfonate

Ethylnitrosourea

Triethlyenemelamine

주 13 ) 표본의 제작은 시험물질 투여 후 특정의 시간(18 ～ 30시간)에 실시하는 방법이 일반적이지만, 경시적(24 ～ 72 시간)으로 수회 실시하는 방법도 있다. 예비시험에서 가장 감수성이 높은 시기를 선택할 필요가 있다. 수회투여의 경우에는 최종투여 후 24시간째에 실시한다.

주 14 ) 다염성 적혈수 대신에 망상적혈구의 빈도를 구해도 좋다. 다염성적혈구의비율이 감소했을 경우에는 세포의 분열이 억제되어 있다는 것을 시사하는 것이다.

제 11항  생식능 및 차세대 영향 시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험은 고환기능, 난소주기, 교배능력, 수태능 등의 생식능 및 태자의 발병율, 사망률, 최기형성과 같은 발생독성에 관한 일차적 정보를 얻는데 그 목적이 있다.

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물종

랫드나 마우스 등 1종이상의 동물을 사용하는데, 최기형성시험에 사용되는 동물종과 동일한 동물을 선택한다.  동물종, 계통 또는 품종을 선택하는데 있어서는 수태능력, 자연발생기형의 발생빈도, 기타 생식독성물질에 대한 감수성 등을 고려한다. 만성독성시험과 같은 동물종을 사용할때는 계통까지도 같은 것으로 한다.

1.1.2  동물수

랫드나 마우스 사용시 처치군과 대조군에서 각각 20마리 정도의 임신동물이 얻어질 수 있도록 암수를 준비한다.

2. 시험방법

2.1  원리

동물의 암수에 시험물질을 수컷에게는 적어도 1회의 정자형성기간 동안 암컷에게는 2회 이상의 발정주기동안 투여하고 암수를 교미시켜 임신기간 및 수유기 동안 계속 시험물질을 투여하여 시험물질의 생식능 및 후세대에 발생에 미치는 영향을 조사한다.

2.2  시험물질

2.2.1  투여방법

원칙적으로 경구투여를 한다. 시험물질은 사료나 음료수에 첨가하여 투여하도록 한다. 사료에 첨가하는 시험물질의 농도는 5%(w/w) 이하로 한다. 시험물질의 성상이 경구투여 할 수 없는 경우는 비경구투여로 한다.

2.2.2  용량

최대 무작용량을 알기 위하여 적어도 3단계 용량의 시험군을 설정한다.  최고용량은 양친동물(P)에 섭이량의 저하나 체중증가 억제 등 약간의 독성징후를 나타내지만, 10% 이상의 사망율은 나타나지 않는 양으로 한다.  최저용량은 생식능 및 후세대의 발생에 독성영향을 나타내지 않는 양으로 한다.  대조군은 별도로 둔다.

2.3  교배와 시험물질의 투여

(1) 부친동물에는 5～8주령 일 때부터 시험물질을 투여하는 데 교미전 10주간(마우스는 8주간)이상 시험물질을 매일 투여한 후 교배에 임한다.  모친동물에는 적어도 교배 전까지 2주간 계속 투여하고 다시 3주간의 교배 및 임신기간, 그리고 F1의 이유시까지 매일 투여한다.  암수의 동거기간은 2～3주간 정도로 하는데 그동안 매일 교미의 유무를 확인한다.

(2) 교미가 확인된 암컷은 분리사육하고 자연분만시켜 제 1세대(F1)를 얻는다. 한 어미에서 태어난 새끼들의 수를 조정할 때에는, 출생후 비교적 빠른 시기에 새끼들의 암수 숫자를 동일하게 일정한 마리수를 무작위로 남긴다.

(3) F1을 이유시키는 단계에서 차세대를 얻기 위한 동물을 무작위로 선택하고 나머지는 부검한다. 차세대를 얻기 위한 동물에는, 이유 후 부친동물에서와 마찬가지로 시험물질을 10주간(마우스에서는 8주간) 이상 투여한 후, 원칙적으로는 각각 다른 어미에서 태어난 암수끼리 20쌍 이상을 만들어 양친동물과 마찬가지로 교배시켜 제 2세대(F2)를 얻는다. F2는 원칙적으로 이유 후 성 성숙기에 이르기까지 시험물질을 투여하고 사육한다.

2.4  관찰사항

2.4.1   P

일반상태 및 사망의 유무를 관찰하고, 체중 및 섭이량(필요에 따라 섭수량)을 측정하고, 시험물질 섭취량을 산출한다.

P의 수컷에 대해서는 교미율 및 수태율을 산출한다. 또 P의 암컷에 대해서는 분만의 이상유무를 검색하고 출산율을 산출한다(주 1).

F1 이유시에 어미는 부검하고, 내부기관을 관찰한다.

F의 수컷, 그리고 교미, 임신, 출산을 하지 않은 암컷은 적절한 시기에 도살하여 내부기관을 관찰한다(주 2).

2.4.1  F1

갓 태어난 F1에 대해서는 출생 새끼수, 생사확인, 성별, 체중 및 외관의 변화 등을 조사한다.

출생 후는 일반상태, 사망의 유무, 성장 및 형태와 기능의 발달을 관찰한다. 적어도 주 1회 체중을 측정한다. 적당한 시기마다 생존율을 산출하고 이유시에 이유율을 산출한다(주 3).

F2를 얻기 위한 교배용의 F1에 대해서는 P와 마찬가지의 검색을 하며, 나머지 F1은 이유시에 부검한다.

2.4.3  F2

F1과 동일한 방법으로 관찰을 하며, 원칙적으로 성 성숙기에 부검한다. 필요에 따라 조직학적 검사 또는 혈청생화학적 검사를 한다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

관찰된 이상상태나 독성증상과 시험물질의 투여량과의 관계에 대해서는 적절한 통계학적 수법을 이용하여 고찰하고, 최대 무 작용량에 대해서 견해를 밝힌다. 이때 이유까지는 한배의 새끼들을 표본단위로 한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물: 종, 계통, 체중, 주령, 성 및 사용수

2.4  시험물질투여 등에 의한 독성반응자료

2.5  시험기간중 사망시간, 또는 시험종료후 생존 동물수

2.6 각 동복 태아의 체중, 신생자의 평균체중 및 종료시 신생자 개별 체중표

2.7 각 종의 이상징후의 관찰시기 및 그 후의 경과

2.8 P 동물 체중의 성적

2.9 부검소견

2.10 현미경을 통한 검사소견

2.11 통계적처리

주 1 ) 보통 다음의 계산법에 의한다.

교미율 = (교미동물수/동거동물수) × 100

수태율 = (임신동물수/교미동물수) × 100

출산율 = (출산어미수/임신어미수) × 100

주 2 ) 수컷은 보통 교배기간이 끝났을 때 도살한다. 암컷에 대해서는 교미가 되지 않은 것은 교배기간이 끝났을 때, 또 임신이나 출산이 안된 것은 교미일부터 계산해서 출산예정일을 2, 3일 경과한 때에 도살한다.

주 3 ) 보통, 다음의 계산법에 의한다.

생존율 = (검사시의 생존새끼수/출산시의 새끼수, 생후 4일 또는 도태직후의 생존 새끼수 또는 이유시의 생존새끼수)×100. 검색의 시기에 따라 분모가 다르다.

이유율 = (이유시 생존새끼수/생 후 4일 또는 도태 직후의 생존새끼수) ×100

제 12항  최기형성시험

I. 개요

1. 목적

이 시험은 시험물질을 태자의 기관형성기 상태에 있는 임신동물에 투여하고, 시험물질이 태자의 발생에 미치는 장해, 특히 최기형성을 밝히는데 목적이 있다.

2. 정의

2.1  최기형성

태자 발생기동안 구조적으로나 기능적으로 영구적 이상을 초래하는 화학물질의 성질

II. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물종

(1) 랫드 또는 마우스와 같은 설치류 및 토끼와 같은 비설치류로부터 각 1종 이상씩을 선택한다.  동물종, 계통 및 품종의 선택은 생식능 및 차세대 시험에서와 같이 한다.

(2) 만성독성시험과 같은 동물종을 이용하는 경우에는 그 계통도 같이하도록 한다.

(3) 랫드, 마우스 또는 토끼 이외의 동물종을 이용할 때는 그 지침이 본시험의 목적에 알맞게 적당히 수정할 필요가 있다.

1.1.2  동물수

랫드, 마우스에서는 임신이 성립된 개체의 수가 각 용량군마다 20마리 이상, 토끼는 12마리 이상으로 한다.

2. 시험방법

2.1  원리

시험물질을 태자의 기관형성기에 투여한 후 분만 직전에 부검하여 임신성립여부, 황체수, 착상수를 조사하고, 내부기관을 육안적으로 관찰한다.

2.2  시험물질

2.2.1  투여방법

원칙적으로 강제 경구투여를 한다.

2.2.2 용량

용량․반응 관계를 알고, 최대 무작용량을 측정하기 위하여, 원칙적으로 3단계 이상 용량의 시험군을 설정한다. 최고용량은 원칙적으로 모동물에 섭이량의 저하나 체중증가의 억제 등 약간의 독성증상을 나타내지만 10%이상의 사망까지는 가지 않는 양으로 한다.  투여가능한 최대량(1,000mg/kg을 한도로 한다)에 있어서도 어미동물에 독성증상이 나타나지 않는 경우는 그 양을 최고용량으로 한다. 최저용량은 태자의 발생에 독성영향이 나타나지 않는 양으로 한다. 별도로 용매만을 투여하는 대조군을 둔다.

2.2.3  투여기간

태자의 기관형성기간은 매일 투여한다.  보통 교미확인된 날을 임신 0일로 했을 경우, 마우스와 랫드에서는 임신 6일부터 16일 까지, 토끼에서는 임신 6일에서 18일까지로 한다.

2.3  관찰사항

2.3.1  모동물

전시험기간 동안에 일반상태를 관찰하고, 체중 및 섭이량을 측정한다. 출산예정일의 바로 전날에 모두 부검하고, 임신성립여부, 황체수, 착상수를 조사하고, 내부기관을 육안적으로 관찰한다.

2.3.2  태자

태자의 생사를 판정하고, 사망새끼에 대해서는 사망시기를 추정한  다. 살아있는 새끼에 대해서는 체중을 측정하고 성을 판정한다. 그리고  외형 및 내부기관의 육안적 검사와 1/3이상의 새끼에 대하여 골격검사를 한다.

Ⅲ. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

관찰된 이상상태나 독성증상과 시험물질의 투여량과의 관계에 대해서는 적절한 통계학적 수법을 이용하여 고찰하고, 최대 무작용량에 대한 견해를 밝힌다. 이때, 한배에서 나온 새끼들을 표본단위로 한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물: 종, 계통, 체중, 주령, 성 및 사용수

2.4  시험물질투여 등에 의한 독성반응자료

2.5  각 시험동물의 이상증후를 발견한 시간 및 이상증후

2.6  사료 및 체중관련자료

2.7  임신 및 출생동물에 관한 자료

2.8  태아관련자료 (사망/생존, 성, 연골 및 경골 결함여부)

제 13항  발암성시험

Ⅰ. 개요

1. 목적

이 시험방법은 시험물질을 동물의 전생애에 걸쳐 연속투여하고, 시험물질의 발암성의 유무를 밝히는데 목적이 있다.

2. 정의

2.1  발암성

적정 경로를 통하여 노출되었을때 시험동물에 신생물을 유발시키는 화학물질의 성질

Ⅱ. 시험

1. 시험의 준비

1.1  시험동물

1.1.1  동물종 및 성

마우스, 랫드 등 2종이상의 암수를 이용한다. 일반적으로 자연 종양발생율, 화학물질에 대한 감수성 등 생물학적 특성이 잘 알려진 동물종이나 계통의 근교계나 그 1대 잡종을 이용한다. 이때 종양의 자연발생율이  낮은것을 이용한다.

1.1.2  년령

5～6 주령의 균등한 체중의 동물을 이용한다.

1.1.3  동물수

각군마다 암수 각각 50마리 이상으로 한다.

2. 시험방법

2.1  시험물질

2.1.1  투여방법

원칙적으로 경구투여를 한다. 시험물질은 사료나 음료수에 첨가하여 투여하는게 좋다. 사료에 첨가할 때는 시험물질의 농도가 5%(w/w) 이하로 한다. 단, 시험물질의 성상에 따라 경구투여가 안될때에는 비경구투여로 한다.  강제투여의 경우에는 매일 일정 시각에 투여하도록 한다.

2.1.2  용량

용량과 반응과의 관계를 알기 위하여 투여량은 3단계로 한다. 미리 1 - 3 개월의 예비시험을 거쳐, 대조군에 비하여 10%정도의 체중감소가 나타나지만 중독에 의한 사망은 나타나지 않는 양을 최고용량으로 한다.  최고용량에서 보통 공비 2～3 으로 중간용량과 최저용량을 설정하며 대조군을 둔다. 실제의 섭취량은 동물의 섭이량 및 섭수량과 시험물질의 농도로 계산한다.

2.1.3  투여기간

시험동물의 거의 전생애에 걸쳐 투여한다. 마우스나 햄스터는 18개월이상, 랫드는 24개월 이상이다.  그러나 마우스와 햄스터에서 18개월, 랫드에서 24개월이 됐을 때에 시험물질에 기인하는 종양성 병변이외의 원인에 의한 사망율이 50% 이내일 것이 필요하다.

2.2  관찰 및 측정사항

2.2.1  일반적 관찰(주 1)

2.2.2  체중, 섭이량 및 섭수량, 식이효율(주 2)

2.2.3  병리학적 검사

- 육안적 관찰(주 3)

- 조직학적 관찰(필요에 따라 전자현미경, 조직화학적 검사도 한    다)(주 4)

- 혈액검사(주 5)

2.2.4  기타 필요한 사항

시험중 사망한 동물에 대해서는 그 원인을 조사한다. 또 일반상태가 매우 나빠져서 죽음에 임박한 동물은 즉시 도살 부검을 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

매일 임상적으로 특이사항을 검사하여야 하며 독성발현 여부를 주의 깊게 하여야 한다.  관찰된 이상상태, 독성증상과 시험물질의 투여량과의 관계에 대해서는 적절한 통계학적 수법을 이용하여 처리한다.

2. 시험결과의 보고

시험보고서는 다음의 항목을 포함한다.

2.1  시험기관의 명칭 및 소재지

2.2  시험책임자 및 담당자 성명

2.3  시험동물: 종, 계통, 체중, 주령, 성 및 사용수

2.4  사료 및 체중관련자료

2.5  시험물질투여 등에 의한 독성반응자료

2.6  각 시험동물의 이상증후를 발견한 시간 및 이상증후

주 1 ) 일반상태 및 사망의 유무를 관찰하고, 생존율을 산출한다.

주 2 ) 섭수량에 대해서는 시험물질을 음료수에 섞어서 투여할 때만 측정토록하고, 식이효율은 동물의  성장기간중에 산출하도록 한다.

주 3 ) 시험에 사용한 모든 동물(도중에 사망하거나 도살한 동물도 포함)을 해부고 전장기에 대해 육안관찰을 한다. 주 4에 나타내는 모든장기를  보존액에 보존한다.

주 4 ) 육안적으로 나타난 전종양성병변부 이외에 대조군 및 최고용량군의 모든 동물에 대해서 아래와 같은 장기에 대해 현미경적 검사를 한다. 최고용량에서 생존동물이 대조군에 비하여 매우 적을 때에는 다음 용량군에 대해서 현미경적 검사를 한다.

최고용량군에서 변화가 나타난 장기에 대해서는 다른 용량군에 대해서도검사를 실시한다.  뇌, 척수, 말초신경, 뇌하수체, 안구, 비강, 폐, 구강 및 혀,식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 외이도, 피부, 타액선, 림프절, 갑상선(상피소체 포함), 흉선, 심장, 간장, 췌장, 비장, 신장, 부신, 방관, 정소, 정낭, 전립선, 유선(암컷), 난소, 자궁, 질, 흉골(골수 포함), 추골또는 대퇴골(관절포함), 흡입시험의 경우에는 비강, 인두, 후두 및 기관.

주 5 ) 부검시에 모든 동물에 대하여 혈액도말표본을 제작하고, 필요에 따라 혈구 수의 계측 및 혈액생화학적 검사를 한다.

제 2 장 물리․화학적 특성평가시험

제 1 항  UV-VIS 흡수 스펙트럼 시험(분광광도법)

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

화학물질의 UV-VIS 스펙트럼을 측정하는 목적은 그 물질이 어느 파장에서 광화학적 분해에 민감한지에 대한 정보를 얻기 위함에 있다. 분광 광도법은 분자식과 구조식에 대한 정보가 필요하며 화학물질의 흡광도를 측정하는 방법으로서 국제표준에 기반한 시험법이다.

분해 현상은 특정한 파장 구역에서 흡수된 전체 에너지에 의해서 좌우되며 에너지 흡수는 몰 흡수(소멸)계수와 밴드의 넓이(band width)에 의해 규정한다. 그러나 흡수가 측정되지 않는 상황에서도 광분해는 일어날 수 있다.

대기 및 수중 환경 중에서 광화학적 분해가 쉽게 일어나므로, 매질에 적합한 스펙트럼 정보를 알고 있다면 후속 시험들을 수행할 때에도 지속적으로 유용한 정보로써 활용할 수 있을 것이다.

2. 정의

용액의 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 모든 흡수물질의 농도 Ci(단위 : mol/ℓ)와 분광광도계 용기의 길이 d(단위 : ㎝), 각 물질에 해당하는 몰 흡수(소멸)계수 εi의 함수이다. 용액의 흡광도 A(광학 밀도)는 아래 공식을 이용하여 구할 수 있다.

A = d ․ ∑ εi ․ Ci

용해 흡수 피크에 관한 밴드의 넓이 λ는 최대 흡광도의 절반에서 나노미터(nm=10-9 m)로 표현되는 파장 범위이다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다.

보정에 적합한 표준물질을 아래에 제시하였으니 참고한다.

(1) Potassium dichromate(0.005 mol/ℓ 황산용액)(주 1)

log ε	3.56	3.63	3.16	3.50
λ(nm)	235	257	313	350

(2) Fluoranthene(메탄올에서)(주 2)

log ε	4.75	4.18	4.73	3.92
λ(nm)	235	236	288	357

(3) 4-nitrophenol(메탄올에서)(주 2)

log ε	3.88	4.04
λ(nm)	288	311

2. 시험 방법

2.1. 시험 원리

공시료(blank)와 시험물질 간의 흡수차이를 기록하는 겹빛살 분광광도계(double-beam spectrophotometer)를 이용한다.

2.2. 품질 기준

재현성과 감도를 직접적으로 측정해야 할 필요는 없지만, 적당한 재현성과 감도를 확보하기 위해서는 표준물질의 스펙트럼을 측정하는 시스템의 정확성이 확실하게 보장되어 있어야 한다. 시험물질의 UV-VIS 스펙트럼을 얻기 위해서는 겹빛살 분광광도계를 주로 사용한다. 겹빛살 분광광도계는 0~2단위(units) 흡수범위 상에서 ±0.02단위의 정확도를 보이며, ±0.5 nm의 파장 정확도를 가지고 200~750 nm의 파장에서 일어나는 흡수를 기록할 수 있어야 한다. 측정용 셀(cell)은 이 파장 범위에서 투과되고 1 % 이내로 결정된 path length를 가져야 한다. 기기가 제대로 작동하는 것을 보장하려 한다면 주기적으로 K2Cr2O7 시험용액(흡광도 정확도)과 홀뮴 글래스(파장 정확도)로 스펙트럼을 측정해야 한다.

한편, 겹빛살 분광광도계를 사용할 수 없는 경우에는 홑빛살(single-beam) 분광광도계를 사용하여 전체파장 범위에서 5 nm 간격으로 흡광도를 측정하고 1 nm 간격으로 최대 흡광도를 나타내는 스펙트럼을 측정한다. 이 때, 겹빛살 분광광도계를 사용하는 것과 마찬가지로 파장과 흡광도를 측정한다.

3. 시험 수순

3.1. 조제

3.1.1. 시험용액 조제

시험용액은 가장 순도가 높은 시험물질의 적절한 양을 정확하게 칭량하여 조제한다. 시험용액은 0.5~1.5 unit 범위 내에서 적어도 한 개의 최대 흡광도가 나타날 수 있는 농도로 만들어야 한다.

어떤 물질의 흡수는 그 물질의 특수한 화학적 형태에 의해 나타나며 산성용매인지, 염기성 용매인지, 중성 용매인지에 따라 나타나는 형태가 달라지기도 한다. 따라서 위와 같은 용매에서 나타나는 스펙트럼에 대해 알기 위해서는 용매별 용해도와 농도에 대한 정보가 필요하다. 단, 어떤 수용액 용매 내에서 충분한 농도를 얻기 어려울 것으로 사료된다면 메탄올과 같은 적절한 유기 용매제를 사용한다.

산성 용매의 pH는 2이하이어야 하며, 염기성 용매의 pH는 적어도 10은 되어야 한다. 산성, 중성, 염기성 용액을 만들기 위한 용매는 200 nm 이하 자외선을 투과할 수 있는 증류수를 사용해야 한다. 만약 메탄올을 사용해야 하는 경우라면 전체 부피의 10 %만큼 HCl이나 NaOH 수용액을 첨가하여 산성, 염기성 용액을 만들 수 있다([HCl], [NaOH]=1 mol/ℓ).

이론적으로, 측정하고자 하는 시험물질 외의 모든 화학물질 종들은 겹빛살 분광광도계의 빔 모두에 존재하게 되므로 기록상으로 나타나지 않게 될 것이다. 실제로 대개의 경우 용매가 과량으로 존재하기 때문에 시험물질의 스펙트럼이 기록될 수 없는 영역 이하에서 파장의 문턱값(threshold value)이 존재하게 되므로 용매의 파장은 고려하지 않아도 좋다. 그러한 파장은 용매나 시험용매의 특성을 나타낸다. 일반적으로 증류수는 200 nm부터, 메탄올은 210 nm, 핵산은 210 nm, 아세토니트릴은 215 nm, 디클로로메탄은 235 nm부터 유용하게 사용된다.

3.1.2. 공시료액(blank solutions)

공시료는 용매, 시험물질 및 다른 모든 화학물질에 대해 준비해야 하며 흡수 스펙트럼을 시험용액과 동일한 방법으로 동시에 기록해야 한다. 공시료가 나타내는 기준선 스펙트럼(base line spectrum)은 그 수치가 0값에서부터 ±0.05 이상 차이가 나서는 안 된다.

3.1.3. 셀(cells)

일반적으로 셀의 path length는 0.1 ㎝에서 10 ㎝ 사이이다. 셀을 선택할 때에는 0.5에서 1.5 unit의 흡광도 범위 내에서 최소 하나 이상 최대흡광도가 기록될 수 있는 길이의 것을 고른다. 셀의 각 세트는 Beer-Lambert 법칙에 의해 알려진 시험용액의 농도와 흡광도가 적용될 수 있도록 사용한다. 또한 셀은 기록이 되는 범위 내에 있는 스펙트럼 전체에 걸쳐 투과성이 있어야 하며, path length의 정확도가 최소 1 %인 것으로 알려져 있어야 한다. 한편 셀은 적절한 방법을 사용해서 전체적으로 깨끗이 세척하고(석영재질 셀에는 크롬산을 사용하는 것이 좋음) 시험용액이나 공시료 용액으로 여러 차례 헹구어 준다.

4. 시험 수행

시험에 사용되는 셀 모두를 공시료액으로 헹구어 준 후 공시료액으로 채워 놓는다. 기기는 분석하려는 파장 분해능(wavelength resolution)과 공시료 스펙트럼에 최적화된 비율에서 스캔되도록 설정한다. 그 후 시료 셀을 헹구고 시험용액으로 채워넣은 다음 반복적으로 스캔을 실시하는데, 이 때 기준선(base line)을 표시하기 위해서 같은 스펙트럼 차트에 그려지도록 하는 것이 바람직하며 이 과정은 25 ℃에서 실시하도록 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

몰 흡수계수 ε는 모든 시험물질의 최대 흡수치에 대하여 계산하여야 한다. 이때의 식은

ε(흡수계수)=[eqn: { A} over {Ci×d }]

이다. 여기서 A는 용액의 흡수도, Ci는 농도, d는 분광광도계 셀의 폭을 나타낸다. 기록되었거나 대칭 피크 외삽에 의해서 산출된 분해 능력을 나타내는 각각의 피크에 대한 밴드의 넓이를 기록하어야 한다.

2. 시험 보고서

시험 보고서에는 3가지 스펙트럼(산성, 염기성, 중성 pH 조건) 스펙트럼 각각에 대한 사본을 첨부한다. 만일 수용액도 메탄올도 아닌 경우에는 스펙트럼이 하나만 나타난다. 스펙트럼의 파장은 해독 가능한 범위 내에 있어야 하며 각 스펙트럼에 따른 시험조건을 명확하게 기재해야 한다. 각 스펙트럼의 최대치에 대한 ε 값과 밴드의 넓이를 최대 파장에 따라 계산하여 표 형식으로 나타내어 보고한다. 그리고 다양한 시험조건 역시 보고서에 포함되어야 하는데, 스캔 속도라든지, 분광광도계의 모델명, 슬릿의 넓이, cell의 형태와 path length, 시험 물질의 농도와 성질 및 용매의 산성도 등이 그에 해당한다. 최근에 수행되는 광도 및 파장 정확성 측정에 관한 스펙트럼 시험에서는 적절한 표준물질들을 제시할 것을 요구한다(재현성과 감도 부분 참조).

* 주 1 : J.A.A. Ketelaar, Photoelectric Spectrometry Group Bulletin 8, Cambridge (1955).

* 주 2 : Chemical Rubber Company, Atlas of Spectral Data, Cliffland, Ohio.

제 2 항  녹는점/녹는 범위 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

어떠한 물질의 녹는점은 그 물질이 고체화되는 온도 또는 어는 온도와 일치하는 것이 이론적이다. 또한 일반적으로, 어떠한 물질이 고체상에서 액체상으로 변화될 때 온도가 일정하게 유지되는 범위가 있다. 이러한 온도 범위를 “녹는 범위(melting range)”라고 하는데, 이러한 온도 범위의 처음과 마지막 단계를 측정하는 것이 본 시험의 목적이다.

녹는점과 녹는 범위에 대한 시험자료는 시험 자체만으로 결과를 내는 것도 의미가 있지만, 본 시험에서 산출된 결과들이 여러 후속실험에서 필요로 하는 기본정보가 될 수 있기 때문에 어떠한 화학물질의 물리·화학적 특성을 파악하는데 있어 시발점이 될 수 있는 시험이라 할 수 있다.

본 시험의 기초적인 원리는 주 1, 2에 자세히 수록되어 있으며 몇 가지 시험법 및 시험장치에 대한 구체적인 사항도 기술되어 있으므로 참고하도록 한다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서 사용되는 표준물질과 시험물질은 가장 순도가 높은 것을 사용해야 하며, 시험물질에 존재할 수 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다. 시험이 불순물에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 사전에 물질의 순도를 점검해 볼 것을 권장한다. 한편, 시험법의 선택기준은 시료의 물리적인 응집상태와 쉽게 분쇄되는지, 분쇄가 어려운지 또는 전혀 분쇄되지 않는지에 따라 결정한다.

3. 정의

녹는점이란 대기압 하에서 고체상에서 액체상으로 전환되는 온도로 정의한다. 섭씨(℃)를 켈빈온도(K)로 전환하는 식은 다음과 같다.

T = t + 273.15

여기서 T는 켈빈온도(K)이고 t는 섭씨온도(℃)를 나타낸다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질은 사용하지 않아도 무방하다. 단, 본 시험에 사용할 수 있는 보정물질(calibration substance)에 관한 구체적인 내용은 주 3에 제시되어 있으니 이를 참고하도록 한다.

2. 시험법 원리

본 시험의 기본원리는 고체에서 액체상 또는 액체에서 고체상으로 상전이가 일어나는 온도나 온도 범위를 측정하는 것이다.

3. 시험법 간 비교

아래에 제시된 표에 여러 시험법들의 온도범위와 정확성에 관한 내용을 수록하고 있다.

시험법	온도범위(K)	정확도(K)
모세관/액상수조 (Capillary/ liquid bath)	273～573	±0.3
모세관/금속블록 (Capillary/metal block)	293～573 이상	±0.5
Kofler hot bar	293～573 이상	±1.0
용융 현미경법 (Melt microscope)	293～573 이상	±0.5
시차열분석과 시차주사열량계 (Difference thermal analysis and differential scanning calorimetry)	173～1273	±0.5에서 600 K까지 ±2.0에서 1273 K까지
어는점	223～573	±0.5
유동점(Pour point)	223～323	±3.0

4. 시험 방법

4.1. 액상수조 내 모세관(capillary tube in a liquid bath)

4.1.1. 장치

그림 1에 유리제 시험장치에 대한 모식도가 제시되어 있다.

액상수조의 종류는 측정하려는 물질의 녹는점에 따라서 결정된다(예. 액체 파라핀 473 K 이하, 실리콘 오일 573 K 이하). 523 K 이상의 온도에서는 무게 비가 황산 3 : 황산칼륨 2 인 혼합물을 사용할 수 있다. 이러한 혼합물을 사용할 때에는 주의를 요한다. 그리고 온도계는 ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K8001 표준 규격을 만족하는 것만을 사용해야 하며, 온도계의 수은구 중간 부분이 시료가 위치하는 부분에 있는 모세관과 닿아 있어야 한다.

[단위 : mm]

A : 용기

B : 마개

C : 배출구

D : 온도계

E : 보조온도계

F : 액상수조

G : 외경 최대 5 mm 모세관, 약 100 mm

길이와 약 1 mm 내경 그리고 약 0.2~0.3 mm           벽 두께

H : 가지관

A 단계 : 녹는 시점, 미세한 분말이 벽에 점착된다.

B 단계 : 시료가 녹아 움츠러들면서 벽과 명확히 구분된다.

C 단계 : 움츠러든 시료가 녹아내리며 액체화된다.

D 단계 : 완벽하게 쪼그라들었지만 고체시료 일부는 존재한다.

E 단계 : 녹는 마지막 단계로 고체입자가 없다.

4.1.2 시험 수순

건조된 물질을 미세하게 분쇄하고 한쪽 끝을 녹여서 막아 놓은 모세관에 채우는데, 시료를 꽉 채운 다음에 채워진 높이가 약 3 ㎜가 되어야 한다. 시료를 일정하게 채우기 위해서 모세관 튜브를 시계유리(watch glass) 위 유리관을 지나서 약 700 ㎜ 높이에서 끊어야 한다. 수조를 가열할 때에는 온도가 분당 3 K 정도씩 올라가도록 하고 교반시킨다. 일반적으로 모세관은 온도가 녹는점의 약 10 K 아래 정도까지 올랐을 때 장치에 장착시킨다. 그 후 실제로 녹는 과정 중에 온도가 상승하는 속도를 최대 1 K/min이 되도록 조절한다. 온도가 서서히 올라가는 조건에서 미세하게 분쇄된 물질들은 일반적으로 그림 2에서 나타나는 바와 같이 녹는 양상을 보인다. 녹는점을 측정하는 동안 녹기 시작하는 단계 A(그림에서 A)에서 마지막 단계 E(그림에서 E)까지의 온도를 기록한다.

4.1.3. 계산

보정 녹는점을 계산하는 식은 다음과 같다.

T = TD + 0.00016 ( TD - TE ) n

여기에서 T = 보정 녹는점

TD = 온도계 D에서 읽은 수치

TE = 온도계 E에서 읽은 수치

n = 온도계 D의 emergent stem 상에 나타난 수은 컬럼의 눈금 수

를 나타낸다.

4.2. 금속 블록 모세관(capillary tube in a metal block)

4.2.1. 장치의 외형

금속 블록 모세관 장치에 대한 그림은 아래의 그림 3에 제시된 바와 같다.

A. 온도계

B. 모세관

C. 대안렌즈

D. 전기저항

E. 금속가열블록

F. 램프

G. 금속마개

장치는 다음과 같이 구성되어 있다.

(1) 상부가 공동화되어 있는 둥근 금속 블록

(2) 모세관을 갖은 2개 이상의 구멍을 가진 금속 마개

(3) 전력공급이 일정하게 조절된 전기 가열 시스템

(4) 챔버 하단 벽 내열창 4개

(5) 내부 관찰용 감시 창(다른 3개는 조명용)

(6) 표준화된 온도계

4.2.2. 광전지 검출(photocell detection) 장치

앞서 언급된 바와 같이 채워진 모세관을 가열된 금속 블록 내에 위치시키고 온도는 사전에 정해 놓은 적당한 직선성 비율에 따라 상승비율을 조절한다. 그리고 빛이 직접적으로 광전지에서 시료로 바로 통하도록 설정해 둔다. 시료가 녹기 시작하면 광전지에 도달하는 빛의 세기가 증가하며 정지신호가 디지털 지시계로 보내져 가열 챔버 안의 온도를 기록한다.

4.3. Kofler hot bar

4.3.1. 장치

이 장치는 서로 다른 열전도도를 갖는 두 개의 금속을 사용한 것으로, 막대(bar)는 전기로 가열되고 온도 변화 양상이 그 길이에 따라 대개 직선형이 되도록 디자인된 장치이다. Kofler hot bar의 온도범위는 대략 실온에서부터 573 K 까지 이며, 온도 눈금 및 이동식 포인터를 갖추고 있다.

4.3.2. 시험 수순

시험물질을 hot bar 내 얇은 층 안에 장착하면 수 초 안에 고체와 액체 간의 분할선이 나타난다. 이 때 분할되는 선에 맞게 포인터를 조정하여 온도를 읽는다.

4.4. 용융 현미경(melt microscope)

용융 현미경의 표본 지지체는 가열 챔버의 일부인 금속제 평판으로 되어 있으며, 금속제 평판에 나 있는 구멍에는 광원으로부터 발산된 빛이 들어올 수 있도록 되어 있다. 시료를 구멍 위의 슬라이드에 놓는데 이 때 공기와의 노출을 최소화하기 위해 다른 슬라이드로 위를 덮어도 좋다. 시료가 녹기 시작하는 것이 보일 때까지 서서히 평판을 가열하고 온도를 기록한다. 결정체 물질에 관하여 실험을 수행할 경우 편광을 사용하면 측정 정확도를 더욱 높일 수 있다.

4.5. 시차열분석기(differential thermal analysis : DTA)

시험물질 시료 및 표준물질은 동일 온도에서 처리하며 시험물질이 상 전이를 일으키는 경우에 나타나는 엔탈피 변화는 온도 기록 기준선으로부터의 흡열(용융) 또는 발열(빙결)이 시작됨을 나타낸다.

4.6. 시차주사 열량계(differential scanning calorimetry : DSC)

시험물질 시료 및 표준물질은 동일 온도에서 처리하며 시료와 표준물질 간에 동일한 온도를 유지하기 위해 필요한 내부 에너지 차이를 기록해 둔다. 시료가 상 전이를 일으키는 경우에 나타나는 엔탈피 변화는 열 흐름 기록의 기준선으로부터의 이탈이 나타났음을 의미한다.

4.7. 어는점(freezing temperature)

시료를 튜브에 넣고 지속적으로 교반시킨다. 시료가 냉각됨에 따라 온도를 일정 간격으로 측정하고 온도가 일정하게 유지될 때 그 점을 어는점으로 기록한다(이 때 온도계 상에서 발생할 수 있는 오류를 보정한다). 고체상과 액체상이 동시에 존재하는 온도를 유지하여 갑자기 냉각되는 것을 피하도록 한다.

4.8. 유동점(pour point)

이 시험법은 석유에 관하여 개발된 방법으로서 녹는점이 낮은 기름이나 기름성질을 가진 물질들을 측정하는데 적합하다. 시료를 예열한 후 냉각한 다음 3 K 간격으로 시료의 유동 특성(flow characteristics)을 측정한다. 시험물질의 움직임이 관찰되는 가장 낮은 온도를 유동점으로 기록한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 시험 보고서

시험보고서에는 다음의 내용을 수록하여야 한다.

(1) 측정에 사용된 시험법

(2) 화학물질의 특성 및 불순물

(3) 예상 정확도

(4) 녹는점(예상 정확도 범위 내에서 최소 2개 이상 측정점의 평균치;  녹기 시작한 단계와 마지막 단계의 온도가 정확도 한계 내에서 차이가 있을 경우, 마지막 단계의 측정치를 녹는점으로 간주하고 두 온도 모두를 보고서에 기록한다; 또한 시험물질이 녹기 전에 분해되거나 승화되는 경우에는 그 온도를 기록하도록 한다)

(5) 결과 해석과 관계된 모든 정보, 특히 불순물이나 물질의 물리적 상태와 같은 정보

* 주 1 : Le Neindre, B. and Vodar B., eds. (1975). IUPAC, Experimental Thermodynamics, Vol.II, Butterworths, London, pp. 803 to 834

* 주 2 : Weissberger, R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Vol. I, Part I, Chapter VII, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York.

* 주 3 : IUPAC (1976). Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and Applied Chemistry, 48, 505 to 515

* 주 4 : 표준시험법목록

1. 액상수조 내 모세관(capillary tube in a liquid bath)

(1) ASTM E 324-69 : 유기화합물의 녹는점과 녹는 범위의 시작과 끝 간의 표준 시험법

(2) BS 4634 : 녹는점과 녹는 범위 측정법

(3) DIN 53181 : Bindemittel für Lacke und ähnliche Beschichtungss          toffe; Bestimmung des Schmelzbereiches von Harzen nach Kapillar-Verfahren

(4) JIS K 00-64 : 화학물질 제품의 녹는점 시험법

2. 금속 블록 모세관(capillary tube in a metal block)

(1) DIN 53736 : Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

3. Kofler hot bar

(1) ANSI / ASTM D 3451-76 : 고분자 분말 또는 분체 도장제품을 위한 표준 권장 시험법

4. 용융현미경(melt microscope)

(1) DIN 53736 : Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen

5. 열차 분석기/ 시차주사 열량계(DTA/DSC)

(1) ASTM E 472-86 : 열 분석자료 보고를 위한 표준법

(2) ASTM E 473-85 : 열분석과 관련된 항목의 표준 정의

(3) ASTM E 537-76 : DTA 방법에 의한 화학물질의 열안정성 평가를 위한 표준법

(4) DIN 51005 : 열 분석기(TA)

6. 어는점(freezing temperature)

(1) BS 4633 : 결정점 측정법

(2) BS 4695 : 석유 왁스의 녹는점 측정법(냉각 곡선)

(3) DIN 51421 : Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen

(4) DIN 53175 : Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren

(5) IOS 1392 : 결정점 측정법

(6) IOS 2207 : 석유 왁스류에 대한 응집점 측정

(7) JIS K 00-65 : 화학제품의 어는점 시험법

(8) NF T 60-114 : 파라핀류의 용융점

(9) NF T 20-051 : 결정점 측정법

7. 유동점(pour point)

(1) ASTM D 97-66 : 석유의 유동점 측정법

(2) ISO 3016 : 석유의 유동법 측정법

(3) NBN 52014 : 석유류의 유동점 측정법

제 3 항  끓는점 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 다양한 방법을 통해 어떠한 물질의 끓는점을 측정하는 데에 있는데, 이 때 끓는점은 대부분 주변의 압력으로부터 측정된다. 끓는점을 측정할 때에는 정상 측정값이 계산되어야 한다. 끓는점이 높은 물질과 가열될 때에 분해되는 물질의 경우에는 감압에 의한 측정 장치가 필요한데, 높은 압력 범위로 외삽(extrapolation)하게 되면 오차가 발생하기 쉬우므로 주의한다. 정상 끓는점 부근의 제한된 온도 범위 내에서 증발열이 일정하다는 가정 하에, 아래의 Clapeyron - Clausius 식을 적용할 수 있다.

Log p = [eqn: {△H _{v}} over {2.3RT} +상수(const)]

여기에서, p는 물질의 증기압(Pascal)

△Hv는 증발열(J/mol)

R은 기체상수(8.314 J/mol K)

T는 절대온도(K)

이다.

한편, 불순물이 끓는점에 미치는 영향은 불순도(the nature of the impurity)의 종류에 의해 좌우된다. 시료 중에 휘발성 물질과 같은 불순물이 존재할 경우 정제화가 필요하다. 본 시험지침에 기술된 방법은 액체 및 녹는점이 낮은 물질에 적용되며, 자동 산화, 재배열, 분해 등과 같이 끓는점 이하에서 발생할 수 있는 화학변화가 없다는 전제 하에 유효하다. 기초 원리는 주 1, 2에 수록되어 있다.

2. 정의

일반적인 액체의 끓는점은 대기압 101.325 kPa과 평형인 증기압에서의 온도로 정의한다. 끓는점에서의 온도는 K로 나타내며 별도의 언급이 없다면 압력은 표준압인 101.325 kPa을 의미한다. 섭씨온도를 절대온도인 K로 전환하는 식은

T = t + 273.15

이며, 여기에서 T는 켈빈온도 또는 절대온도

t는 섭씨온도

kPa는 압력

을 나타내며 다른 단위로 전환할 경우 아래와 같은 관계식을 사용한다.

1 bar = 100 kPa

1 ㎜Hg(또는 Torr) = 0.133 kPa

1 atm = 101.325 kPa

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다.

주 3에 수록된 표준 시험법들에 보정 시 사용될 수 있는 일부 물질들이 나타나 있으므로 참고한다.

2. 시험 방법

2.1. 끓는점 측정기(Ebulliometer)

2.1.1. 원리

본 장비는 끓는점 상승을 통해서 분자량을 측정하기 위해 개발된 것으로, 끓는점을 정확하게 측정할 수 있다. 액체가 끓을 때까지 대기압 하에서 평형상태로 가열한다.

2.1.2. 장치

장치는 ASTM D 1120-72에 기술되어 있다(주 3 참조).

2.2. 동적 방법(Dynamic method)

2.2.1. 원리

이 방법을 사용하면 액체가 끓는 동안 환류상태에서 증기의 재농축 온도를 측정할 수 있다. 이 때, 압력이 변화될 수 있으므로 101.325 kPa에 상응하는 끓는점이 기록된다.

2.2.2. 장치

장치에 대한 사항은 OECD 시험지침 104에 기술되어 있다.

2.3. 증류법(Distillation method)

2.3.1. 원리

액체를 증류하고 증기농축 온도와 그 양을 측정한다.

2.3.2. 장치

장치에 대한 설명은 IOS 918-1983과 같은 표준 시험법에 기술되어 있다(주 3 참조).

2.4. Siwoloboff에 따른 방법

2.4.1. 원리

시료를 액체 중탕조에 담겨진 튜브 속에서 가열시킨다. 시료 튜브에 온도계를 붙이고 시료 튜브 안에 끓임관을 삽입하되 바닥으로부터 1 ㎝ 정도 위에 설치한다(그림 1 참조). 끓는점이 가까워짐에 따라 발생하는 거품과 기포는 수면 아래에 설치된 끓임관을 통해 신속히 배출된다. 끓는 온도라 함은 순간적으로 냉각되거나 기포의 발생이 중단되거나 관 안에서 액체가 갑자기 끓어오르는 온도를 말한다.

2.4.2. 장치

액체 중탕조는 “녹는점/녹는 범위 시험”에서의 그림 1과 유사하다. 단지 튜브 내에 시료와 모세관을 넣는 것이 다르다. 시료 튜브의 직경은 5 ㎜이며, 모세관은 바닥에서 1 ㎝ 위에 장착시킨다. 이 때, 장착시키는 높이는 시료의 높이보다 아래에 위치시켜야 한다.

2.4.3. 시험 과정

액체 중탕조는 시료의 끓는점이 얼마인지 예상하고 그에 따라 선택한다. 실리콘 오일의 경우는 573 K 이상, 액체 파라핀은 473 K 이상으로 본다. 처음 중탕조를 가열할 때에는 분당 3 K 정도로 가열하고 교반을 실시한다. 끓는점이 10 K 이하로 예상될 경우 가열 속도를 분당 1 K로 줄인다. 끓는점에 근접하게 되면 모세관 내에 기포가 빠르게 형성된다. 끓는 상태란 순간적으로 냉각되거나 기포의 발생이 일시 중단되거나 모세관 내에서 액체가 급격히 끓어오르는 현상이 나타날 때를 말한다.

2.5. 광전지 검출(Photocell detection)

2.5.1. 원리

시료를 가열된 금속 블록 내부의 모세관에서 가열한다. 이 때 빛이 시료를 통하여 광전지에 쪼여지게 된다. 시료가 끓는점에 도달하면 거품이 발생하며 끓어오르면서 광전지가 받는 빛의 강도가 약해진다. 광전지는 정지 명령을 지시계에 보내게 되는데, 이 때 지시계는 블록 내에 위치한 열저항계에 의해 측정된 온도를 검출한다.

2.5.2. 장치

장치에 대한 사항은 OECD 시험지침 102에 기술되어 있다.

2.6. 시차열 분석기(Differential thermal analysis ; DTA)

2.6.1. 원리

동일한 온도 조절 프로그램에 의해 제어되는 시험물질과 대조물질 간의 온도차이가 기록되어 나타난다. 시료가 엔탈피 변화와 같은 전이형태를 보이면, 온도기록 기준선에서 분리되는 것으로 그러한 변화가 나타났음을 알려준다.

2.6.2. 장치 및 진행

부록에 제시된 표준 시험법을 참조한다.

2.7. 시차주사 열량기(Differential Screening Calorimetry : DSC)

2.7.1. 원리

시험물질과 표준물질은 동일한 온도 제어 프로그램에 의해 제어 받는다. 이 때, 시험물질과 표준물질들이 이상적인 온도를 유지하기 위해 필요한 에너지가 기록된다. 시료들이 엔탈피 변화와 같은 전이형태를 보이면, 열 흐름 기록기준선에서 분리되는 것을 통해 그러한 변화가 나타났음을 알려준다.

2.7.2. 장치 및 진행

주 3에 제시된 표준 시험법을 참조한다.

3. 시험법 비교

다양한 측정방법들에 대한 적용 및 예상되는 정확도를 표 1에 요약하였다. 그 외의 세부 사항은 주 3에 첨부된 표준 시험법을 참조한다. 광전지 검출방법 및 열 분석방법의 장점은 녹는점 측정 뿐만 아니라 끓는점을 측정하는데도 동일하게 사용할 수 있다는 것이며, 자동화된다면 더욱 사용하기 쉬울 것이다. 동적 방법은 증기압을 측정하는 데에도 적용할 수 있으며 또한 이 방법은 가스정류장치(monostat)를 사용하여 측정하는 동안에 설치될 수 있기 때문에 정상 압력으로 끓는점을 보정해 줄 필요가 없는 장점이 있다.

표 1

방법	추정되는 정확도
끓는점 측정기(Ebulliometer)	±1.4K(373 K까지)(1) ±2.5K(600 K까지)(1)
동적 방법(Dynamic method)	±0.5K(600 K까지)
증류법(Distillation method)	±0.5K(600 K까지)
Siwoloboff 방법	±2.0K(600 K까지)
광전지 검출기(Photocell detection)	±0.3K(373 K까지)
시차열 분석기(DTA)	±0.5K(600 K까지) ±2.0K(1273 K까지)
시차주사 열량기(DSC)	±0.5K(600 K까지) ±2.0K(1273 K까지)

(1)여기에서의 정확도는 ASTM D 1120-72에 기술된 바와 같은 비교적 단순한 장비에 적용하는 것이 좋다. 더 정교한 끓는점 측정기는 훨씬 높은 정확도를 지닌다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

최대 ±5 kPa 정도의 표준 대기압 편차에서 Sidney-Young 식을 사용하면 측정된 끓는점을 일반적인 끓는점으로 전환시킬 수 있다.

Tn = T + (fT × △p)

여기에서, △p는 101.325-p

p는 kPa 압력

fT는 끓는점 변화율(보정계수), (K/kPa)

T는 측정된 끓는점(K)

Tn는 일반적인 끓는점

을 나타낸다.

보정계수 fT와 fT의 근사값에 대한 식은 주 3의 표준 시험법에 실려 있다. 그 중에서 하나를 소개하자면, 페인트 내에 사용된 용매에 관한 보정은 DIN 53171에 있고 아래의 표 2에 다시 나타나 있다.

표 2

온도 T(K)	fT(K/kPa)
323.15	0.26
348.15	0.28
373.15	0.31
398.15	0.33
423.15	0.35
448.15	0.37
473.15	0.39
498.15	0.41
523.15	0.44
548.15	0.45
573.15	0.47

2. 시험 보고서

시험보고서에는 다음의 내용이 수록되어야 한다.

(1) 사용된 방법

(2) 화학적 동일성 및 불순도(가능하다면 초기 정제과정에서)

(3) 평가된 정확도

(4) 끓는 온도(정상 압력에 가까운 압력에서 평가된 정확도의 범위 내에서 적어도 두 번 이상 측정하여 산출된 값들의 평균치)

(5) 불순물이나 시험물질의 물리적 상태와 같이 결과의 해석에 있어 영향을 미칠 수 있으리라 생각되는 모든 정보

* 주 1 : Le Neindre, B. and Vodar B., eds. (1975). IUPAC, Experimental Thermodynamics, Vol. II, Butter- worths, London

* 주 2 : Weissberger, R., ed., (1959). Technique of Organic Chemistry, Vol. I, part I, Chapter VII, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New york

* 주 3 : 표준 시험법

1. 끓는점 측정기(Ebulliometer)

ASTM D 1120-72 : 엔진 부동액에 대한 끓는점 표준 측정법

2. 증류공정(끓는 범위)

(1) BS 4349/68 : 석유제품의 증류에 대한 측정방법

(2) BS 4591/71 : 액체 유기물의 증류 특성에 대한 측정 방법

(3) DIN 53171 : Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverhaltens

(4) ISO 918:1983 : 산업용 휘발성 액체 유기물질에 관한 증류 특성 측정법

(5) JIS K 00-66 : 화학제품의 증류 시험법

3. 시차열 분석기/시차주사 열량기(DTA/DSC)

(1) ASTM E 472-86 : 열분석 데이터 보고를 위한 표준 시험법

(2) ASTM E 473-85 : 열분석과 관련된 항목의 표준 정의

(3) ASTM E 573-76 : DTA 법에 의한 화학물질 열안정성 평가 표준 시험법

(4) DIN 51005 : Thermische Analyse(TA)

제 4 항  증기압 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 열역학적 평형에 있어서 온도의 변화에 따라 크게 영향을 받는 순수한 물질의 증기압을 측정함에 있는데, 10-4부터 105 Pa까지의 광범위한 범위의 압력을 한 가지 방법으로 측정할 수는 없다. 그러한 이유로, 현재 7가지 방법의 증기압 측정법이 제시되어 있으며 이들 방법의 적용법, 반복성, 재현성, 그리고 측정범위 등의 상세 내역이 표1에 정리되어 있다. 증기압은 계산을 통해 산출이 가능하고 그 방법은 본 지침에 수록된 주 1에 제시되어 있다. 10 Pa 이상의 증기압에 대한 측정은 계산에 따른다. 기초 원리는 주 2, 3에 잘 설명되어 있다.

2. 정의

물질에 대한 증기압은 고체나 액체물질의 포화압력으로 정의한다. 압력의 SI 단위로는 Pa(Pascal)를 사용한다. 단위 전환은 다음과 같다.

1 Torr=1 mmHg=1.333×102 Pa

1 atm=1.013×105 Pa

1 bar=105 Pa

온도의 SI 단위는 켈빈온도(K)이다. 이 온도를 섭씨온도로 전환하는 식은 다음과 같다. 여기서 T는 켈빈온도 또는 열역학 온도이고 t는 섭씨온도이다.

T = t + 273.15

표 1

측정법	물질들		반복성	재현성	권장범위
	고체	액체
동적방법(Dynamic method)	저융점	가능	25 %까지 1～5 %까지	25 %까지 1~5 %까지	103 Pa부터 2×103 Pa까지 2×103 Pa부터 105 Pa까지
정적방법(Static method)	가능	가능	5～10 %까지	5～10 %까지	10 Pa부터 105 Pa까지
Isoteniscope 법	가능	가능	5～10 %까지	5～10 %까지	102 Pa부터 105 Pa까지
분출방법 (Effusion method vap. pres. balance)	가능	가능	5～20 %까지	50 %까지	10-3 Pa부터 1 Pa까지
분출방법 질량감소 (Effusion method weight loss)	가능	가능	10～30 %까지	-	10-3 Pa부터 1 Pa까지
가스포화방법(Gas saturation method)	가능	가능	10～30 %까지	50 %까지	10-5 Pa부터 103 Pa까지
회전자방법(Spinning rotor method)	가능	가능	10～20 %까지	-	10-4 Pa부터 0.5 Pa까지

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

2. 시험 원리

일반적으로 증기압은 다양한 온도에 의해서 결정된다. 온도의 범위 내에서 순수한 물질의 증기압 로그 수치는 Clapeyron-Clausius 식에 따르는 열역학 온도와 반비례하는 일차 함수(linear function)이다.

Log p = [eqn: { △Hv} over {2.3R․T }]+상수(constant)

여기에서, p는 증기압(Pa)

△Hv는 증발열(J/mol)

R은 보편 기체 상수(8.314 J/molK)

T는 온도(K)

을 나타낸다.

3. 시험 방법

3.1. 동적 시험법(Dynamic method) : 코트렐 시험법(Cottrell's method)

3.1.1. 원리

증기압은 대략 103~105 Pa 사이의 다양한 압력에서 끓는 온도를 측정함으로써 결정한다. 이 방법은 끓는점을 정하는데도 사용되며 600 K까지 사용 가능하다. 액체 컬럼의 정수압 때문에 액체의 끓는 온도는 표면에서 3~4㎝ 아래가 약 0.1 ℃ 정도 더 높게 나타난다. 코트렐 시험법에서 온도계는 액체 표면 위의 증기상 내에 위치시키며 끓는 액체는 연속적으로 온도계의 구면 위로 공급된다. 대기압 하에서 증기와 평형상태인 액체의 얇은 층은 온도계의 구면상을 덮는다. 따라서 온도계는 과열되거나 수압의 영향에 의한 오차 없이 끓는점을 나타낸다.

코트렐에 의해 만들어진 펌프는 그림 1에서 볼 수 있다. 여기서 시험관 A는 끓는 액체를 담고 있다. 백금선 B는 바닥에 위치하여 균일하게 끓을 수 있도록 도와준다. 곁관 C는 응축기로 연결되고 외부 덮개 D는 차가운 응축공기가 온도계 E에 접촉되는 것을 방지한다. 시험관 A 내의 액체가 끓는 온도하면 액체와 기포가 튀어 오르며 펌프 F의 두 개 관을 통해 온도계의 구면 위로 떨어진다.

3.1.2. 장치

코트렐 펌프(주 4)

A : 열전기쌍

B : 진공완충 공간

C : 압력측정기

D : 진공

E : 측정점

F : 가열선(약 150 w)

코트렐 원리에 따르는 정확한 장치는 그림 2를 참조한다. 이것은 낮은 부분에 끓는 구역이 있고 중간 부분은 냉각기를, 그리고 상부에는 방출구와 테두리를 갖는 관으로 구성되어 있다. 코트렐 펌프는 전기선으로 가열되는 끓는 구간 내에 위치한다. 온도는 상부 테두리로 투입된 내열성 온도계나 온도 감지기에 의해 측정된다. 방출구는 압력 균일 시스템 장치와 연결되어 있다. 뒷면으로 진공펌프, 부피측정기 및 그 밖의 압력측정과 균일화를 위한 질소투입장치 등으로 구성된다.

3.1.3. 시험 수순

시료는 끓는 구역 내에 위치한다. 이 시료가 분말이 아닌 고체인 경우에 문제가 될 수 있으나 이런 경우 냉각 자켓을 가열시켜 해결할 수 있다. 장치의 테두리를 잘 밀봉하고 가스는 방출시키도록 한다. 거품을 형성하는 물질은 이 방법을 사용할 수 없다. 가장 낮은 압력에서 설치하고 가열을 시작함과 동시에 온도 감지기를 기록계와 연결한다.

일정한 끓는점이 일정한 압력에서 기록될 때 평형에 도달한 것으로 본다. 주의할 것은 끓는 동안 충격이 가해지는 것을 피해야만 하며 응축은 냉각기에서 일어나도록 한다. 녹는점이 낮은 고체물질들의 증기압을 결정해야 할 때에는 냉각기가 막힐 수 있으므로 주의해야 한다.

평형점을 기록한 후 보다 높은 압력 시험을 실시한다. 105 Pa에 도달할 때까지 이와 같은 방법으로 계속한다(전체적으로 약 5~10 개 정도의 측정점을 둔다). 점검을 할 때에는 평형점이 감소되는 압력에서 반복한다.

3.2. 정적 시험법(Static method)

3.2.1. 원리

정적 시험법(주 5)에서 열역학적 평형의 증기압은 특정 온도에서 결정된다. 이 방법은 10~105 Pa 범위 내에서 다성분 액체와 고체의 물질에 적용하는 것이 적합하며 특히, 1~10 Pa의 범위에 주목하도록 한다.

3.2.2. 장치

장치는 항온조(±0.2 K의 정밀도를 가질 것), 진공관과 연결된 시료 용기, 압력장치와 측정기로 구성된다. 시료 챔버(그림 3a)는 진공관과 연결되는데, 밸브, 시차압력계(적절한 측정유체를 담은 U자 곡선 튜브) 등을 경유한다. 시험물질의 화학적 특성과 압력범위에 의존하긴 하지만 보통 수은, 실리콘, 프탈레이트(phthalates) 등이 시차압력계에 사용된다. 시험물질은 이러한 U자 곡선 내의 유체에 용해되지 않아야 한다. 압력계는 U자 곡선 튜브 대신 사용할 수 있다. 여기에서는 수은이 일반적인 압력에서부터 102 Pa 이하의 범위에서 사용될 수 있는 반면, 실리콘 유체와 프탈레이트는 102 Pa 이하로부터 10 Pa의 압력에서 사용하는 것이 적합하다. 그 밖에도 102 Pa 압력 이하에서 사용할 수 있는 압력계와 10-1 Pa 이하에서 사용할 수 있는 가열성 판막 압력계가 있다. 온도는 시료를 담은 용기의 바깥 벽이나 용기 자체에서 측정한다.

3.2.3. 시험 수순

그림 3a에 나타난 바와 같이 선택한 액체로 U자 튜브를 채운 장치를 사용한 경우 눈금을 읽기 전에 증가되는 온도에서 가스를 방출시킨다. 시료를 장치 내에 놓고 낮아진 온도에서 가스를 방출시킨다. 다성분 시료의 경우에 물질의 성분이 변화되도록 충분히 온도를 낮추어야 한다. 교반을 통해 보다 빨리 평형에 이르도록 할 수 있으며 시료는 액체 질소나 드라이아이스를 가지고 냉각할 수 있다. 그러나 공기나 펌프 유체와 접촉되지 않도록 주의를 요한다. 시료용기 위의 밸브를 개방하여 수 분 내에 공기를 제거할 수 있고 필요하다면 가스제거 조작을 반복한다.

1. 시료

2. 증기상

3. 고진공 밸브

4. U자 튜브(보조 압력계)

5. 압력계

6. 항온조

7. 온도계

8. 진공펌프

9. 환기/질소

밸브가 닫힌 상태로 가열될 때 증기압이 상승한다. 이것은 U자 튜브 내의 액체의 평형을 변경시키며 이를 보정하기 위해 질소 또는 공기를 장치 내로 유입해 압력차를 0으로 한다. 압력은 압력계, 또는 그 보다 더 정밀한 장치로 읽을 수 있다. 이 압력은 측정온도에서 물질의 증기압과 일치한다. 장치에 대한 모식도는 그림 3b에 나타나 있고 증기압을 직접 읽을 수 있다. 증기압은 원하는 최대온도까지의 범위를 적절히 세부온도 구간으로 나누어 결정한다(전 범위를 5 내지 10 개 정도의 측정점으로 분할).

낮은 온도를 측정할 때에는 반복해서 확인해야 한다. 만일 반복해서 읽은 수치가 증가하는 온도에 대해 얻어진 곡선과 일치하지 않는다면 다음의 상황 중의 하나에 원인이 있다고 판단한다.

(1) 시료의 점도가 높은 경우와 같이 공기를 포함하고 있거나 끓는점이 낮은 물질 또는 가열 시 분해되는 물질인 경우

(2) 물질이 조사된 온도 구간 내에서 분해나 중합과 같은 화학적 반응이 발생한 경우

1. 시료

2. 증기상

3. 고진공 밸브

4. 압력 측정계

5. 압력 지시계

6. 항온조

7. 온도계

3.3. Isoteniscope 시험법

3.3.1. 원리

이 시험법(주 7)은 정적 시험법의 원리에 기초한다. 일정 온도가 유지되는 둥근 구형 용기 속에 시료를 넣고 압력계와 진공펌프를 연결한다. 이렇게 하면 시험물질보다 더욱 휘발성이 높은 불순물들이 감압 하에서 탈가스화 공정을 거침에 의해 제거된다. 선택된 온도에서 시료의 증기압은 압력이 알려진 비활성가스에 의해 균형화된다. 원칙적으로 Isoteniscope은 액체 유기물의 증기압을 측정하도록 개발되었으나 고체물질에 대한 시험에도 적용할 수 있다. 그러나 이 방법이 다성분 체계의 물질에 항상 적합한 것은 아니다. 비휘발성 불순물을 포함한 시료를 분석하게 되면 결과에서 미세한 오차가 발생할 수 있다. 권장되는 측정 범위는 102~105 Pa 이다.

3.3.2. 장치

장치는 그림 4에 나타내었고 상세도는 ASTM D 2879-86(6)에서 볼 수 있다.

3.3.3. 시험 수순

액체의 경우 그 물질 자체가 압력계에서 유체로 취급된다. 우선 용기의 구형을 채우기에 충분할 정도의 시료 액체를 isoteniscope 내에 투입한다. 그 후 isoteniscope 내부를 진공상태로 만든 후 질소를 충전시킨다. 진공화 작업은 잔류산소가 완전히 제거될 때까지 2 회 반복실시하며 시료가 시료구와 압력계 내의 얇은 층 속에 퍼져나가도록 수평을 유지한다. 시스템의 압력은 133 Pa까지 감압시키고 아직 용해되지 않은 가스가 제거되도록 끓을 때까지 서서히 가온시킨다. 압력을 133 Pa로 유지하고 완화된 시료 증기가 구의 상부로부터 그리고 압력계 속의 가지관으로부터 시료의 일부분을 치환시키기에 충분하도록 팽창할 때까지 시료구의 배출구를 작은 불꽃으로 가열한다. 이 때 isoteniscope는 항온조 속에 위치시키며 질소압력은 시료의 압력과 평형이 되도록 조절한다. 이 평형에서 질소의 압력은 물질의 증기압과 같다.

고체물질의 경우 압력, 온도 범위에 의존하는데 압력계 액체로는 실리콘 유체나 프탈레이트가 사용된다. 탈가스 압력계 액체는 isoteniscope의 긴 가지관 위에 있는 볼록한 부위로 투입된다. 시험 고체물질은 시료구 내에 놓이고 온도가 가열되면 탈가스화 된다. 이후 기울어지면서 압력계의 액체가 U자 튜브 내로 흘러들 수 있다.

그림 4

A. 압력조절

B. 8 mm OD 튜브

C. 압력 시스템 내의 건조질소

D. 시료증기

E. 말단부위

F. 액체 시료

3.4. 방출방법 : 증기압 균형(주 7 참조)

3.4.1. 원리

시험 물질의 시료는 작은 용해로 내에서 가열되며 둥근 형태의 덮개로 덮는다. 용해로는 직경이 알려져 있는 작은 구멍이 나 있는 뚜껑으로 덮는다. 시료 증기는 한 구멍으로 분출되어 고감도 저울로 이송되는데 여기도 덮개로 밀폐되어 있다. 증기의 응축을 막기 위해서 저울 팬이 냉각기로 둘러싸여 있게 설계하기도 하고, 열전도로 외부 열을 방출하도록 설계하기도 하며 방열기로 냉각하도록 설계하기도 한다. 분출되는 증기의 힘은 저울에서의 힘으로 나타난다. 증기압은 두 가지 방법으로 유도되는데 천칭 팬으로부터 직접 읽는 방법과 다음의 Hertz-knudsen 식을 사용한 증발 비율로부터 얻을 수 있다.

p=[eqn: G( { 2πRT×10 ^{ 3} } over {M })^1/2]

여기에서, G는 증발비율(kg/s㎡)

M은 몰질량(g/mol)

T는 온도(K)

R은 보편 기체상수(J/mol․K)

p는 증기압(Pa)

를 나타내며, 이 때 권장되는 p값의 범위는 10-3~1 Pa 이다.

3.4.2. 장치

장치에 대한 일반적인 원리는 그림 5에 나타나 있다.

그림 5

A. 밑판 B. 이동성 코일 장치 C. 둥근 덮개 D. Scalepan J. Shield 저울 E. 진공 측정기기	F. 냉각박스 및 응축관 G. 증발로 H. 액체질소를 지닌 보온 플라스크(dewar flask) J. 받침대

3.5. 방출방법(Effusion method) : 질량감소(loss of weight)

3.5.1. 원리

이 방법은 자외선-진공(ultra-vacuum) 조건 하에서 마이크로오리피스(micro-orifice)를 통과한 증기 형태인 kundsen 셀의 시간단위 당 방출 시료 질량 측정에 기초한다. 방출되는 증기의 질량은 셀 질량감소 측정이나 낮은 온도에서의 증기응축에 의해 얻어지며 휘발성 물질의 양은 크로마토그래피를 사용하여 측정한다. 증기압은 장치의 변수요인에 따라 보정인자를 갖는 Hertz-Knudsen 관계식 적용에 의해 계산되며 권장되는 범위는 10-3~1 Pa 까지다.

3.5.2. 장치

장치의 일반적인 원리는 그림 6에 나타나있다.

그림 6

1. 진공기와 연결

2. 백금 열 저항 온도계를 위한 구멍

3. 진공탱크를 위한 뚜껑

4. O자 링

5. 알루미늄 진공탱크

6. 분출 셀을 옮기고 설치하는 장치

7. 안전덮개

8. 버터플라이너트

9. 볼트

10. 스테인레스 분출 셀

11. 가열기

3.6. 가스포화방법(Gas saturation method)

3.6.1. 원리

일반적인 실온 및 유속이 알려진 환경에서 비활성 가스를 시료물질 위 또는 내부를 천천히 통과시켜 충분히 포화되도록 한다. 가스 상에서 포화상태에 도달하는 것은 매우 중요하다. 이 과정이 잘 진행되어야 전달되는 물질이 검출되고 그 양이 계산된다. 증기의 검출과 연속적 분석의 선택은 마치 가스크로마토그래피가 전달되는 물질의 질량결정에 사용되는 것과 같다. 증기압 계산은 이상기체 법칙에 따르고 혼합가스의 전체 압력은 구성가스의 부분 압력들의 합과 일치한다는 가정 하에 계산한다. 증기압처럼 시험물질의 부분 압력은 알려진 가스의 전체 부피와 이송된 물질의 무게로부터 계산한다.

가스의 포화진행은 고체나 액체 화학물질에도 적용된다. 이것은 10-5 Pa 이하의 증기압까지 사용 가능하다. 이 방법은 103 Pa 아래의 증기압에 적용되었을 경우 신뢰성이 있으며 103 Pa 이상에서는 일반적으로 과대평가되는 경향이 있는데, 이것은 아마도 에어로졸의 형성이 원인이 될 것으로 추정된다. 증기압의 측정은 실온에서 이루어지므로 고온에서 얻어진 수치를 외삽할 필요가 없다. 고온에서 얻어진 수치를 가지고 외삽을 하게 되면 이따금씩 오차가 생길 수 있으므로 피하는 편이 좋다.

3.6.2. 장치

시험의 진행은 항온실에서 실시한다. 그림 7에서 나타나 있는 것처럼 시험 장치는 3 개의 고체, 액체시료 홀더를 갖추고 분석이 가능한 항온실이 존재한다. 이 때, 내부온도의 편차는 ±0.5 ℃ 정도로 조절된다. 비활성 운반가스로서는 일반적으로 질소가 사용되지만 가끔씩은 다른 가스를 사용하기도 하는데(주 8), 운반가스는 건조된 상태여야 한다. 가스는 6개의 흐름 구멍으로 분리되며 니들 밸브로 조절된다. 3.8 ㎜의 구리 관경을 통해 항온조 내로 흘러 들어오며 온도 평형 이후에 가스는 시료와 흡착판(sorbent trap)을 통과한다.

그림 7

고체시료는 유리섬유로 막힌 내경 5 ㎜ 유리관 속에 그림 8과 같이 충진된다. 그림 9는 액체시료 홀더와 흡착 시스템을 나타낸다. 액체 증기압 측정을 위한 가장 재현성이 좋은 방법은 유리구슬 위에 액체를 도포하고 이 구슬 홀더로 충진하는 것이다. 운반 가스는 틈이 성긴 유리구슬 사이를 통과하고 액체시료 칼럼을 통과하도록 한다.

흡착시스템의 구조는 앞, 뒤에 흡착제를 포함한 구간을 갖고 있다. 매우 낮은 증기압에서는 아주 작은 양이 흡수제와 유리섬유 상에서의 흡착에 의해 남겨지게 되며 시료와 흡수제 간의 유리관은 심각한 문제가 될 수 있다. 고체화된 CO2로 냉각된 트랩은 증기화된 물질을 수집하는데 있어 또 하나의 효율적 방법이고 포화 칼럼 상에서 어떠한 후압(back pressure)도 일으키지 않으며 트랩물질을 정량적으로 제거하기 쉽다.

그림 8

그림 9

3.6.3. 시험 수순

유출되는 운반가스의 유속은 실온에서 측정하며 전체 운반가스 부피를 정확히 알기 위해 시험 중 수시로 확인한다. 이 때, 유량계를 갖추고 연속적으로 검사하는 장치를 주로 사용한다. 가스상이 포화되려면 접촉시간이 상당히 요구되므로 낮은 흐름 상태로 가스를 흘려보내야 한다(주 9).

시험이 끝난 후에 흡수구간의 앞, 뒤를 분리하여 분석한다. 각 구간 내의 화합물은 용매를 가하여 탈착한다. 흡수된 무게를 측정하는 것으로 분석하며 흡수 또는 분리용매의 선택에서처럼 분석방법의 선택 또한 시료의 특성에 따른다. 탈착효율은 흡수제 상에 주입된 알려진 시료의 양과 탈착된 양 그리고 분석된 회수량에 의해 결정된다. 시험조건 하에서 시료의 농도나 그 근처에서 탈착효율을 확인한다는 것은 매우 중요하다. 운반가스가 시료물질로 포화되었는지를 알기 위해 세 가지의 서로 다른 가스유량흐름속도(different gas flow rates)을 사용한다. 만일 계산된 증기압이 흐름속도에 의존성이 없다면 가스는 포화되었다고 추정한다. 증기압은 다음 식으로 계산한다.

p=(W/V)×(RT/M)

여기에서, p는 증기압(Pa)

W는 증발된 시료량(g)

V는 포화가스의 부피(㎥)

R은 기체상수 8.314(J/mol․K)

T는 온도(K)

M은 시료의 몰 질량(g/mol)

를 나타내며, 측정된 부피는 유량계와 포화기 간의 압력과 온도 차에 대한 보정이 되어야 한다.

3.7. 회전자(Spinning rotor)

3.7.1. 원리

이 방법은 회전자 점도기를 사용하는 것으로서, 자장을 지닌 소강구(small steel ball)를 이용하는데 이것은 회전장(rotating field)에 의해 회전하도록 만들어져 있다. 볼이 주어진 회전속도에 도달하면(초당 약 400 회 정도)  힘이 중단되고 가스 마찰이 생겨 감속이 발생한다. 감속은 시간의 함수로 측정되고 증기압은 강구의 압력의존성 감속기(pressure-dependent slow-down)으로부터 유도된다. 권장되는 측정범위는 10-4~0.5 Pa까지이다.

3.7.2. 장치

시험장치의 모식도를 그림 10에 나타내었다. 측정기의 상단부분은 항온 밀폐실내에 위치하며 온도는 0.1 ℃ 이내로 유지한다. 시료 용기는 온도 차가 0.1 ℃ 이내인 분리된 밀폐 실내에 위치한다. 장치의 모든 부위는 응축을 막기 위한 고온에서 견뎌야 하고 고진공 장치와 연결하도록 한다.

그림 10

A. 회전자 센서

B. 시료셀

C. 열조절장치

D. 진공관(터보 펌프)

E. 공기 열조절장치

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

증기압은 증기압 곡선을 확인하기 위해서 적어도 2 개의 온도에서 결정하여야 한다. 세 개나 그 이상을 측정하고자 하는 경우에는 0~50 ℃ 범위에서 시험을 수행한다.

2. 시험 보고서

시험 보고서에는 다음의 내용을 수록하여야 한다.

(1) 사용된 시험법

(2) 물질의 정확한 사양(불순물, 순도)

(3) 2 개 이상의 증기압 수치 및 온도수치, (가급적 0~50 ℃ 범위 내)

(4) 모든 시험 기초 자료

(5) log P 대 1/T 곡선

(6) 20 ℃, 25 ℃에서의 증기압 예상치

만일, 상태변화나 분해 등과 같은 변화가 관찰되면 아래와 같은 정보들을 기록하여야 한다.

(a) 발생한 변화의 성질

(b) 대기압 하에서 변화가 발생한 때의 온도

(c) 전이온도 이하 10 ℃, 20 ℃에서의 증기압 및 전이온도 이상 10 ℃, 20 ℃에서의 증기압(고체에서 기체로 전이된다면 해당사항 없음)

그 밖에 불순물을 기록한 것이나 물리적 상태 등과 같이 결과를 해석함에 있어 영향을 줄 수 있는 모든 정보들을 보고서에 수록하도록 한다.

* 주 1 : 측정방법

1. 개요

증기압 계산은 다음과 같을 경우 사용한다.

(1) 시험값이 적절한지 결정하기 위해

(2) 시험방법을 기술적 이유(10-3 Pa 이하처럼 증기압이 매우 낮을 경우)로 적용할 수 없는 경우에 한계 수치나 추정치를 제공하기 위해

2. 측정법

액체나 고체의 증기압은 변형된 Watson 관계식 사용으로 계산이 가능하다. 이 때, 요구되는 유일한 시험 데이터는 일반적인 끓는점이다. 이것은 10-5~105 Pa 압력범위에서 적용된다.

3. 계산

[eqn: ln Pvp= { △Hvb} over {△Zb․R․Tb }[1- { (3-2 { T} over {Tb })^m } over { { T} over {Tb } }-2m(3-2 { T} over {Tb })^m-1 ․ln { T} over {Tb }]]

여기에서, T : 온도

[eqn: T_{ b}] : 일반 끓는점

Pvp : 온도 T에서의 증기압

zb : 압축계수(0.97가정)

Tb : 끓는점

△Hvb : 증발열

m : 주요 온도 상에서 물리적 상태와 관련된 시험적 요소

를 나타내며, 위의 식은 더 나아가

[eqn: { Hvb} over {Tb }=KF(8075+R․lnTb)]

여기서 KF는 물질의 극성을 고려한 시험요인이다. 몇몇 화합물 형태를 위해서 KF 요소는 (b)에 나타나 있다. 가끔씩 감압에서 주어진 끓는점 데이터가 유용하게 사용되는데, 이럴 경우 증기압은 다음의 식으로 나타낸다.

[eqn: lnPvp=lnP _{1} + {△H _{vl}} over {△Z _{b} RT _{1}} [1-(3-2 {T} over {T _{1}} ) ^{m} {T} over {T _{1}} -2m(3-2 {T} over {T _{1}} ) ^{m-1} ln{T}over{T_{1}}]]

여기에서 T1은 감압 P1에서의 끓는점을 말한다.

* 주 2 : Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol.II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London

* 주 3 : Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York

* 주 4 : Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York

* 주 5 : NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10-1 to 105 Pa - Static method.

* 주 6 : ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure - temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

* 주 7 : NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.

* 주 8 : Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.

* 주 9 : Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.

제 5 항  물에 대한 용해도 시험

I. 개론

본 시험법은 비휘발성이면서 물에서 안정한 순수물질의 용해도를 측정함을 목적으로 규정되었으며, 본 시험을 수행하기에 앞서 구조식, 증기압, 해리상수 및 pH 가수분해 등과 같은 기본 정보를 수집해 둘 것을 권장하는 바이다.

본 시험법에서는 컬럼용리법(column elution method)과 10-2 g/ℓ 이상, 10-2 g/ℓ 이하의 각각의 용해도 영역에서 수행하는 플라스크 시험법의 2 가지 시험법에 대하여 기술하였으며 간단한 약식 예비시험에 대해서도 기술하였다. 최종시험에서 사용될 샘플의 적당한 양을 비롯해서 포화되기까지 필요한 시간은 대략적으로 계산해도 무방하다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다.

2. 시험 조건

시험은 20±0.5 ℃에서 시행한다. 온도가 설정되면 시험과 관련이 있는 모든 기기의 온도가 일정하게 유지되어야 한다.

3. 예비시험

실온에서 유리 마개가 있는 10 ㎖ 측정 실린더 내에 시료를 약 0.1 g 정도 넣고 물을 더한다(이 때, 시료가 고체물질이라면 잘게 분쇄한다). 각각 알맞은 양의 물을 가한 후 10 분 동안 진탕하고 용해되지 않은 부분이 있는지 확인한다. 만약 물 10 ㎖를 첨가한 후에도 아직 녹지 않은 시료가 남아 있으면 100 ㎖ 측정 실린더에서 실험을 계속한다. 이 때 참고할 만한 자료로서, 대략적인 용해도에 대한 내용이 표 1에 주어져 있다. 용해도가 낮은 물질의 경우 용해시키는데 오랜 시간이 걸릴 수 있으며, 최소 24 시간 이상이 소요되는 경우도 있다. 만약 24 시간이 지나도 물질이 녹지 않으면, 96 시간까지 기다리든지 컬럼용리법이나 플라스크 법과 같은 더 전문적인 용해법을 사용할 것인지를 결정하는 것이 좋다.

표 1

0.1g 용해에 필요한 물의 양 (㎖)	0.1	0.5	1	2	10	100	100 이상
대략적인 용해도 (g/ℓ)	1,000 이상	1,000~200	200~100	100~50	50~10	10~1	1 이하

4. 컬럼용리법(column elution method)

4.1. 시험법의 원리

이 방법은 과량의 시험물질로 미리 코팅해 놓은 비활성 지지체로 충진된 마이크로 컬럼으로부터 물과 함께 시험물질을 용리시키는 용리법을 기반으로 한다(주 1). 물에 대한 용해도는 시간의 함수로서 평탄역(plateau)에 도달하였을 경우 용리액의 질량 농도로 주어진다.

4.2. 장치

4.2.1. 시험장치는 일정한 온도로 유지되는 마이크로 컬럼(그림 1)으로 구성되어 있다. 이 마이크로 컬럼은 재순환 펌프(recirculating pump, 그림 2)나 액위조(levelling vessel, 그림 3)와 연결되어 있다. 마이크로 컬럼에는 작은 유리섬유 마개에 의해 고정되어 있는 비활성 지지물이 함유되어 있는데, 배출되는 입자들을 걸러주는 역할도 한다.

4.2.2. 그림 1에 표시된 마이크로 컬럼은 재순환 펌프와 같이 설치하기에 적합하게 제작되어 있다. 마이크로 컬럼 상부에는 시험이 시작될 때 버려지는 5 충전 부피(bed volume)가 들어가고 실험 중 분석을 위해 회수되는 샘플이 5 부피만큼 들어갈 공간이 있다. 불순물과 함께 5 충전 부피를 제거하는 실험을 수행하는 동안 물을 가할 수 있다면 그 공간이 줄어들 수 있다.

4.2.3. 컬럼은 약 25 ㎖/h 만큼 운반할 수 있는 용량의 재순환 펌프로 들어가는 비활성물질로 만들어진 튜브와 연결되어 있다. 예를 들면, 재순환 펌프는 연동 펌프이거나 멤브레인 펌프일 수 있는 것이다. 기기를 다룰 때에는 오염이 없어야 하며 튜브와 흡착되는 일이 없도록 주의해야 한다.

4.2.4. 액위조를 사용한 모형도는 그림 3을 참조한다. 여기서의 마이크로 컬럼은 단방향 마개로 되어 있다. 액위조까지는 유리관 이음과 비활성 물질로 된 튜브로 연결되어 있으며 액위조로부터의 유량은 약 25 ㎖/h가 되어야 한다.

그림 1 마이크로 컬럼

A. 유리관 연결부위

B. 상부 공간

C. 내부 5 ㎜

D. 외부 19 ㎜

E. 유리섬유 마개

F. 조절장치

그림 2 재순환 펌프

A. 대기압 평형관

B. 유량계

C. 마이크로컬럼

D. 열조절 순환펌프

E. 재순환 펌프

F. 두 방향 시료 밸브

그림 3 액위조

A. 액위조(예. 2.5 ℓ 플라스크)

B. 컬럼

C. 분할 축적계(fraction accumulator)

D. 열조절 장치

E. 테프론 튜브

F. 유리관

G. 물 흐름관(열조절 장치와 컬럼 간,

내부직경 약 8 ㎜)

4.3. 지지체 부하(loading of the support)

약 600 mg의 지지물질을 50 ㎖ 둥근 바닥 플라스크로 옮긴다. 시료의 적당한 양이 휘발성 용매(분석시약용 등급)에 용해되고, 이 용액의 적절한 양이 지지물질에 첨가된다. 용매는 로터리 증발기 등을 사용하여 완전히 증발시키는데, 용매가 완전히 증발되지 않으면 표면이 분할되기 때문에 용리단계에서 지지물질의 물 포화가 이루어지지 않는다. 충진된 지지물질을 2 시간 동안 약 5 ㎖의 물에 담구어 두면 부유물질들이 마이크로 컬럼으로 들어간다. 한편, 건조된 충진 지지물질들이 물이 차있는 마이크로 컬럼으로 들어갈 수 있으며 평형에 이르기 위해서 필요한 시간은 2 시간이다.

시험물질이 기름에 침전되어 있는 상태와 같은 경우에는 지지물질이 첨가되면 문제가 발생할 수 있는데, 이로 인해 잘못된 결과가 산출될 수 있다. 이런 문제들에 대해서는 충분히 조사되어야 하며 자세히 보고되어야 한다.

4.4. 재순환 펌프 사용에 따른 진행

컬럼을 통해서 흐름이 시작된다. 이 때, 유속은 약 25 ㎖/h 정도가 되는 것이 좋은데, 25 ㎖/h의 유속이 의미하는 바는 기록되어 사용되고 있는 컬럼에 대해서 한 시간 당 10 충전 부피인 것과 일치한다. 흐름이 시작되면 수용성 불순물을 제거하기 위하여 최소 5 단위 이상의 충전 부피를 버린다. 그 다음, 펌프가 평형이 될 때까지 작동되면, 임의로 선정했을 때에도 각각의 농도 차이가 ±30 % 이상 나지 않는 5 개의 시료들이 흐르게 된다. 이 시료들은 최소 10 충진 부피가 통과할 정도의 시간차에 의해 각각 분리되어야 한다. 사용된 분석 방법에 따라 평형 도달 확인을 위한 농도/시간 곡선을 그리는 것이 유용할 수 있다.

4.5. 액위계를 사용한 진행

연속적으로 용리된 분절(fraction)들은 이를 분석하기 위해 사전에 선택된 시험법에 따라서 수집되고 분석되어야 한다. 적어도 5 개의 연속적인 분절에서 ±30 % 내로 농도가 일정한 중간 용리 범위에서 용리된 분절들은 용해도를 측정하기 위해 사용된다.

4.6. 공통 적용 사항

용리제(eluent)로 많이 사용되는 것은 2 차 증류수이다. 또한 10 ㏁/㎝ 이상의 저항도를 가진 탈이온수와 총 유기 화합물이 0.01 % 이하인 물도 용리제로써 사용된다.

두 과정 모두, 두 번째 시험은 첫 번째 시험 유량의 반에서 수행한다. 두 번째 시험 결과도 양호하다면 시험이 성공한 것이다. 낮은 유량에서 측정된 용해도가 더 높다면 연속적으로 두 번 동작시켰을 때 같은 용해도가 나타날 때까지 그 유량의 반을 유지해야 한다. 또한 분절들에서 콜로이드가 존재하는 지를 틴들(Tyndall) 효과 검사법으로 검사해야 한다. 입자들이 존재하면 시험이 부정확하게 되므로 그런 입자들이 있을 경우 컬럼을 걸러준 다음 시험을 수행해야 한다. 그리고 각 시료의 pH가 측정되어 있어야 하는데, 이 때 특정한 지시계를 사용하여 측정하는 것이 좋다.

5. 플라스크 방법(flask method)

5.1. 원리

대상 물질(고체는 분쇄해야 함)은 시험온도보다 다소 높은 온도에서 물에 용해시킨다. 혼합물이 포화되면 이를 냉각하여 시험온도를 유지한다. 적절한 샘플링을 통해 평형이 된 것이 확인된다면 그 시험온도에서 바로 측정할 수 있다. 그 후, 완전히 녹은 것으로 확인된 액상 용액 속의 대상물질의 질량농도를 적절한 분석법으로 측정한다(주 2).

5.2. 장치

시험을 수행하기 위해서는 다음과 같은 장치들이 필요하다.

(1) 일반적인 초자류 및 장비

(2) 일정 온도 유지기능이 있는 교반장치

(3) 원심분리기(에멀젼을 취급할 경우, 온도조절기능이 있으면 더욱 좋다)

(4) 분석 장비

5.3. 시험 수순

시험물질을 포화시키는데 필요한 물의 양은 예비시험으로 측정한다.  그 양의 다섯 배 가량을 칭량하여 유리 마개가 달린 유리병(원심분리튜브, 플라스크 등) 세 개에 각각 담아 놓는다. 유리병의 마개를 꽉 막은 다음 30 ℃에서 교반한다. 항온수조 안에 설치한 자석 교반기(magnetic stirrer) 등과 같이 일정 온도 유지 기능이 있는 교반 장치를 사용한다. 하루가 지난 후 하나의 유리병을 가끔씩 흔들어주어 시험온도에서 24 시간 동안 평형에 이르게 한다. 그러면 유리병의 내용물이 원심분리되는데, 투명한 액상에 존재하는 시험물질의 농도를 적절한 분석법으로 측정하면 된다. 다른 플라스크 2 개도 이와 유사한 방법으로 처리하되, 하나는 2 일 동안, 다른 하나는 3 일 동안 30 ℃에서 평형을 맞춘 다음 처리한다. 만약 마지막에 측정한 유리병 두 개에서의 농도가 15 % 이상 차이가 나지 않으면 만족할 만한 시험을 수행한 것이다. 그런데 유리병 1, 2, 3에 대한 결과가 증가하는 경향을 보인다면 평형에 이르는 시간을 더 늘려 시험 전체를 다시 해야 한다.

시험을 수행할 때 30 ℃에서 미리 인큐베이션하지 않아도 된다. 포화 평형 비율을 평가하기 위해서는 농도를 측정하는 데 있어 영향이 없을 만큼만 교반 시간을 설정해야 한다. 그리고 각 시료의 pH가 측정되어 있어야 하는데, 이 때 특정한 지시계를 사용하여 측정하는 것이 좋다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

1.1. 컬럼용리법

각 시험별로 포화상태에서 최소 5 개 이상의 연속적인 시료의 평균값과 표준편차를 계산해야 한다. 서로 다른 유량으로 수행된 두 개의 시험에서 얻어진 평균치의 차이가 30 % 이상 나서는 안 된다.

1.2. 플라스크 방법

15 % 이상의 차이를 보이지 않는 3개 플라스크에서 얻은 각각의 결과를 평균한다.

2. 시험보고서

2.1. 컬럼 용리 방법

시험 보고서에는 다음과 같은 정보를 수록해야 한다.

(1) 예비시험 결과

(2) 시험물질의 화학적 특성(chemical identity) 및 불순물

(3) 각 시료의 농도, 유량 및 pH

(4) 각 과정의 포화된 최소 5 개 시료의 평균, 편차

(5) 최소 2 개 이상의 연속적인 과정에서 산출된 평균

(6) 포화과정 중의 물의 온도

(7) 분석 방법

(8) 지지물질의 성질

(9) 지지물질의 충진에 대한 정보

(10) 사용된 용매

(11) 시험 중 시험물질의 화학적 불안정성에 대한 근거

(12) 결과 해석과 관련된 모든 정보(특히 불순물 및 시험물질의 물리적 상태와 관련된 정보)

2.2. 플라스크 방법

시험 보고서에는 다음과 같은 정보가 수록되어 있어야 한다.

(1) 예비시험 결과

(2) 시험물질의 화학적 특성 및 불순물

(3) 시험 별로 결정된 분석방법 및 플라스크 별로 측정된 하나 이상의 값에 대한 평균

(4) 각 시료의 pH

(5) 플라스크 별로 산출된 평균치

(6) 시험온도

(7) 분석방법

(8) 시험 중 시험물질의 화학적 불안정성에 대한 근거

(9) 결과 해석과 관련된 모든 정보(특히 불순물 및 시험물질의 물리적 상태와 관련된 정보)

* 주 1 : NF T 20-045(AFNOR)(September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.

* 주 2 : NF T 20-046(AFNOR)(September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.

제 6 항  회분식 평형법에 의한 흡탈착 측정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험지침은 토양에 대한 화학물질의 흡탈착 거동의 산정을 목적으로 한다. 따라서 이의 목적은 다양한 환경조건 하에서의 분배성(분포성)을 예측할 수 있는 수착작용의 범위값을 확보하는 것이다(수착=흡착+흡수). 이를 위해, 여러 가지 토양에 대한 화학물질의 평형흡착계수를 토양성상(유기탄소함량, 점토함량, 토양조직, pH 등)의 함수로서 산정한다. 다양한 형상의 토양을 이용하여, 가능하면 폭넓게 그 화학물질과 당해 토양의 상호작용을 모색한다.

본 시험지침에서의 흡착이란 화학물질이 토양의 표면에 부착되게 되는 과정을 의미한다. 여기서의 흡착에서는 흡착의 종류(물리적 흡착과 화학적 흡착)까지는 구별하지 않고, 표면촉매분해, 물리화학적 흡착, 화학적 흡착도 구별하지 않는다. 또한 직경 0.2 ㎛ 이하의 콜로이드 토양입자 상에서 발생되는 흡착작용도 충분하게 구분하지 않는다.

흡착에서 가장 중요하다고 인정되는 토양 파라미터는 유기탄소함량(주 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12), 점토함량과 토양조직(주 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13) 및 이온성 화합물의 pH(주 1, 2, 13) 등이다. 특정 화학물질의 흡탈착에 영향 미치는 여타의 토양 파라미터로서는 특정의 토양(특히 화산 토양이나 적도 토양)에 대한 유효양이온교환능(ECEC), 무정형의 철 및 알루미늄 산화물의 함량이다(주 2, 14).

본 시험은 다양한 유기탄소함량·점토함량·토양조직을 갖는 여러 가지 형상의 토양에 대한 화학물질의 흡착성을 산정하는 것이다. 본 시험은 다음의 3 단계로 구성된다.

제 1 단계 : 다음의 사항을 산정하기 위한 예비 조사

1) 토양/용액의 비율

2) 흡착평형시간 및 평형상태에서 흡착되는 시험물질의 양

3) 시험용기의 표면에 대한 시험물질의 흡착성 및 시험기간 중의 시험물질의 안정성

제 2 단계 : 스크리닝 시험

흡착작용은 다섯 가지의 각기 다른 토양의 형상에 대해 시험물질의 단일한 농도에서 흡착속도론적으로 연구, 조사하여 분배계수 Kd와 Koc를 산정하는 것이다.

제 3 단계 : Freundlich 흡착등온선을 산정하여 시험물질의 토양 흡착성에 대한 농도의 영향을 모색하는 것이다. 이에 대해, 탈착속도론/Freundlich 탈착등온선으로서 탈착현상도 조사한다(주 15 참조).

흡탈착 연구·조사는 지구적 생물계의 토양·물·대기 내에서 화학물질의 이동성과 분포성에 대한 실제적인 정보를 찾아내는데 유용한 수단이 되고 있다(주 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22). 이러한 조사결과를 이용하여 화학물질의 분해작용(주 23, 24), 유기체에 의한 변환 및 섭취작용(주 25), 토양을 통한 침출작용(주 17, 19, 20, 22, 26, 27, 28, 29), 토양으로부터의 휘발작용(주 22, 30, 31), 지표면을 통한 자연 수역으로의 유달작용(주 19, 32, 33)을 예측하거나 산정할 수 있다. 흡착자료를 이용하여 비교조사나 모사연구도 할 수 있다(주 20, 34, 35, 36).

토양과 수역 사이의 화학물질의 분배작용은 다양한 인자가 관여하는 복합적인 과정으로서 당해 시험물질의 화학적 특성(주 3, 37, 38, 39, 40, 41), 토양의 성상(주 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13), 강우, 기온, 태양, 바람 등의 기후인자 등이 이에 관여하는 인자이다. 그러므로 토양의 화학물질 흡착에 관여하는 과정의 현상과 메커니즘은 현재의 가이드라인과 같은 실험실적 단순화 모델로서는 완전하게 정의하지 못한다. 이와 같은 방법이 환경적으로 가능한 모든 경우를 대변하지는 못하지만, 화학물질 흡착의 환경적 연관성에 대한 가치 있는 정보는 제공해 줄 수 있다.

흡착-탈착 시험을 실시하기 전에, 시험물질에 대한 다음의 정보를 확보해야 한다.

(1) 물에 대한 용해도(제 05 항)

(2) 증기압(제 04 항) 및 Henry의 법칙 상수

(3) pH의 함수로서의 무생물적 분해성(제 11 항)

(4) n-옥탄올/물 분배계수(제 07, 17 항)

(5) 생분해성(생물적 분해성)의 용이성(OECD 가이드라인 301), 토양 내에서의 호기적, 혐기적 변환

(6) 이온성 화학물질의 pKa값

(7) 물 속에서의 직접적 광화학 분해(물 속에서의 UV-VIS 흡수 스펙트럼 및 양자 수지)와 토양에서의 광분해성

2. 시험의 제한사항

사용되는 시약은 분석시약급 이상이어야 한다. 조성이 알려져 있고 95 % 이상의 순도를 갖는 비표지된 시험물질을 사용하거나, 방사성 순도(radio-purity)를 갖는 방사성 표지 시험물질을 사용해야 한다. 반감기가 짧은 경우에는, 붕괴 보정을 해야 한다.

이 시험은 충분한 정밀도가 확보되는 방법을 분석하는 시험물질에 적용해야 한다. 결과치의 신뢰성에 영향을 미치는 파라미터는 특히 간접법을 적용하는 경우의 시험기간 중 시험물질의 안정성이다. 그러므로 예비 단계의 조사에서는 그 안정성을 점검하는 것이 필수적이다. 만약 시험 기간 중에 어떠한 변화가 발견되면, 주 단계의 조사에서는 토양과 액체상을 모두 분석해야 한다.

이 시험법으로 수용성이 낮은 시험물질(Sw<10-4 g/ℓ)을 시험하거나, 전하 상태가 높은 시험물질을 시험하는 경우에는 여러 가지 어려움이 발생하게 된다. 그 이유는 액체상 내의 시험물질 농도를 충분한 정확도로 측정할 수 없기 때문이다. 이러한 경우에는, 추가적인 단계의 조치를 취해야 한다. 이러한 문제점에 대처할 수 있는 지침은 본 시험지침의 관련 항목에서 제시하기로 한다.

한편, 휘발성 물질을 시험하는 때에는, 휘발에 의한 손실이 발생하지 않도록 주의를 기울여야 한다.

3. 정의

정의에 관한 자세한 사항은 데이터, 보고서 작성부문 및 주 42에서 제시한다.

Ⅱ. 시험

1. 시험원리

0.01 M의 CaCl2(염화칼슘) 농도의 무표지 혹은 방사성 무표지의 시험물질 용액을 일정량으로 하여 0.01 M의 CaCl2 속에서 미리 평형되어 있는 건조중량의 토양시료에 첨가한다. 그 혼합물을 적정한 시간 동안 교반시킨다. 그리고서 토양 현탁액을 윈심분리 시키고, 필요하다면 여과하여 수용상을 분석한다. 토양 시료에 흡착되는 시험물질의 양은 그 용액 내에 시험의 초기에 존재하는 시험물질의 양과 시험(간접법)의 마지막에 잔존하는 양의 차이로 계산한다.

하나의 대안으로서, 흡착되는 시험물질의 양을 토양 분석(직접법)에 의해 직접 측정하기도 한다. 이러한 작업은 적절한 용매에 의한 단계적 토양 추출 작업도 포함하여 분석절차를 아주 번거롭게 하므로, 시험물질의 용해 농도 차이를 정확하게 산정할 수 없는 경우로 치부하기도 한다. 이러한 경우의 사례를 들자면, 시험기간 동안 시험물질이 불안정하고 용액 내의 시험물질 농도가 희박하여 흡착되기 어려운 시험 용기의 표면에 대한 시험물질 흡착의 경우, 흡착이 강하여 정확하게 측정할 수 없을 정도로 시험물질 농도가 낮아지는 경우 등이다. 방사성 표지의 시험물질을 사용한다면, 연소 및 액체 신틸레이션 계수에 의한 토양상을 분석하여 토양 추출을 하지 아니할 수도 있다. 그러나 액체 섬광 계수(liquid scintillation counting)는 시험물질과 그 변환생성물을 구분하지 못하는 비특정적 기법이므로, 시험물질이 시험기간 동안 안정한 경우에 대해서만 적용해야 하는 기법이다.

2. 시험 방법

2.1. 장치 및 시약

표준 시험 장치는 다음과 같다.

2.1.1. 시험을 수행할 수 있는 튜브나 용기

이러한 튜브나 용기는 다음과 같은 두 가지의 이유로 중요성을 가진다. 첫째로는 조작 및 이송 오차를 최소화하기 위해 윈심분리장치 내에 직접 설치해야 한다. 둘째로는 그 표면에 대한 시험물질의 흡착을 최소화시키기 위해 비활성의 재료로 만들어져야 한다.

2.1.2. 교반장치

고가의 교반기 및 이에 상당하는 장치로서, 교반 장치는 교반 동안 토양을 현탁상으로 유지할 수 있어야 한다.

2.1.3. 원심분리

고속 원심분리기이면 좋으며, 원심분리력 3,000 g 이상, 온도제어, 수용액으로부터 직경 0.2 ㎛ 이상의 입자를 제거하는 시스템이면 더욱 좋다. 컨테이너는 교반 및 원심분리 동안에 뚜껑을 덮어 휘발 및 수분 손실을 방지해야 한다. 뚜껑에의 흡착을 최소화하기 위해서는, PTFE(테플론)과 같은 비활성의 재료로 도포한 스크류 캡을 사용해야 한다.

2.1.4. 여과장치(선택사양)

공극 0.2 ㎛의 필터, 멸균 또는 일회용. 필터 재료의 선정 시에는 특히 유의하여 그에 대한 시험물질의 손실을 방지해야 한다. 특히 용해성이 낮은 시험물질에 대해서는 유기성의 필터 재료를 사용해서는 아니 된다.

2.1.5. 시험물질의 농도를 측정할 수 있는 분석장치

2.1.6. 103~110 ℃의 온도를 유지할 수 있는 시험 오븐

2.2. 토양의 특성화 및 선정

2.2.1. 토양은 그 흡착능에 크게 영향 미친다고 여겨지는 파라미터들로 특성화 한다(유기탄소, 점토함량, 토양조직 및 pH). 토양의 물리화학적 특성이 특정한 화학물질의 흡탈착에 영향을 미치기도 하는 것을 고려해야 한다.

2.2.2. 토양을 특성화 하는 방법은 그 결과치에 영향을 미치므로 대단히 중요하다. 그러므로 토양의 pH는 그에 상응하는 ISO규격(ISO 10390-1)에 따라 0.01 M의 CaCl2 용액(이것은 흡탈착 시험에서 사용하는 용액임) 중에서 측정해야 한다. 또한 여타의 연관적인 토양 특성은 표준 시험법(예. ISO의 “Handbook of Soil Analysis")에 의해 측정해야 한다. 그러면 수착 데이터의 분석이 세계적인 표준화 토양 파라미터에 기반을 두게 되는 것이다. 토양 분석과 특성화에 대한 기존의 표준 시험법의 지침은 주 43, 44, 45에 제시해 둔다. 토양 시험방법의 검정을 위해서는, 표준 토양을 사용해야 한다.

2.2.3. 흡탈착 시험용의 토양 선정의 지침은 표 1에 제시한다. 일곱 가지로 선정되는 토양은 온대지역에서 전형적으로 만나게 되는 토양의 형상이다. 이온성의 시험물질에 대해서는, 그 선정 토양이 광범위한 pH 범위에 걸치도록 하여, 이온화 형태 및 비이온화 형태로서의 시험물질의 흡착성을 평가하도록 해야 한다. 다양한 시험 단계에서 사용해야 할 다양한 토양에 대한 지침은 “시험 수행” 부문에서 제시한다.

2.2.4. 여타의 토양 형상은 OECD 회원국에 속하는 한대, 온대, 열대 지역을 대변하도록 선정할 필요도 있다. 그러므로 여타의 토양 형상을 선정하게 되면, 표 1에서 기술하는 동일한 특성치와 변동성을 가지는 파라미터에 의해 특성화 해야 한다.

표 1. 흡착-탈착 시험용 토양시료선정 지침

토양 종류	pH 범위 (0.01 M CaCl2 중)	유기탄소조성 (%)	진토(clay) 조성 (%)	토양 구성*
1	4.5～5.5	1.0～2.0	65～80	진토(clay)
2	>7.5	3.5～5.0	20～40	진토 찰흙(clay loam)
3	5.5～7.0	1.5～3.0	15～25	미사 찰흙(silt loam)
4	4.0～5.5	3.0～4.0	15～30	찰흙(loam)
5	<4.0～6.0§	<0.5～1.5§‡	<10～15§	찰모래(loamy sand)
6	>7.0	<0.5～1.0§‡	40～65	진토 찰흙/진흙 (clay loam/clay)
7	<4.5	>10	<10	모래/찰모래 (sand/loamy sand)

* FAO 및 US 시스템에 의거(주 46)

§ 각각의 변수는 주어진 범위 내의 값을 가져야 한다. 그러나 적절한 토양 물질을 찾아내기 어려운 때에는, 그 지시치의 최소치 이하의 값을 갖는 토양으로 해야 한다.

‡ 유기탄소 0.3 % 이하의 토양은 유기탄소와 흡착성의 상관관계를 교란시킬 수 있다. 그러므로 최소 0.3 %의 유기탄소를 갖는 토양으로 해야 한다.

2.3. 토양시료의 수집 및 보관

2.3.1. 수집

토양시료채취 기법 및 장치에 대해서는 특정한 기법과 장치를 권장하는 것은 없지만 조사, 시험의 목적(주 47, 48, 49, 50, 51, 52)에 부합해야 하는데 다음과 같은 사항을 이용할 수 있다.

(1) 현장의 이력에 부합되는 상세 정보. 여기에는 위치, 식생도, 농약살포, 비료살포, 생물학적 첨가물이나 사고에 의한 오염, 시료채취 지의 특성에 따른 ISO 토양시료채취규격(ISO 10381-6) 등이 포함된다.

(2) 시료채취지역은 UTM(메르카토르식 투영도법: Universal  Transv-

ersal Mercator Projection/European Horizontal Datum) 혹은 지리학적 좌표로서 정확히 정의해야 한다. 이는 차후 특정 토양을 재수집할 때에도 적절하고, 각 나라에서 사용되는 다양한 분류 시스템으로 토양을 정의할 때에도 적절하다. 또한 최대깊이 20 ㎝까지의 지평면을 기준으로 시료채취 해야 한다. 특히 7번의 토양에 대해 Oh 지평면이 토양의 한 부분으로 존재하는 경우에는 시료채취 시에 반드시 참작해야 한다.

한편, 토양 시료는 컨테이너를 이용해 이송해야 하고, 초기의 토양 특성이 변화되지 아니하는 온도 조건에서 이송해야 한다.

2.3.2. 보관

현장에서 채취한 토양을 그대로 사용해야 한다. 이러한 여건이 가능하지 않다면, 토양을 실온으로 저장하고 공기 건조의 상태로 보관해야 한다. 저장시간에는 한계를 두지 않는다. 그러나 3년 이상 저장된 토양에 대해서는 사용하기 전에 유기탄소함량과 pH 및 CEC를 재분석해야 한다.

2.4. 토양시료의 취급 및 조제

2.4.1. 토양은 실온(주로 20~25 ℃)에서 공기 건조시킨다. 그리고 토양을 분쇄할 때에는 최소한의 힘으로 덩어리를 깨트려, 토양의 원래 조직에 거의 변화가 발생되지 않게 부순 다음 체로 걸러 입자 크기가 2 ㎜ 이하가 되게 한다. 체로 거르는 과정에 대해서는 ISO의 토양시료채취규격(ISO 10381-6)을 이용한다. 세심하게 균질화시켜, 결과치의 재현성을 가능하게 해야 한다.

2.4.2. 각 토양의 수분함량은 12 시간 동안 무게의 변동이 없어질 때까지 105 ℃에서 3 개의 등량 시료에 대해 측정한다. 토양의 질량은 오븐 건조 질량, 즉 수분 함량으로 보정하는 토양질량으로 제시한다.

2.5. 시험물질 조제

2.5.1. 시험물질을 증류수 혹은 탈이온수로 0.01 M의 염화칼슘(CaCl2) 용액에 녹인다. 염화칼슘 용액을 수용매상으로 이용하여 원심분리를 용이하게 하고 양이온교환을 최소화 한다. 저장용액의 농도는 분석장치의 검출한계보다 3 차원 이하로 높아야 한다. 이러한 한계치가 본 시험지침의 방법에 따른 측정치의 정확도를 보증하는 것이다. 또한 저장용액의 농도는 시험물질의 수용해도 이하여야 한다.

2.5.2. 저장용액은 토양시료의 준비 이전에 조제하여, 4 ℃의 암소에 밀폐하여 보관해야 한다. 저장시간은 시험물질의 안정성과 용액 중의 시험물질 농도에 의거해야 한다.

2.5.3. Sw<10-4 g/ℓ로 용해성이 약한 물질에 대해서는, 적절한 용해 시약을 추가하여 시험물질을 용해시킬 필요가 있다. 이러한 용해 시약은 (a) 메탄올이나 아세토니트릴처럼 물과 잘 혼합되는 것이어야 하고, (b) 그 농도는 저장용액의 총 부피의 1 %를 초과하지 않아야 하고 토양과 접촉하는 시험물질 용액의 농도 이하(주로 0.1 % 이하)이어야 하고, (c) 계면활성물질이거나 시험물질과 용매화 반응을 일으키는 물질이어서는 아니 된다. 용해 시약의 사용에 대해서는 보고서에 명확히 기재하고 그 타당성도 제시해야 한다.

2.5.4. 용해성이 약한 시험물질에 대한 또 다른 대안으로서는 그 시험물질을 시험 시스템에 추가하여 혼합하는 것이다. 시험물질을 유기용매에 용해시키고, 그 일정량을 증류수나 탈이온수의 0.01 M 염화칼슘 용액과 토양의 시스템에 추가한다. 수용상에서의 유기용매의 함량은 가능한 한 낮아야 하는데, 일반적으로는 0.1 % 이하이면 좋다. 그러나 유기용액으로부터의 혼합작용이 체적 문제로 인해 재현성을 상실되는 문제에 직면하게 된다. 결과적으로 시험용액으로서의 오차가 추가되게 되고, 공용매의 농도가 전체 시험을 통해 동일하지 않게 되는 것이다.

3. 필수 사항

3.1. 분석 방법

3.1.1. 측정치의 정확도에 영향 미치는 주요 파라미터로서는 용액과 흡착상의 분석에서의 분석방법의 정확도, 시험물질의 안정성과 순도, 수착평형 여부, 용액농도변화의 크기, 토양/용액의 비, 평형기간 동안의 토양조직의 변화 등이다(주 36, 53, 54, 55, 56). 정확도와 연관되는 사례는 주 57에서 제시한다.

3.1.2. 분석방법의 신뢰도는 시험 중의 농도 범위 내에서 점검해야 한다. 시험자는 시험자의 의지대로 적정한 정확도, 정밀도, 재현성, 검출한계 및 회수율을 가진 분석방법을 선정할 수 있다. 이와 같은 시험 수행에 필요한 지침은 각 시험절차에서 제시한다.

3.1.3. 적당한 부피의 0.01 M의 염화칼슘(예. 100 ㎤)을 유기탄소함량 및 점토함량이 높은 일정량(예. 20 g)의 토양으로 4 시간 동안 교반시킨다. 이러한 무게와 부피는 분석방법에 따라 달라지게 되지만, 1 : 5의 토양/용액 비는 편리한 출발점으로 이용할 수 있다. 그 혼합물을 원심분리시키고 그 수용상을 여과하기도 한다. 일정 부피의 시험물질 저장용액을 그 수용상에 첨가하여 시험 중의 농도범위 내의 공칭 농도에 도달하게 한다. 이러한 체적은 평형 이전 용액의 특성을 가능한 한 변화시키지 않도록, 수용상의 최종 부피의 10 %를 초과하게 해서는 아니 된다.

3.1.4. ‘토양+염화칼슘 용액(시험물질이 없음)’의 시스템으로 구성되는 하나의 공시험을 실시하여 분석방법에 따른 생성물과 토양 유래의 모체(매트릭스) 영향을 체크해야 한다.

3.1.5. 수착 측정에 사용하는 분석방법에는 기액크로마토그래피(GLC), 고성능액체크로마토그래피(HPLC), 분광분석법(GC/MS, HPLC/MS), 액체섬광계수법(방사성표지 물질의 경우) 등이 있다. 분석방법과는 별도로, 회수율이 공칭값의 90~110 %가 되게 해야 한다. 분배 이후에도 검출하고 평가하기 위해 분석방법의 검출한계는 적어도 공칭 농도 이하의 2 차원이 되게 해야 한다.

3.1.6. 흡착 조사 및 시험을 수행하는데 유용한 분석방법의 특성과 검출한계의 선정은 시험조건을 정의하고 총체적인 시험수행을 위해서도 중요하다. 이 지침을 따르면, 전반적인 시험 경로를 확보할 수 있고, 분석방법과 시험시설이 그 한계성에 영향 미치는 대안 용액의 선정에 대한 권장사항과 지침도 확보할 수 있다.

3.2. 토양/용액의 적정비율 선정

3.2.1. 수착조사·시험을 위해 용액에 대한 토양의 적정비율 선정은 분배계수 Kd와 흡착성의 상대적 크기에 따라 달라지게 된다. 용액 내의 시험물질 농도의 변화는 흡착방정식의 형태에 의거하는 측정치의 통계적 정확도를 결정하게 되고, 용액 내의 시험물질 농도를 검지하는 분석방법의 한계성을 결정하게 된다. 일반적으로 흡착 퍼센트를 20 % 이상 또는 50 % 이상(선호하는 퍼센트)으로 하는, 몇 가지의 고정된 비율값으로 침전시키는 편이 편리하다(주 56). 이 때에는 수용상 내의 시험용액의 농도가 정확하게 측정할 수 있을 만큼 높아지도록 유의해야 한다. 그 흡착 퍼센트를 높게 하는 경우에 특히 중요한 것이다.

3.2.2. 적정한 토양/물의 비를 선정하는 편리한 방법은 예비 조사나 기존의 산정 기법(주 58)에 의해 Kd값을 산정하는 기법에 의거하고 있다. 그 적정한 비는 일정한 흡착 퍼센트에서의 Kd에 대해 토양/용액의 비를 도시하여 선정하고 있다(그림 1). 이러한 플롯에서는 흡착식이 [eqn: C _{s} ^{ads} (eq)``=``K _{d} ` BULLET C _{aq} ^{ads} (eq)] 으로 표현된다. 이 후에 제시될 식(4)의 Kd를 식(1)의 형태로 재정리하면, 적용가능한 관계식을 얻을 수 있다.

[eqn: {V _{0}} over {m _{soil}} ```=```( {m _{0}} over {m _{0} ^{ads} (eq)} ```-```1)K _{d}]        (1)

[eqn: R```=``` {m _{soil}} over {V _{0}} ```````및``````A _{eq} {%} over {100} ``=`` {m _{s} ^{ads} (eq)} over {m _{0}}] 로 가정하여 대수(로그) 형태로 나타내면

[eqn: log`R```=```-`log`K _{d} ```+``log[ {(A _{eq} {%} over {100} )} over {(1``-``A _{eq} {%} over {100} )} ]]          (2)

와 같이 표현된다.

그림 1  다양한 시험물질 흡착 퍼센트에서의 토양/용액의 비와 Kd 사이의 상관관계

3.2.3. 그림 1에서는 여러 가지의 흡착성에 대한 Kd의 함수로서 요구되는 토양/용액의 비를 도시하고 있다. 예로써 토양/용액의 비가 1 : 5이고 Kd가 2인 경우에는 흡착성이 거의 80 %로 나타난다. 이와 동일한 Kd에 대해 50 %의 흡착성을 얻으려면 토양/용액의 비가 1 : 25이어야 한다. 적정한 토양/용액의 비를 선정하는 이와 같은 접근법은 시험자에게 유연하게 선택할 수 있게 해 준다.

3.2.4. 여기서 다루기 힘든 영역은 화학물질이 거의 흡착되지 않거나 아주 잘 흡착되는 영역이다. 흡착이 잘 안 되는 경우에는 1 : 1의 토양/용액 비를 권장하고 있다. 유기성 토양에 대해서는 이 보다 적은 비를 선정해야 슬러리를 얻을 수 있다. 어떠한 경우이든, 용액 농도의 자그만 변화도 측정할 수 있는 분석방법을 선택하도록 특별히 유의해야 한다. 분배계수 Kd가 대단히 높은 경우에는 용액 내에 어느 정도의 화학물질을 잔존시키기 위해 토양/용액의 비를 1 : 100 정도로 높게 해야 한다. 이 때 잘 혼합시켜야 하고, 시스템의 평형도달 시간이 적절하게 유지되게 해야 한다. 적절한 분석방법이 없는 극단적인 경우에 대한 접근기법으로서는 주 58에서처럼 POW값에 대한 Kd값을 예측 및 산정하는 것이다. 이러한 기법은 POW<20인 저흡착성/극성 화학물질이나 POW>104인 친유성/고흡착성 화학물질에 대해 특히 유용하다.

4. 시험 수행

4.1. 시험 조건

4.1.1. 모든 시험은 실온에서 수행해야 하는데, 가능하다면 20~25 ℃ 사이의 일정한 온도에서 수행해야 한다.

4.1.2. 원심분리 조건은 용액으로부터 0.2 ㎛ 이상의 입자를 제거할 수 있어야 한다. 이러한 값은 고형물이라고 인정되는 최소의 입자를 제거하게 하는 것으로, 고형물과 콜로이드 입자 사이의 한계치이다. 원심분리 조건에 대한 지침은 주 59에서 제시한다.

4.1.3. 원심분리기가 0.2 ㎛ 이상의 입자를 제거할 수 없는 경우에는 0.2 ㎛의 필터로써 원심분리하고 동시에 여과해야 한다. 이러한 필터는 시험물질의 손실이 발생되지 않도록 비활성 재료로 만들어져야 한다. 어떠한 경우이든 시험 동안에는 시험물질의 손실이 전연 발생되지 않아야 한다.

4.2. 예비 시험(제 1단계)

예비 시험을 수행하는 목적은 앞서 언급되었으므로 예비 시험의 수행 지침은 아래에서 제시하는 시험과 더불어 기술하기로 한다.

4.2.1. 토양/용액 비의 적정 선정

4.2.1.1. 두 가지의 토양 형상과 세 가지의 토양/용액 비(여섯 번의 시험)를 이용한다. 하나의 토양 형상은 유기 탄소의 함량이 높고 점토의 함량이 낮고, 다른 하나의 토양 형상은 유기 탄소의 함량이 낮고 점토의 함량이 높다. 그리고 아래와 같은 토양/용액의 비를 이용한다. 이와 같은 비에 상당하는 토양의 질량과 수용액의 부피는 시험 설비에 따라 달라지게 된다.

(1) 50 g의 토양과 50 ㎤의 시험물질 수용액(비 1 : 1)

(2) 10 g의 토양과 50 ㎤의 시험물질 수용액(비 1 : 5)

(3) 2 g의 토양과 50 ㎤의 시험물질 수용액(비 1 : 25)

4.2.1.2. 시험을 수행하는 토양의 최소량은 시험 설비나 분석방법의 성능에 따라 달라진다. 통상적으로는 시험으로부터 신뢰성 있는 결과치를 얻기 위해 적어도 1 g 혹은 2 g의 토양을 주로 이용하고 있다.

4.2.1.3. 토양이 없는 0.01 M의 염화칼슘 용액 내의 시험물질만으로 이루어지는 대조시료에 대해, 시험 시스템과 동일한 단계로 하여 염화칼슘 용액 내의 시험물질의 안정성을 체크하고 시험용기 표면의 흡착 가능성을 체크한다.

4.2.1.4. 동일한 토양의 양과 시험물질 없는 50 ㎤의 0.01 M 염화칼슘 용액으로 하는 공시험은 그 시험절차와 동일하게 수행한다. 이는 간섭물질이나 오염 토양을 검출하는 분석 중의 백그라운드 대조시험으로 역할하게 된다.

4.2.1.5. 대조시험과 공시험을 포함하여 모든 시험은 적어도 2 번씩 수행해야 한다.

4.2.1.6.. 예비 시험 및 본 시험의 방법은 일반적으로 동일해야 한다. 예외적인 경우는 확실하게 언급해 두어야 한다.

4.2.1.7. 공기 건조 토양 시료는 시험일 이전의 야간 12 시간에 걸쳐서 최소량 45 ㎤의 0.01 M 염화칼슘과 함께 교반하여 평형시켜야 한다. 이후에는 시험물질의 저장용액 일정량을 첨가한다. (a) 수용상의 최종 50 ㎤ 부피의 10 %를 초과하지 않게 하여 평형 이전 용액의 특성이 거의 변하지 않게 하고, (b) 토양(C0)과 접촉하는 시험물질의 초기 농도를 분석장치의 검출한계보다 2 차원 높게 해야 한다. 이와 같은 한계치가 측정을 정확하게 해주고 흡착 등온선도 산정하게 해준다. 비록 90 % 이상으로 흡착성이 강한 경우라도 그러하다. 가능하다면, 초기의 시험물질 농도(C0)는 그 용해도의 절반을 초과되지 않게 해야 한다.

4.2.1.8. 저장용액의 농도(Cst)를 산정하는 사례는 아래에서 제시한다. 검출한계는 0.01 ㎍/㎤로 하고 흡착성은 90 %로 가정한다. 토양과 접촉하는 시험물질의 초기 농도는 1 ㎍/㎤로 하여 검출한계보다 2 차원 높게 한다. 저장용액의 최대 권장량을 첨가한다. 즉 5~45 ㎤의 0.01 M 염화칼슘 평형용액(즉, 수용상의 50 ㎤ 최대부피에 대한 저장용액의 10 %)으로 하면, 저장용액의 농도는 10 ㎍/㎤이 된다. 이는 분석장치의 검출한계보다 3 차원 높은 농도이다.

4.2.1.9. 수용상의 pH는 토양과의 접촉 전후에 측정해야 한다. 이온화 물질에 대해서는 흡착이 특히 중요한 역할을 하기 때문이다.

4.2.1.10. 그 혼합물은 평형에 도달할 때까지 교반한다. 토양이 들어간 혼합물의 평형시간은 시험화학물질과 토양의 종류에 따라 변화무쌍하지만, 일반적으로 24 시간이면 충분하다(주 60). 예비조사에서는 48 시간의 혼합기간 중에 걸쳐서 연속적(예. 4, 8, 24, 48 시간)으로 시료를 수집한다. 그러나 분석시간은 시험실의 작업계획에 따라 유연성 있게 해도 된다.

4.2.1.11. 수용액 내의 시험물질 분석에는 두 가지의 방법이 있는데, (a) 병행법과 (b) 순차법이다. 병행법이 실험적으로는 번거롭지만, 결과치의 수학적 처리는 훨씬 간단한 편이다(주 61). 그러나 두 가지의 실험방법 중의 선택은 실험장비와 부대설비를 고려하여 시험자가 해야 한다.

4.2.1.12. (a) 병행법 : 토양/용액의 비가 동일한 시료들을 조제한다. 흡착속도론에 의거해 조사 시간의 간격을 정한다. 원심분리 후에 여과가 필요하다면, 첫 번째 시험튜브의 수용상은 가능하면 완전하게 회수하고 4 시간 후에 측정한다. 두 번째 시험튜브의 수용상은 8 시간 후에, 세 번째 시험튜브의 수용상은 24 시간 후에 측정한다. 이와 같이 계속해 나간다.

4.2.1.13. (b) 순차법 : 각각의 토양/용액의 비에 대해 두 가지씩의 시료를 조제한다. 정해진 시간 간격으로 그 혼합물을 원심분리하여 상에 따라 분리한다. 수용상의 미소량의 일정 시료에 대해서는 시험물질을 즉시 분석하고, 그러한 실험을 원래의 혼합물에 대해서도 계속한다. 원심분리 후에 여과가 필요한 경우에는 미소량 수용액의 여과에 필요한 시설을 구비해야 한다. 시험액량의 전체 부피는 용액의 전체 부피의 1 %를 초과해서는 아니 된다. 이는 토양/용액의 비를 거의 변화시키지 않고 시험 중에 흡착되는 용질의 손실을 방지하기 위한 것이다.

4.2.1.14. 퍼센트 흡착성 [eqn: A _{t _{i}}]은 초기의 공칭 농도와 시료채취시간(ti)에서의 측정농도에 기준하여 각 시간 별로 산정하고, 공시험치에 대해 보정한다. 시간에 대해 [eqn: A _{t _{i}}]을 도시(주 61의 그림 1)하면, 평형 안정기의 도달을 산정할 수 있다. 수용상([eqn: C _{aq} ^{ads}]) 내의 시험물질의 농도를 시간에 대해 도시하면, 평형 안정기의 도달을 산정할 수 있는 것이다(주 61의 그림 2). 또한 평형에서의 Kd값도 산정할 수 있다. 이러한 Kd값에 의거하여 그림 1로부터 적절한 토양/용액의 비를 산정할 수 있다. 그러면 퍼센트 흡착성은 20 % 이상에 이르지만, 주로 50 % 이상에 이르게 된다(주 55). 그에 필요한 방정식과 플롯의 원리는 주 61의 ‘데이터 및 보고’ 편에서 참조할 수 있다.

4.2.2. 흡착평형시간 및 시험물질 흡착량의 산정

4.2.2.1. 앞서 기술한 바와 같이, 시간에 대해 [eqn: A _{t _{i}}] 혹은 [eqn: C _{aq} ^{ads}]을 도시하게 되면 흡착평형의 도달시간을 산정할 수 있고, 시험물질의 평형흡착량을 산정할 수 있다. 주 61의 그림 1과 그림 2에서는 그러한 사례를 제시하고 있다. 평형시간은 그 시스템이 안정기에 도달하는 시간이다.

4.2.2.2. 특정한 토양이라면 평형 안정기가 나타나지 않고, 지속적으로 증가하는 경향이 발견되기도 한다. 이러한 현상은 생물학적 분해작용이나 완만한 확산작용과 같은 복잡한 요인에 기인하기도 한다. 생물학적 분해작용은 토양의 멸균 시료를 반복적으로 실험하는 경우에 나타는 현상이다. 이와 같이 평형 안정기에 도달하지 않는 경우에는, 시험자는 그 시험에 특징적인 여타의 현상들을 조사·규명해야 한다. 그 결과에 따라 시험조건(온도, 교반시간, 토양/용액의 비)을 조정하기도 한다. 흡착평형에 도달하지 않음에도 불구하고 그 시험 절차를 계속할 것인가는 전적으로 시험자의 판단에 달려있다.

4.2.3. 시험용기 표면의 흡착 및 시험물질의 안정성

4.2.3.1. 시험용기의 표면에 대한 시험물질의 흡착성과 그 안정성에 관한 정보는 대조시료의 분석에 의해서도 도출할 수 있다. 분석방법의 표준오차 이상으로 시험물질의 손실이 발생되게 되면, 무생물적인 분해작용이나 용기표면에의 흡착작용이 관여하고 있다고 할 수 있다. 이러한 두 가지 현상을 구분하기 위해서는, 시험용기의 벽면을 일정량의 적정 용매로써 완전하게 씻어내고 그 세척용액에 대해 시험물질을 분석해 보면 알 수 있다. 시험용기의 표면 흡착이 관찰되는 경우에는, 시험용기의 재료를 바꾸어야 할 필요성이 생긴다. 그러나 시험에서 얻어지는 시험용기의 표면흡착 데이터를 곧바로 토양/용액의 실험에 외연시켜 적용할 수는 없다. 일반적으로 토양의 존재성이 그 흡착성을 저하시키기 때문이다.

4.2.3.2. 시험물질의 안정성에 대한 정보는 시간에 대한 그 물질수지의 산정에 의해서도 도출할 수 있다. 이는 토양, 시험용기 벽면의 수용상과 추출물을 시험물질에 대해 분석해야 한다는 것이다. 추가된 시험물질의 질량은 토양·시험용기 벽면의 수용상과 추출물에서의 시험물질의 총질량과 차이성을 나타내게 된다. 이러한 차이성은 분해되거나 휘발되거나 추출되지 않는 질량과 같은 양이다. 하나의 물질수지 식을 만들기 위해서는 시험 기준 중에 흡착평형이 이루어져야 한다.

4.2.3.3. 그 토양들에 대해, 그리고 평형에서 20 % 이상 내지 50 % 이상의 퍼센트 흡착을 일으키는 토양의 토양/용액의 비에 대해 물질수지를 산정한다. 그 토양/용액의 비가 발견되는 시험에서 48 시간 후에 그 수용상의 최종 시료를 분석하고서는, 원심분리 및 원심분리․여과에 의해 상분리시킨다. 가능하면 수용상은 회수하고, 추출용매(최소 95 %의 추출계수)는 시험물질을 추출하기 위한 토양에 추가한다. 적어도 두 가지의 연속적인 추출조작을 해야 한다. 토양·시험용기 추출물 내의 시험물질량을 측정하고 그 물질수지를 산정한다. 그것이 90 % 이하이면, 그 시험물질은 그 시험시간 내에서는 불안정한 것으로 간주한다. 시험물질의 불안정성을 고려하면서 그 시험을 계속해 나가면, 본 시험에서는 두 가지의 상을 분석해 낼 수 있다.

4.3. 시험물질 농도에서의 흡착속도론(제 2단계)

4.3.1. 표 1을 사용하여 5 개의 토양을 선정한다. 이 5 가지의 토양은 예비시험에서 필요한 모든 토양을 포함하게 된다. 이 경우에는 예비시험에서 사용하는 토양에 대해 제 2단계를 반복하지 않는다.

4.3.2. 평형시간, 토양/용액의 비, 토양시료의 무게, 토양과 접촉하는 수용상의 부피 및 용액중의 시험물질 농도 등을 예비 시험의 결과에 의해 선정한다. 분석은 2, 4, 6, 8(가능하면 10도 포함) 및 24 시간의 접촉시간에 대해 시행한다. 교반시간은 최대 48시간까지로 한다. 토양/용액의 비를 찾아내기 위한 평형시간이 긴 시험물질에 대해서는 최대 시간으로 교반하기도 한다. 그러나 분석 시간에 대해서는 유연성 있게 대처한다.

4.3.3. 각 시험(하나의 토양과 하나의 용액)은 적어도 두 번 이상으로 반복하여 결과치의 분산도를 모색하게 한다. 모든 시험에서 한 번의 공시험을 한다. 공시험은 토양과 0.01 M 염화칼슘 용액으로 하되, 시험물질은 빼고 하며, 그 시험에 상응하는 무게와 부피로 한다. 토양이 빠진 0.01 M 염화칼슘 용액 내에 시험물질만이 들어간 대조시료도 동일한 절차로서 시험한다. 그래야만 예기치 않은 결과의 발생을 방지할 수 있다.

4.3.4. 퍼센트 흡착성은 각 시간점 [eqn: A _{t _{i}}] 및 시간 간격 [eqn: A _{TRIANGLE t _{i}}](조사의 필요성에 따라)에서 시간에 대해 도시한다. 평형에서의 분배계수 Kd와 비극성 유기화합물에 대한 유기탄소 기준의 흡착계수 Koc도 산정한다. 흡착속도론으로 정리하면 시험의 결과치는 다음의 3 가지로 요약된다:

(1) 선형의 Kd값은 일반적으로 토양 내의 수착 거동(주 36, 62)을 설명해 주고 토양 내에서의 본래적 이동성을 정확히 나타내고 있다. 예로써, Kd≤1 ㎤/g의 화학물질은 정성적으로 이동성이라고 간주한다. 이와 같이 Koc값에 의한 이동성의 분류방식은 McCall 등(주 17)이 개발했던 것이다. 또한 침출성의 분류방식은 Koc와 DT-50의 상관관계에 의거하고 있다(주 33, 63). 여기서 DT-50은 시험물질의 50 %가 분해되는 시간이다.

(2) 시행착오법(error analysis study, 주 55)에 의하면, 0.03 ㎤/g 이하의 Kd값은 수용상의 농도 저하로 인해 정확히 산정할 수 없다. 가장 선호하는 정확한 토양/용액의 비 1 : 1를 적용하는 경우에도 그러하다. 이러한 때에는 토양과 용액의 두 상을 모두 분석해야 한다.

(3) 토양내의 화학물질의 수착 거동과 그 잠재적 이동성은 Freundlich 흡착등온선의 측정에 의해 산정하기도 한다. 이는 본 가이드라인의 시험절차에 의해 Kd값을 정확하게 산정할 수 있기 때문이다. 그 Kd값에 토양/용액의 비를 곱했을 때의 결과치가 0.3 이상이면 정확한 산정이 가능하게 된다. 직접법으로서는 수용상의 농도 저하가 생기는 경우 혹은 0.1 이상인 경우이고, 간접법으로서는 두 상을 분석하는 경우이다.

4.4. 흡착등온선 및 탈착속도론/탈착등온선(제 3단계)

4.4.1. 흡착등온선

시험물질 농도는 다섯 가지로 하고, 수용해도와 수용상의 평형 농도를 고려하여 그 농도 범위는 2 차원(2 차수)으로 한다. 각 시험 동안에는 토양에 대한 토양/용액의 비를 동일하게 유지해야 한다. 다만, 수용상의 분석은 제 2단계 이전에 산정한 평형에 도달하는데 필요한 시간에서만 한번 시행하는 것이다. 용액의 평형 농도를 측정하고, 흡착량은 용액 내의 시험물질의 손실량 혹은 직접법으로 산정한다. 토양의 단위 질량당의 흡착량을 도시하면 시험물질 평형농도의 함수가 된다. 흡착등온선 시험에 대해서 요약을 해 보자면 다음과 같다.

지금까지의 수학적 흡착모델 중에는 Freundlich 등온선이 흡착 프로세스에서 가장 많이 이용되고 있다. 흡착 모델에 대한 보다 상세한 정보는 주 6, 9, 64, 65, 66에서 제시한다. 주의사항으로는, 각 시험물질에 대한 KF값(Freundlich 흡착계수)의 비교는 이러한 값들이 동일한 단위로 표현되는 경우에만 가능하다는 것이다.

4.4.2. 탈착속도론

4.4.2.1. 이 시험의 목적은 시험물질이 토양에서 가역적으로 혹은 비가역적으로 흡착되느냐를 찾아내는 것이다. 이러한 정보는 탈착 프로세스도 현지 토양에서의 화학물질 거동에서 중요한 역할을 하기 때문에 의미가 있다. 또한 흡착 데이터는 침출 및 용해-유달 모사의 컴퓨터 모델링에서 유용한 입력사항이 된다. 탈착 조사가 바람직한 경우에도 앞 절의 흡착실험에서 Kd값을 정확하게 산정할 수 있는 시스템에 대해서만 탈착 시험·조사를 해야 한다.

4.4.2.2. 흡착속도론 조사와 같이 탈착속도론 시험을 수행하는 방법에도 두 가지가 있는데 그것들은 (a) 병행법 및 (b) 순차법이다. 그 방법은 시험자가 선택해야 하는 것으로 이용가능한 시험장비와 장치를 참작하고 앞서 언급된 참조사항을 염두에 두고서 선정하는 것이다.

4.4.2.3. 병행법

탈착 시험 대상의 각 토양에 대해, 동일한 토양/용액의 비를 갖는 시료를 준비하고, 탈착속도론에 합당한 회수만큼의 시간 간격으로 측정한다. 흡착속도론 시험과 동일한 시간 간격으로 할 수 있다. 그러나 탈착 평형에 도달시키기 위해서는 전체적인 시간의 연장이 불가피하다. 모든 시험(하나의 토양, 하나의 용액)에서는 하나의 공시험을 해야 한다. 공시험은 토양과 0.01 M 염화칼슘 용액(시험물질이 없는)으로 구성하고, 시험에 상응하는 무게와 체적으로 한다. 대조시료로서, 토양이 없는 0.01 M 염화칼슘 용액 내의 시험물질은 공시험 시료와 동일한 절차에 의해 조제한다. 토양과 용액의 모든 혼합물은 흡착평형에 도달할 때까지 교반한다(제 2단계에서처럼). 그리고 원심분리에 의해 상분리 하고 수용상은 가능한 한 제거한다. 제거된 용액의 부피만큼 시험물질 없는 0.01 M 염화칼슘 용액으로 채우고, 이의 새로운 혼합물은 다시 교반한다. 첫 번째 시험튜브의 수용상은 가능하면 완전히 회수하고, 2 시간 후에 측정하고, 두 번째 시험튜브의 수용상은 4 시간 후에 측정하고, 세 번째 시험튜브의 수용상은 6 시간 후에 측정하는 등으로 탈착평형이 도달할 때까지 시행한다.

4.4.2.4. 순차법

흡착속도론의 시험 후에는, 그 혼합물은 원심분리하고 가능하면 수용상은 많이 제거한다. 제거된 용액의 부피만큼은 시험물질 없는 0.01 M 염화칼슘 용액으로 채운다. 이의 새로운 혼합물은 탈착 평형이 도달할 때까지 교반한다. 이와 같은 기간 중에는 한정된 시간 간격으로 원심분리 하여 상분리 한다. 여기서의 수용상의 일정 미소량에 대해 즉시 시험물질을 분석한다. 그리고 원래의 혼합물에 대해 시험을 계속한다. 각각 수용상 시험액의 미소량은 전체 부피의 1 % 이하이어야 한다. 동일한 양의 새로운 0.01 M 염화칼슘 용액을 그 혼합물에 채우면서, 토양/용액의 비를 유지한다. 차후의 시간 간격에 이르기까지 교반은 계속한다.

4.4.2.5. 퍼센트 탈착성은 각 시간점 [eqn: D _{t _{i}}] 및 조사시험의 필요에 따라 시간 간격 [eqn: D _{TRIANGLE t _{i}}]에서 산정하고, 시간에 대해 도시한다. 평형에서의 탈착계수 Kdes도 산정한다. 이에 적용가능한 모든 수식은 주 61에서 제시해 둔다. 탈착시험과 탈착속도론을 정리하면 다음과 같이 요약된다.

시간에 대해 퍼센트 탈착성 [eqn: D _{t _{i}}]와 퍼센트 흡착성 [eqn: A _{t _{i}}]을 도시하게 되면, 흡착 프로세스의 가역성을 평가할 수 있다. 탈착평형이 흡착평형 시간의 2배에서 발생되고 총 탈착량이 흡착량의 75 % 이상이면, 그 흡착은 가역적이다.

4.4.3. 탈착등온선

흡착등온선 시험에서 사용한 토양에 대해 Freundlich 탈착등온선을 산정한다. 탈착시험은 “탈착속도론”에 따라 수행한다. 다만, 수용상은 탈착평형에서 한 번만 분석한다는 것이다. 흡착된 시험물질의 양도 산정한다. 탈착평형에서 토양에 흡착되어 잔존하는 시험물질의 양을 용액 내의 시험물질의 평형농도의 함수로서 도시한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

분석 데이터는 주 67의 표 형태로 제시한다. 개별적인 측정치와 그 평균치도 산정하여 제시한다. 흡착등온선에 대해서는 그림으로 도시하여 제시한다. 시험 목적을 위해 수용액 1 ㎤는 1 g으로 간주한다. 토양/용액의 비는 w/w 혹은 w/vol의 단위로 표현하되 통일성을 가지도록 한다.

1.1. 흡착

1.1.1. 흡수성 [eqn: A _{t _{i}}]은 시험조건 하에서의 시험초기의 시험물질량에 대해 토양에 흡착하는 시험물질의 퍼센트로 정의한다. 시험물질이 안정하고 컨테이너의 벽면에 크게 흡착되지 아니한다면, 각 시간점 ti에서의 [eqn: A _{t _{i}}]은 다음의 식(3)으로 산정한다.

[eqn: A_{t_{i}}= { m_{s}^{ads}(t_{i})×100} over {m_{0} }(%)]        (3)

여기에서, [eqn: A _{t _{i}}] = 시간점 ti에서의 흡착 퍼센트(%)

[eqn: m _{s} ^{ads} (t _{i} )] = 시간 ti에서 토양에 흡착된 시험물질량(㎍)

[eqn: m _{0}] = 시험시작 시에서 시험튜브 내의 시험물질량(㎍)

이며 병행법 및 순차법에 의한 흡착 퍼센트 [eqn: A _{t _{i}}]의 산정에 관한 세세한 정보는 주 61에서 제시한다.

1.1.2. 분배계수 Kd는 토양상 내의 시험물질의 함량과 흡착평형에 이르렀을 때 그 시험조건 하에서의 수용액 내의 시험물질의 질량농도 사이의 비로서 다음의 식(4)로 나타낸다.

[eqn: K_{d}= {C_{s}^{ads}(eq) } over {C_{aq}^{ads}(eq) }= { m_{s}^{ads}(eq)} over {m_{aq}^{ads}(eq) }× { V_{0}} over {m_{soil} }(㎤/g)]         (4)

여기에서, [eqn: C _{s} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서 토양에 흡착되는 시험물질의 함량(㎍/g)

[eqn: C _{aq} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서의 수용상 내의 시험물질의 질량농도. 이 농도는 공시험값을 참작하면서 분석·측정하여 구한다.

[eqn: m _{s} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서 토양에 흡착되는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서 용액 내의 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{soil}] = 토양의 건조질량으로 나타내는 토양상의 양(g)

[eqn: V _{0}] = 토양과 접촉하는 수용상의 초기 부피(㎤)

로 나타나며 Aeq와 Kd는 다음과 같이 주어진다.

[eqn: K_{d}= { A_{eq}} over {100-A_{eq} }× { V_{0}} over {m_{soil} }(㎤/g)]          (5)

여기에서, [eqn: A _{eq}] = 흡착평형에서의 흡착 퍼센트(%)를 나타낸다.

1.1.3. 유기탄소기준 흡착계수 Koc는 토양 시료의 유기탄소 함량에 분배계수 Kd를 관련짓는 계수로서 다음의 식(6)으로 나타낸다.

[eqn: K_{oc}=K_{d}× { 100} over {%_{oc} }(㎤/g)]         (6)

여기에서, %oc : 토양시료 속의 유기탄소의 퍼센트(g/g)를 나타낸다.

Koc는 토양이나 침전물 및 물 속의 유기탄소 사이에서 비극성 유기화합물의 분배를 특정 짓는 단일 값의 계수이다. 이와 같은 화합물의 흡착은 수착 고형물의 유기물 함량과 연관된다(주 68). 그러므로 Koc값은 수착능이 상당히 다른 부식물질 분율의 특성에 의거하며, 그 근원과 유래 등에 따라 달라지는 현상이기도 하다.

1.2. 흡착등온선

Freundlich 흡착등온선은 흡착되는 시험물질량을 평형상태에서의 용액 내의 시험물질의 농도와 상관 짓는 식(8)로 나타낸다. 데이터는 “흡착” 부문의 조건 하에서 처리하고, 각 시험튜브에 대해서는 흡착시험 후의 토양에 흡착되는 시험물질의 함량([eqn: C _{s} ^{ads} (eq)] 또는 [eqn: x/m]으로 표현)으로 계산한다. 평형에는 도달하는 것으로 가정하고, [eqn: C _{s} ^{ads} (eq)]는 평형값이라고 가정한다.

[eqn: C_{s}^{ads}(eq)= { m_{s}^{ads}(eq)} over { m_{soil}}= { [C_{0}-C_{aq}^{ads}(eq)]×V_{0}} over {m_{soil} }(㎍/g)]       (7)

그리고 Freundlich 흡착식은 식(8)과 같이 나타나거나

[eqn: C_{s}^{ads}(eq)=K_{F}^{ads}×C_{aq}^{ads}(eq)^{1/n}(㎍/g)]        (8)

또는 선형식에서는 다음과 같이도 나타난다.

[eqn: logC_{s}^{ads}(eq)=logK_{F}^{ads}+1/n×logC_{aq}^{ads}(eq)]      (9)

여기에서,  [eqn: K _{F} ^{ads}] : Freundlich 흡착계수이고 1/n = 1일 때의 차원 단위는 ㎤/g이다. 여타의 경우에는 [eqn: K _{F} ^{ads} ( mu g ^{1-1/n} (cm ^{3} ) ^{1/n} g ^{-1} )]의 차원 단위로 기울기 1/n을 도입하고 있다.

n : 회귀상수로서 일반적으로 1/n은 0.7~1.0의 범위값이고, 수착 데이터는 더러 약간의 비선형성을 띠게 된다.

그림 2  Freundlich 흡착 : 정규형 및 선형

1.3. 질량 수지(mass balance)

질량 수지(MB)는 시험초기의 시험물질량에 대한, 흡착시험 후에 분석적으로 회수할 수 있는 시험물질량의 퍼센트로서 정의한다. 용매가 물과 잘 혼합되는 경우에는 데이터를 달리 처리하기도 한다. 물 혼합성 용매인 경우, 주 61의 “탈착”편의 데이터는 용매추출에 의해 회수되는 시험물질량을 산정하는데 이용할 수도 있다. 만약 용매가 물과 잘 혼합되지 않는다면, 그 회수량을 산정해야 한다. 흡착에 대한 질량 수지(MB)는 다음과 같이 산정한다. 여기서 [eqn: m _{E}]항은 토양과 시험용기 표면에서 유기용매로 추출하는 시험물질량의 합계라고 가정한다.

[eqn: MB= { (V_{rec}×C_{aq}^{ads}(eq)+m_{E})×100} over {V_{0}×C_{0} }(%)]     (10)

여기에서, MB = 질량 수지(%)

mE = 두 단계로 토양과 시험용기 벽면에서 추출하는 시험물질량의 총량(㎍)

[eqn: C _{0}] = 토양과 접촉하는 시험용액의 초기 질량 농도(㎍/㎤)

[eqn: V _{rec}] = 흡착평형 이후에 회수되는 상등액의 부피(㎤)

를 나타낸다.

1.4. 탈착

탈착은 시험조건 하에서 이미 흡착된 시험물질량에 대해 탈착되는 시험물질의 질량 퍼센트로서 정의한다.

[eqn: D_{t}_{i}= { m_{aq}^{des}(t_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]         (11)

여기에서, [eqn: D _{t _{i}}] = ti에서의 탈착 퍼센트(%)

[eqn: m _{aq} ^{des} (t _{i} )] = ti에서 토양으로부터 탈착되는 시험물질량(㎍)

[eqn: m _{s} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서 토양에 흡착되는 시험물질량(㎍)

을 나타내며, 병행법과 순차법에 의한 탈착 퍼센트 [eqn: D _{t _{i}}]을 산정하는 상세 정보는 주 61에서 제시한다.

한편, 겉보기 탈착계수(Kdes)는 그 시험조건 하에서, 토양상 내에 잔존하는 시험물질의 함량에 대한 탈착평형 시에 수용상 내의 탈착된 시험물질의 질량 농도의 비율이다.

[eqn: K_{des}= { m_{s}^{ads}(eq)-m_{s}^{des}(eq)} over {m_{aq}^{des}(eq) }× {V_{T} } over {m_{soil} }(㎤/g)]       (12)

여기에서, Kdes = 탈착계수(㎤/g)

[eqn: m _{aq} ^{des} (eq)] = 탈착평형 시에 토양에서 탈착되는 시험물질의 총량(㎍)

[eqn: V _{T}] = 탈착속도론 시험 중 토양과 접촉하는 수용상 전체 부피(㎤)

를 나타낸다. [eqn: m _{aq} ^{des} (eq)]를 산정하는 지침은 주 61에서 “탈착” 편에서 제시한다. 주의사항으로, 흡착시험이 병행법으로 선행된 경우에는 식(12)의 부피 [eqn: V _{T}]는 [eqn: V _{0}]와 동일한 것으로 간주한다.

1.5. 탈착등온선

Freundlich 탈착등온선의 식은 탈착평형에서의 용액 내의 시험물질의 농도에 대해 토양에 흡착되어 잔존하는 시험물질의 함량으로 관련짓는 식(16)이다. 각 시험튜브에 대해, 탈착평형 시에 토양에 흡착되어 잔존하는 시험물질의 함량은 다음의 식(13)으로 산정한다.

[eqn: C_{s}^{des}= { m_{s}^{ads}(eq)-m_{aq}^{des}(eq)} over {m_{soil} }(㎍/g)]      (13)

위 식의 [eqn: m _{aq} ^{des} (eq)]는 다음의 식(14)로 정의한다.

[eqn: m_{aq}^{des}(eq)=m_{m}^{des}(eq)× { V_{0}} over {V_{r}^{F} }-m_{aq}^{A}(㎍)]     (14)

여기에서, [eqn: C _{s} ^{des} (eq)] = 탈착평형에서 토양에 흡착되어 잔존하는 시험물질의 함량(㎍/g)

[eqn: m _{m} ^{des} (eq)] = 탈착평형의 수용상에서 분석적으로 측정되는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{A} (eq)] = 불완전한 부피 채움으로 인해 흡착평형으로부터 잔존하는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에서의 용액 내의 시험물질의 질량(㎍)

을 나타내며,

[eqn: m_{aq}^{A}=m_{aq}^{ads}(eq)×( { V_{0}-V_{R}} over {V_{0} })]     (15)

여기에서, [eqn: V _{r} ^{F}] = 탈착평형시 시험물질의 측정을 위해 시험튜브로부터 취한 용액의 부피(㎤)

[eqn: V _{R}] = 흡착평형 후에 시험튜브로부터 제거되고 0.01 M 염화칼슘 용액의 동일한 부피로 채운 상등액의 부피(㎤)

를 나타낸다. 한편, Freundlich 탈착식은 다음의 식(16)으로 나타낸다.

[eqn: C_{s}^{des}(eq)=K_{F}^{des}×C_{aq}^{des}(eq)^{1/n}(㎍/g)]      (16)

위의 식을 선형의 형태로 정리하면 다음의 식(17)이 된다.

[eqn: logC_{s}^{des}(eq)=logK_{F}^{des}+1/n×logC_{aq}^{des}(eq)]       (17)

여기에서, [eqn: K _{F} ^{des}] = Freundlich 탈착계수

n = 회귀상수

[eqn: C _{aq} ^{des} (eq)] = 탈착평형에서 수용상 내의 시험물질의 질량농도(㎍/㎤)

를 나타낸다. 식(16)과 식(17)을 도시하고 [eqn: K _{F} ^{des}]와 1/n은 식(17)에 의한 회귀분석으로 산정한다. 주의사항으로는, Freundlich 흡착 혹은 탈착 지수 1/n이 1이라면, Freundlich 흡착 혹은 탈착 결합상수([eqn: K _{F} ^{ads}]와 [eqn: K _{F} ^{des}])는 흡착 혹은 탈착 평형상수([eqn: K _{d}] 및 [eqn: K _{des}])와 같게 되고, [eqn: C _{aq}]에 대해 [eqn: C _{s}]를 도시하면 선형이 된다. 만약 그 지수들이 1와 같지 않다면, [eqn: C _{aq}]에 대해 [eqn: C _{s}]를 플롯하면 비선형이 되고, 흡착 및 탈착 상수는 그 흡착·탈착 등온선에 따라 달라지게 된다.

2. 시험 보고서

시험보고서에는 다음의 내용이 수록되어야 한다.

2.1. 토양시료의 완전한 성상과 다음의 정보

1) 현지의 지리학적 참고사항(고도, 위도)

2) 시료채취 일자

3) 사용형태(예로써, 농업토양·삼림토양 등)

4) 시료채취의 깊이

5) 모래/실트/점토 함량

6) pH값(0.01 M 염화칼슘 용액에서)

7) 유기탄소의 함량

8) 유기물질의 함량

9) 질소의 함량

10) C/N의 비

11) 양이온교환능(mmol/kg)

2.2. 토양 시료의 수집과 저장에 관련되는 모든 정보

1) 시험물질의 흡착-탈착의 해석과 관련되는 모든 정보

2) 각 파라미터의 측정에 사용되는 방법에 관한 사항

3) 시험물질에 관한 정보

4) 시험의 온도

5) 원심분리의 조건

6) 시험물질의 분석에 사용되는 분석 절차

7) 시험물질 저장용액의 조제를 위해 용매화 시약을 사용해야 하는 타당성

8) 산정과 보정에 대한 설명

9) 데이터 정리표(주 67)와 도해에 사용한 데이터

10) 시험결과의 해석에 도움이 되는 모든 정보와 관찰사항

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* 주 37 : Lambert S.M., (1967), "Functional relationship between sorption in soil and chemical structure". J. Agri. Food Chem., 15, 572-576.

* 주 38 : Hance R.J., (1969), "An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils". J. Agri. Food Chem., 17, 667-668.

* 주 39 : Briggs G.G. (1969), "Molecular structure of herbicides and their sorption by soils". Nature, 223, 1288.

* 주 40 : Briggs G.G. (1981). "Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanolwater partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor". J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.

* 주 41 : Sabljic A., (1984), "Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutants by molecular topology". J. Agric. Food Chem., 32, 243-246.

* 주 42 : 정의 및 단위

기호	정의	단위
[eqn: A_{t}_{i}]	ti에서의 흡착 백분율	%
Aeq	흡착 평형상태에서 흡착 백분율	%
[eqn: m_{s}^{ads}(t_{i})]	ti에서 토양에 흡착된 시험물질의 질량	㎍
[eqn: m_{s}^{ads}(Δt_{i})]	Δti 동안 토양에 흡착된 시험물질의 질량	㎍
[eqn: m_{s}^{ads}(eq)]	흡착 평형상태에서 토양에 흡착된 물질의 질량	㎍
m0	흡착 시험이 시작되던 시점에 시험관 안에 있던 시험물질의 질량	㎍
[eqn: m_{m}^{ads}(t_{i})]	ti에서 분취액(aliquot)([eqn: v_{a}^{A}])에서 측정된 물질의 질량	㎍
[eqn: m_{aq}^{ads}(eq)]	흡착 평형상태에서 용액 안에 존재하는 물질의 질량	㎍
msoil	토양의 건조중량으로 표현된 토양상의 양	g
Cst	물질 저장 용액의 질량농도	㎍/㎤
C0	토양과 접촉해 있는 시험용액의 최초 질량농도	㎍/㎤
[eqn: C_{aq}^{ads}(t_{i})]	분석이 수행된 ti에서 수용상에 존재하는 물질의 질량농도	㎍/㎤
[eqn: C_{s}^{ads}(eq)]	흡착 평형상태에서 토양에 흡수된 시험물질의 조성	㎍/g
[eqn: C_{aq}^{ads}(eq)]	흡착 평형상태에서 수용상에 존재하는 물질의 질량농도	㎍/㎤
V0	흡착 시험동안 토양과 접촉했던 수용상의 최초 부피	㎤
[eqn: v_{a}^{A}]	시험물질이 측정된 분취액의 부피	㎤
Kd	흡착에 관한 분배계수	㎤/g
Koc	유기탄소 보정된 흡착계수	㎤/g
Kom	유기물 보정된 분배계수	㎤/g
[eqn: K_{F}^{ads}]	Freundlich 흡착계수	[eqn: ㎍^{1-1/n}(㎤)^{1/n}g^{-1}]
1/n	Freundlich 지수
[eqn: D_{t}_{i}]	ti에서의 탈착 백분율	%
[eqn: D_{Δt_{i}]	Δti에 따른 탈착 백분율	%
Kdes	겉보기 탈착계수	㎤/g

기호	정의	단위
[eqn: K_{F}^{des]	Freundlich 탈착계수	[eqn: ㎍^{1-1/n}(㎤)^{1/n}g^{-1}]
[eqn: m_{aq}^{des}(t_{i})]	ti에서 토양으로부터 탈착된 시험물질의 질량	㎍
[eqn: m_{aq}^{des}(Δt_{i})]	Δti동안 토양으로부터 탈착된 시험물질의 질량	㎍
[eqn: m_{m}^{des}(eq)]	탈착 평형상태에서 수용상 내에 존재하는 물질 질량 측정치	㎍
[eqn: m_{aq}^{des}(eq)]	탈착 평형상태에서 탈착된 시험물질의 총 질량	㎍
[eqn: m_{s}^{des}(Δt_{i})]	Δti후 토양에 흡착되어 남겨진 물질의 질량	㎍
[eqn: m_{aq}^{A}]	부피가 완전히 제거되지 않아서 발생한 흡착 평형상태로부터 남겨진 시험물질의 질량	㎍
[eqn: C_{s}^{des}(eq)]	탈착 평형상태에서 토양에 흡착되어 남겨진 시험물질의 조성	㎍/g
[eqn: C_{aq}^{des}(eq)]	탈착 평형상태에서 수용상 내에 존재하는 물질의 질량농도	㎍/㎤
VT	순차법으로 수행된 탈착 약동 시험(desorption kinetics experiment) 동안 토양과 접촉해 있던 수용상의 총 부피	㎤
VR	흡착 평형에 도달한 뒤 시험관에서 제거되고 같은 부피의 0.01 M CaCl2 용액으로 대체된 상청액의 부피	㎤
[eqn: v_{a}^{D}]	순차법으로 수행된 탈착 약동 시험동안, 시험관(i)에서 분석 목적으로 취해진 분취액의 부피	㎤
[eqn: V_{r}^{i}]	병행법으로 수행된 탈착 약동 시험동안 시험물질 측정을 위해 시험관(i)에서 취한 용액의 부피	㎤
[eqn: V_{r}^{F}]	탈착 평형상태에서 시험물질을 측정하기 위해 시험관으로부터 취한 용액의 부피	㎤
MB	질량수지	%
mE	토양 및 2 단계의 시험용기 벽면에서 추출한 시험물질의 총 질량	㎍
Vrec	흡착 평형상태 후 회수된 상청액의 부피	㎤
Pow	옥탄올/물 분배계수
pKa	해리상수
Sw	물에 대한 용해도	g/ℓ

* 주 43 : ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

* 주 44 : Scheffer F., and Schachtschabel P., Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.

* 주 45 : Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., eds. "Methods of Soil Analysis", Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

* 주 46 : Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 26, 305 (1962).

* 주 47 : ISO/DIS 10381-1 Soil Quality -- Sampling -- Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

* 주 48 : ISO/DIS 10381-2 Soil Quality -- Sampling -- Part 2: Guidance on sampling techniques.

* 주 49 : ISO/DIS 10381-3 Soil Quality -- Sampling -- Part 3: Guidance on safety of sampling.

* 주 50 : ISO/DIS 10381-4 Soil Quality -- Sampling -- Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.

* 주 51 : ISO/DIS 10381-5 Soil Quality -- Sampling -- Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

* 주 52 : ISO 10381-6, 1993: Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

* 주 53 : Green R.E., and Yamane V.K., (1970), "Precision in pesticide adsorption measurements". Soil Sci. Am. Proc., 34, 353-354.

* 주 54 : Grover R., and Hance R.J. (1970), "Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine". Soil Sci., 109-138.

* 주 55 : Boesten, J.J.T.I, (1990), "Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system". Pest. Sci., 30, 31-41.

* 주 56 : Boesten, J.J.T.I. " Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106" Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.

* 주 57 : 분석방법과 농도변화의 정확도가 흡착 결과치의 정확도에 미치는 영향

다음의 표에 의하면, 용액 중의 시험물질의 초기질량([eqn: m _{0} `=`110``` mu g])과 평형농도([eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)``=``100``` mu g])는 아주 적으므로 평형농도 측정치의 5 % 오차는 토양에 흡착되는 시험물질량([eqn: m _{s} ^{ads} (eq)``])의 산정에서는 50 %의 오차를 초래하고, Kd값의 산정에서는 52.4 %의 오차를 초래한다.

토양의 양            msoil =  10 g

용액의 부피          V0   =  100 ㎤

	[eqn: m_{aq}^{ads}(eq)] (㎍)	[eqn: C_{aq}^{ads}(eq)] (㎍/㎤)	R	[eqn: m_{s}^{ads}(eq)*] (㎍)	[eqn: C_{s}^{ads}(eq)] *(㎍/g)	R‡	Kd*	R‡
m0=110 ㎍ or C0=1.100 ㎍/㎤	A=9 % 일때
	100	1.000	참값	10	1.00	참값	1
	101	1.010	1 %	9	0.90	10 %	0.891	10.9 %
	105	1.050	5 %	5	0.50	50 %	0.476	52.4 %
	109	1.090	9 %	1	0.10	90 %	0.092	90.8 %
	A=55 % 일때
	50.0	0.500	참값	60.0	6.00	참값	12.00
	50.5	0.505	1 %	59.5	5.95	0.8 %	11.78	1.8 %
	52.5	0.525	5 %	57.5	5.75	4.0 %	10.95	8.8 %
	55.0	0.550	10 %	55.0	5.50	8.3 %	10.00	16.7 %
	A=99 % 일때
	1.100	0.011	참값	108.9	10.89	참값	990
	1.111	0.01111	1 %	108.889	10.88	0.01 %	980	1.0 %
	1.155	0.01155	5 %	108.845	10.8845	0.05 %	942	4.8 %
	1.21	0.0121	10 %	108.790	10.8790	0.10 %	899	9.2 %

* [eqn: m _{s} ^{ads} (eq)=m _{0} -m _{aq} ^{ads} (eq),`C _{s} ^{ads} (eq)= {[C _{0} -C _{aq} ^{ads} (eq)]V _{0}} over {m _{soil}} ,`K _{d} = {m _{s} ^{ads}(eq)} over {m_{aq}^{ads}(eq)} ×{ V_{0}} over {m_{soil} }]

[eqn: m _{s} ^{ads} (eq)``] = 평형에서의 토양상 내의 시험물질량, ㎍

[eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)``] = 평형에서의 수용상 내의 시험물질량. ㎍

[eqn: C _{s} ^{ads} (eq)``] = 평형에서의 토양 내의 시험물질 함량, ㎍/g

[eqn: C _{aq} ^{ads} (eq)``] = 평형에서의 수용상 내의 시험물질의 질량농도, ㎍/㎤

R  =  [eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)``]값의 산정에서 발생되는 분석오차

R‡  = 분석오차 R에 기인하는 계산오차

* 주 58 :  Kd 산정기법

1. Kd값을 추정하기 위한 산정기법은 Pow값, 물에 대한 용해도 자료, HPLC의 전도된 상의 적용으로 유도한 극성 데이터 등의 상관관계를 이용하고 있다. 아래의 표 1 및 표 2에서와 같이, 다음의 식으로부터 Koc값과 Kom값 및 Kd값을 산정할 수 있다.

[eqn: K _{oc} ``=`K _{d} `` BULLET {100} over {%oc} `(cm ^{3} /g)```````````````````K _{om} ``=` {K _{d}} over {1.724} BULLET {100} over {%oc} `(cm ^{3} /g)]

2. 위의 상관관계는 다음의 두 가지의 가정에 기반을 두고 있다.

(1) 토양의 유기물질은 주로 시험물질의 흡착에 영향을 미친다.

(2) 그러한 상호작용은 주로 비극성에 의해 발생된다.

결과적으로, 이러한 상관관계는 첫째로 (1)의 경우는 극성물질에 적용되지 않거나 어느 정도만 적용된다. 둘째로 (2)의 경우는 토양의 유기물질 함량이 극히 낮은 때에는 적용되지 않는다. 또한 Pow와 흡착 사이의 상관성이 충분하다고 할지라도, 수용해도와 흡착도 사이의 상관관계는 동일하지 않으므로, 그러한 조사는 모순적이다.

3. 흡착계수와 옥탄올/물 분배계수 및 물에 대한 용해도 사이의 상관성의 사례는 표 1과 표 2에서 제시한다.

표 1.  흡착분배계수와 옥탄올/물 분배계수 사이의 상관성의 사례

화합물	상관성	저자
치환된 요소	Kom=0.69+0.52logPow	Briggs(1981)
방향성 염소종	Koc=-0.779+0.904logPow	Chiou 등(1983)
살충제류	logKom=4.4+0.72logPow	Gerstl and Mingelgrin(1984)
방향족 탄화수소류	Koc=-2.53+1.15logPow	Vowles and Mantoura(1987)

표 2. 흡착분배계수와 물에 대한 용해도 사이의 상관성의 사례

화합물	상관성	저자
살충제류	logKom=3.8-0.561logSw	Gerstl and Mingelgrin (1984)
지방성, 방향족 염소계 물질	Kom=(4.040±0.038)-(0.557±0.012)logSw	Chiou 등(1979)
a-나프톨	logKoc=4.273-0.686logSw	Hasset 등(1981)
지방성 방향족 고리 화합물	logKoc=-1.405-0.921logSw-0.00953(mp-25)	Karickhoff (1981)
다양한 화합물	Kom=2.75-0.45logSw	Moreale van Blade (1982)

* 주 59 : 원심분리 조건의 선정

1. 원심분리 시간은 구형입자로 가정하면 다음의 식(1)로 구할 수 있다.

[eqn: t= { 9} over {2 }[ { η} over {ω^{2}r_{p}^{2}(ρ_{s}-ρ_{aq}) }]ln(R_{b}/R_{t})]          (1)

식의 단순화를 위해, 모든 파라미터는 g이나 ㎝ 등의 비-SI단위로 기술하였다.

여기에서, [eqn: omega] = 회전속도(= [eqn: 2 pi ``rpm/60),`rad/s]

rpm = 1 분당 회전수

[eqn: eta] = 용액의 점도, g/s/㎝

[eqn: r _{p}] = 입자의 직경, ㎝

[eqn: rho _{s}] = 토양의 밀도, g/㎤

[eqn: rho _{aq}] = 용액의 밀도, g/㎤

[eqn: R _{t}] = 원심분리기 로터의 중심으로부터 원심분리기 튜브 내의 용액의 상부까지의 거리, ㎝

[eqn: R _{b}] = 원심분리기 로터의 중앙으로부터 원심분리기 튜브의 바닥까지의 거리, ㎝

[eqn: R _{b} `-`R _{t`}] = 원심분리기 튜브 내의 토양/용액 혼합물의 길이, ㎝

를 나타낸다. 더욱 완전하게 원심분리 하기 위해서는 위의 산정 시간을 2 배로 적용하여 원심분리 하는 것이 좋다.

2. 실제적으로는 당해 시험 용액의 점도([eqn: eta])와 밀도([eqn: rho _{aq}])가 25 ℃에서의 물의 점도([eqn: eta ``=`8.95 TIMES 10 ^{-3} ```g/s/cm])와 밀도([eqn: rho _{aq} ``=``1.0``g/cm ^{3}])와 거의 같기 때문에 위의 식(1)을 아래처럼 간단하게 정리할 수 있다. 그러면 원심분리 시간은 다음의 식(2)가 된다.

[eqn: t= { 3.7} over {(rpm)^{2}×r_{p}^{2}(ρ_{s}-1) }ln { R_{b}} over {R_{t} }]           (2)

3. 위의 식(2)에서 보면, 직경 0.1 ㎛의 입자를 분리하기 위해 시간(t) 및 회전속도(rpm)와 같은 원심분리 조건을 결정하는 데는 다음의 두 파라미터가 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 즉 (1) 토양의 밀도와 (2) 원심분리기 튜브 내의 혼합물의 길이([eqn: R _{b} `-`R _{t}])이다. 말하자면, 그 혼합물의 길이는 용액의 상부로부터 원심분리기 시험튜브의 바닥에까지 토양 입자가 간여하는 거리이다. 고정된 부피에 대해서는, 튜브 내의 혼합물의 길이가 튜브의 직경의 제곱값에 따라 달라지게 되는 것이다.

4. 그림 1a에서는 다양한 토양밀도([eqn: rho _{s}])에 있어서의 원심분리 속도(rpm)에 대한 원심분리 시간(t)의 변동을 나타내고 있다. 그림 1b에서는 다양한 토양밀도([eqn: rho _{s}])에 있어서의 원심분리 튜브 내의 혼합물의 길이에 대한 원심분리 시간(t)의 변동을 나타내고 있다. 그림 1a에서 보면, 토양 밀도의 영향은 분명하다. 예로써, 전형적인 3,000 rpm의 원심분리 속도에 대해, 원심분리 시간은 토양밀도 1.2 g/㎤에서 240 분 정도이다. 이에 비해 토양밀도 2.0 g/㎤에서는 원심분리 시간이 단지 50 분에 지나지 않는다. 마찬가지로 그림 1b에서 보면, 전형적인 3,000 rpm의 원심분리 속도에 대해 혼합물의 길이 10 ㎝에서는 원심분리 시간이 50 분 정도이지만, 혼합물의 길이 1 ㎝에서는 그 시간이 단지 7 분에 지나지 않는다. 그러나 원심분리에서 혼합물의 길이를 적게 요구하고 원심분리 후의 상분리에서 시험자의 취급업무를 보다 용이하게 하는 최적의 상관성을 모색하는 일은 대단히 중요하다고 할 수 있다.

5. 토양/용액 상을 분리하기 위한 시험조건의 설정에 있어서, 제 3의 유사상인 콜로이드가 존재한다고 가정하는 일도 필요할 수 있다. 콜로이드 입자는 0.2 ㎛ 이하의 직경이므로 토양 현탁상에서 시험물질의 전체적인 흡착 메커니즘에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 위에서와 같은 방식으로 원심분리 하게 되면, 콜로이드는 수용상에 잔류하게 되어 수용상과 함께 분석되게 된다. 그러므로 콜로이드의 영향에 대한 정보가 빠져버리는 결과가 된다. 초고속 원심분리나 한외여과와 같은 설비를 이용하는 경우에는, 토양 내의 시험물질의 흡탈착에 있어서 콜로이드에 시험물질이 흡착될 수 있으므로 훨씬 깊이 있게 조사·시험해야 한다. 초고속 원심분리는 60,000 rpm의 회전속도를 가지고 한외여과는 100,000 daltons의 여과 공극을 가지므로, 토양·콜로이드·용액의 3 상을 분리할 수 있는 것이다. 그러므로 다음의 절에서 기술하는 시험 원리는 그에 따라 수정하여, 3 상에서의 화학물질의 분석이 가능하게 해야 한다.

그림 1a. 다양한 토양 밀도([eqn: rho _{s}])에서의 원심분리속도(rpm)에 따른 원심분리 시간(t)의 변화

(25 ℃, [eqn: R _{t} `=`10````cm`,```R _{b`} -R _{t} ``=`10````cm`,`` eta `=`8.95` TIMES `10 ^{-3} ````g/s/cm```,`` rho _{aq} `=`1.0````g/cm ^{3}])

그림 1b. 원심분리 튜브에서의 다양한 혼합물의 길이 [eqn: (R _{b} `-`R _{t} `)`=`L]에 대해 원심분리속도(rpm)에 따른 원심분리 시간(t)의 변화

(25 ℃, [eqn: R _{t} `=`10````cm`,``` eta `=`8.95` TIMES `10 ^{-3} ````g/s/cm```,`` rho _{aq} `=`1.0````g/cm ^{3} `,`` rho _{s} `=`2.0````g/cm ^{3}])

* 주 60 : Hance, R.J., (1967), "The speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides". Weed Research, 7, pp. 29-36.

* 주 61 : 흡착성 A(%) 및 탈착성 D(%)의 산정

본 수순에 관한 시간 모식도는 다음과 같다.

모든 계산 및 산정에 있어서 시험물질이 안정하며, 컨테이너의 벽면에 흡착되지 않는다고 가정한다.

1. 흡착성 A(%)

(a) 병행법

각 시간점(ti) 및 각 시험튜브(i)에 대한 흡착 백분율은 다음의 식으로 계산할 수 있다.

[eqn: A_{t}_{i}= { m_{s}^{ads}(t_{i})×100} over {m_{0} }(%)]              (1)‡

‡의 표지가 있는 식들은 직접법과 간접법에 모두 적용가능하지만, 그 표지가 없는 식들은 간접법에만 적용되는 식이다. 식(1)의 항의 값을 계산하는 식은 다음과 같다.

m0=C0×V0(㎍)          (2)

[eqn: m_{s}^{ads}(t_{i})=m_{0}-C_{aq}^{ads}(t_{i})×V_{0}(㎍)]           (3)

여기에서, [eqn: A _{t _{i}}] = ti에서의 흡착 백분율(%)

[eqn: m _{s} ^{ads} (t _{i} )] = 분석이 행해지는 ti에서의 토양의 시험물질량(㎍)

[eqn: m _{0}] = 시험 시작시의 시험관 내의 시험물질량(㎍)

[eqn: C _{0}] = 토양과 접촉하는 시험용액의 초기 질량농도(㎍/㎤)

[eqn: C _{aq} ^{ads} (t _{i} )] = 분석이 행해지는 ti에서의 수용상 내의 시험물질의 질량농도(㎍/㎤). 이러한 농도는 공시험 값을 참작하면서 분석적으로 측정한다.

[eqn: V _{0}] = 토양과 접촉하는 시험용액의 초기 부피(㎤)

흡착 퍼센트의 값 [eqn: A _{t _{i}}] 혹은 [eqn: C _{aq} ^{ads} (t _{i} )]을 시간에 대해 도시하고, 흡착 평형에 도달하는 시간을 측정한다. 이와 같은 사례는 그림 1과 그림 2에서 제시한다.

그림 1. 흡착 평형

그림 2. 시간에 대한 수용상에서의 시험물질의 질량 농도([eqn: C _{aq}])

(b) 순차법

특정한 시간 간격으로 수용상의 미량을 시험물질로 하여 측정한다고 하면, 흡착 절차는 다음의 식으로 나타낼 수 있다.

1) 각각의 시간 간격 동안 토양에 흡착되는 시험물질량은 다음의 식으로 산정할 수 있다.

가) 첫 번째의 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{1} `=`t _{1} ``-``t _{0}]에 대해

[eqn: m_{s}^{ads}(Δt_{1})=m_{0}-m_{m}^{ads}(t_{1})×( { V_{0}} over {v_{a}^{A} })]          (4)

나) 두 번째의 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{2} `=`t _{2} ``-``t _{1}]에 대해

[eqn: m_{s}^{ads}(Δt_{2})=m_{m}^{ads}(t_{1})×( { V_{0}} over {v_{a}^{A} })-m_{m}^{ads}(t_{2})×( {V_{0}-v_{a}^{A} } over {v_{a}^{A} })]         (5)

다) 세 번째의 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{3} `=`t _{3} ``-``t _{2}]에 대해

[eqn: m_{s}^{ads}(Δt_{3})=m_{m}^{ads}(t_{2})×( { V_{0}-v_{a}^{A}} over {v_{a}^{A} })-m_{m}^{ads}(t_{3})×( { V_{0}-2×v_{a}^{A}} over { v_{a}^{A}})]     (6)

라) 네 번째의 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{4} `=`t _{4} ``-``t _{3}]에 대해

[eqn: m _{s} ^{ads} ( DELTA t _{n} )=m _{m} ^{ads} (t _{n-1} ) TIMES ( {V _{0} -(n-2) TIMES v _{a} ^{A}} over {v _{a} ^{A}} )-m _{m} ^{ads} (t _{n} ) TIMES ( {(V _{0} -(n-1) TIMES v _{a} ^{A} )} over {v _{a} ^{A}} )]     (7)

2) 각 시간 간격 [eqn: A _{t _{i}}]에서의 흡착 백분율은 다음 식으로 산정한다.

[eqn: A_{Δt_{i}}= { m_{s}^{ads}(Δt_{i})} over {m_{0} }×100(%)]          (8)‡

한편, 각 시간점 ti에서의 흡착 백분율 [eqn: A _{t _{i}}]는 다음 식으로 산정할 수 있다.

[eqn: A_{t}_{i}= { sum _{ j=Δt_{1}} ^{Δt_{i} }m_{s}^{ads}(j) } over { m_{0}}×100(%)]         (9)‡

조사 및 시험의 필요성에 따라 흡착값 [eqn: A _{t _{i}}]과 [eqn: A _{TRIANGLE t _{i}}]를 시간에 대해 도시하고, 수착 평형이 도달하는 시간을 산정한다.

3) 평형시간 [eqn: t _{eq}]에서는

가) 토양에 흡착되는 시험물질의 질량은

[eqn: m_{s}^{ads}(eq)= sum _{ Δt_{i}=1} ^{n }m_{s}^{ads}(Δt_{i})]            (10)‡

나) 용액 내의 시험물질의 질량은

[eqn: m_{aq}^{ads}(eq)=m_{0}- sum _{ Δt_{i}=1} ^{n }m_{s}^{ads}(Δt_{i})]           (11)‡

다) 평형에서의 흡착 백분율은

[eqn: A_{eq}= { m_{s}^{ads}(eq)} over {m_{0} }×100(%)]          (12)‡

위에서 이용한 파라미터는 다음과 같이 정의한다.

[eqn: m _{s} ^{ads} ( TRIANGLE t _{1} )], [eqn: m _{s} ^{ads} ( TRIANGLE t _{2} )], ··· , [eqn: m _{s} ^{ads} ( TRIANGLE t _{n} )`] = 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{1} ``,`` TRIANGLE t _{2`} ``,`...,` TRIANGLE t _{n}]에서 토양에 흡착되는 시험물질의 양(㎍)

[eqn: m _{m} ^{ads} (t _{1} )`], [eqn: m _{m} ^{ads} (t _{2} )`], ··· , [eqn: m _{m} ^{ads} (t _{n} )`] = 시간점 [eqn: t _{1} ``,``t _{2`} ``,`...,`t _{n}]에서 미량의 시험액([eqn: nu _{a} ^{A}])으로 측정한 시험물질의 양(㎍)

[eqn: m _{s} ^{ads} (eq)`] = 흡착 평형에서 토양에 흡착되는 시험물질의 양(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)`] = 흡착 평형에서의 용액 내의 시험물질의 양(㎍)

[eqn: nu _{a} ^{A}] = 시험물질을 측정하는 미량의 시험액의 부피(㎤)

[eqn: A _{TRIANGLE t _{i}}] = 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}]에서의 흡착 백분율(%)

[eqn: A _{eq}] = 흡착 평형에서의 흡착 백분율(%)

2. 탈착성 D(%)

탈착속도론의 시험이 시작되는 시간 [eqn: t _{0}]의 시점은, 흡착 평형이 도달한 후에 시험물질 용액의 최대 회수 체적이 그와 동일한 0.01 M 염화칼슘 용액의 부피로 대체되는(채워지는) 시점이라고 생각한다.

(a) 병행법

시간점 [eqn: t _{1}]에서, 시험튜브 i[eqn: (V _{r} ^{i} )]와 탈착된 질량으로부터 취하여 측정되는 수용상의 시험용액의 질량은 다음 식(13)으로 산정한다.

[eqn: m _{aq}^{des}(t_{i})=m_{m}^{des}(t_{i})×( { V_{0}} over {V_{r}^{i} })-m_{aq}^{A}]             (13)

탈착평형점 [eqn: t _{i} `=`t _{eq}]에서는 [eqn: m _{aq} ^{des} (t _{i} )``=``m _{aq} ^{des} (eq)]이다. 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}] 동안에 탈착되는 시험물질량은 다음 식(14)으로 산정한다.

[eqn: m_{aq}^{des}(Δt_{i})=m_{aq}^{des}(t_{i})- sum _{ j=1} ^{i-1 }m_{aq}^{des}(j)]           (14)

탈착 퍼센트는 다음과 같이 산정한다

가) 시간점 ti에서는 다음의 식(15)을 적용한다.

[eqn: D_{t}_{i}= { m_{aq}^{des}(t_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]            (15)

나) 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}] 동안에는 다음 식(16)을 적용한다.

[eqn: D_{Δt}_{i}= { m_{aq}^{des}(Δt_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]           (16)

여기에서, [eqn: D _{t _{i}}] = [eqn: t _{i}]에서의 탈착 백분율(%)

[eqn: D _{TRIANGLE t _{i}}] = 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}]에 상당하는 탈착 백분율(%)

[eqn: m _{aq} ^{des} (t _{i} )] = [eqn: t _{i}]에서 흡착되는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{des} ( TRIANGLE t _{i} )] = 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}] 동안에 흡착되는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{m} ^{des} (t _{i} )] = 시간 [eqn: t _{i}]에서 분석을 위해 취하는 용액의 부피 [eqn: V _{r} ^{i}] 내에서 분석적으로 측정된 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{A}] = 부피가 완전하게 대체(채움)되지 못함으로 인하여 발생한 흡착평형에서 남아 있는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m_{aq}^{A}=m_{aq}^{ads}(eq)×( { V_{0}-V_{R}} over {V_{0} })]            (17)

[eqn: m _{aq} ^{ads} (eq)] = 흡착평형에 있어서 용액 내의 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: V _{R}] = 흡착평형의 도달 후에 시험관에서 제거되고 그 대신에 동일한 양의 0.01 M CaCl2 용액으로 채워지는 상청액의 부피(㎤)

[eqn: V _{r} ^{i}] = 탈착속도론 시험에서 시험물질을 측정하기 위해 시험관(i)로부터 취해지는 용액의 부피(㎤)

조사 및 시험의 필요성에 따라, 탈착성의 값 [eqn: D _{t _{i}}] 혹은 [eqn: D _{TRIANGLE t _{i}}]를 시간에 대해 도시하고, 탈착평형에 도달한 시간을 측정한다.

(b) 순차법

이미 진행된 흡착절차는 수용상의 미량 시험액 [eqn: nu _{a} ^{A}]중의 시험물질을 측정하면서 시행한다. 여기에는 두 가지의 가정이 있다: (a) 흡착속도론 시험 이후에 시험튜브로부터 제거되는 상청액의 부피는 그와 동일한 양의 0.01 M CaCl2 용액([eqn: V _{T}])으로 채운다 . (b) 탈착속도론 시험 동안 토양([eqn: V _{T}])과 접촉하는 수용상의 전체 부피는 일정하다. 이는 다음 식(18)으로 나타낸다.

[eqn: V_{T}=V_{0}- sum _{ i=1} ^{n }v_{a}^{A}(i)]            (18)

이 때, 시간점 [eqn: t _{i}]에서

1) 미량의 시험액([eqn: V _{a} ^{D}]) 내의 시험물질을 측정하고, 흡착된 질량은 다음 식(19)으로 산정한다.

[eqn: m _{aq} ^{des} (t _{i} )=m _{m} ^{des} (t _{i} ) TIMES ( {V _{T}} over {v _{a} ^{D}} )-m _{aq} ^{A} TIMES ( {(V _{T} -(i-1) TIMES v _{a} ^{D} )} over {V _{T}} )]        (19)

2) 탈착평형 [eqn: t _{i} ``=``t _{eq}]에서는 [eqn: m _{aq} ^{des} (t _{i} )``=`m _{aq} ^{des} (eq)] 이다.

3) 흡착 백분율 [eqn: D _{t _{i}}]는 다음 식(20)으로 산정한다.

[eqn: D _{t}_{i}= { m_{aq}^{des}(t_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]           (20)

시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{i}]에서;

1) 각 시간 간격 동안에 흡착되는 시험물질의 양은 다음과 같이 산정한다.

가) 첫 번째 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{1`} `=`t _{1} ``-``t _{0}]에서는

[eqn: m _{aq} ^{des} ( DELTA t _{1} )=m _{m} ^{des} (t _{1} ) TIMES ( {V _{T}} over {v _{a} ^{D}} )-m _{aq} ^{A} ```and```m _{s} ^{des} (t _{1} )=m _{s} ^{aq} (eq)-m _{aq} ^{des} ( DELTA t _{1} )]      (21)

나) 두 번째 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{2`} `=`t _{2} ``-``t _{1}]에서는

[eqn: m _{aq} ^{des} ( DELTA t _{2} )=m _{m} ^{des} (t _{2} ) TIMES ( {V _{T}} over {v _{a} ^{D}} )-m _{aq} ^{des} ( DELTA t _{1} ) TIMES ( {(V _{T} -v _{a} ^{D} )} over {V _{T}} )-m _{aq} ^{A} TIMES ( {(V-v _{a} ^{D} )} over {V _{T}} )]  and

[eqn: m_{s}^{des}(t_{2})=m_{s}^{des}(eq)-[m_{aq}^{des}(Δt_{1})+m_{aq}^{des}(Δt_{2})]]             (22)

다) [eqn: n ^{th}] 시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{n`} `=`t _{n} ``-``t _{n-1}]에서는

[eqn: m _{aq} ^{des} ( DELTA t _{n} )=[m _{m} ^{des} (t _{n} ) TIMES ( {V _{T}} over {v _{a} ^{D}} )-m _{aq} ^{A} TIMES ( {(V _{T} -(n-1) TIMES v _{a} ^{D} )} over {V _{T}} )- sum _{i=1,``n != 1} ^{n-1} ( {(V _{T} -(n-i) TIMES v _{a} ^{D}} over {V _{T}} ) TIMES m _{aq}^{des}(Δt_{i})]]

and [eqn: m _{s} ^{des} (t _{n} )=m _{s} ^{ads} (eq)- sum _{i=1,```n!= 1} ^{n}m_{aq}^{des}(Δt_{i})]          (23)

2) 마지막으로, 각 시간 간격 [eqn: D _{TRIANGLE t _{i}}]에서의 탈착 백분율은 다음 식(24)으로 산정한다.

[eqn: D_{Δt_{i}}= { m_{aq}^{des}(Δt_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]             (24)

시간 간격 [eqn: t _{i}]에서의 탈착 백분율 [eqn: D _{t _{i}}]는 다음 식(25)으로 산정한다.

[eqn: D_{t_{i}}= { sum _{ j=Δt_{1}} ^{Δt_{i} }m_{aq}^{des}(j) } over {m_{s}^{ads} }×100= { m_{aq}^{des}(t_{i})} over {m_{s}^{ads}(eq) }×100(%)]         (25)

여기에서 이용한 파라미터는 다음과 같이 정의한다.

[eqn: m _{s} ^{des} ( TRIANGLE t _{1} ),``m _{s} ^{des} ( TRIANGLE t _{2} ),`.....`,`m _{s} ^{des} ( TRIANGLE t _{n} )``=``]시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{1} `,`` TRIANGLE t _{2} `,.....,` TRIANGLE t _{2} ``]이후에 토양에 흡착되어 잔류하는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{aq} ^{des} ( TRIANGLE t _{1} ),``m _{aq} ^{des} ( TRIANGLE t _{2} ),`.....`,`m _{aq} ^{des} ( TRIANGLE t _{n} )``=``]시간 간격 [eqn: TRIANGLE t _{1} `,`` TRIANGLE t _{2} `,.....,` TRIANGLE t _{2} ``]동안에 탈착되는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m _{m} ^{des} ( TRIANGLE t _{1} ),``m _{m} ^{des} ( TRIANGLE t _{2} ),`.....`,`m _{m} ^{des} ( TRIANGLE t _{n} )``=``]시간점 [eqn: t _{1} `,``t _{2} `,.....,`t _{2} ``]에서의 분취액([eqn: V _{a} ^{D}]) 으로 측정한 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: V _{T} ````=```]순차법으로 수행한 탈착속도론 시험 동안 토양과 접촉하는 수용상의 총 부피(㎤)

[eqn: m _{aq} ^{A} ```=```]부피를 완전하게 대체하지 못함으로 인해 흡착평형에서부터 남아 있는 시험물질의 질량(㎍)

[eqn: m_{aq}^{A}=( { (V_{0}- sum _{ i=1} ^{n }v_{a}^{A}(i))-V_{R} } over {(V_{0}- sum _{ i=1} ^{n }v_{a}^{A}(i) })×m_{aq}^{ads}(eq)]            (26)

VR = 흡착평형 이후에 시험관에서 제거되어 동일한 양의 0.01 M CaCl2 용액으로 대체, 즉 채워지는 상청액의 부피(㎤)

[eqn: V _{a} ^{D} ```=```]순차법으로 수행되는 탈착속도론 시험 동안, 시험관(i)으로부터 분석 목적으로 시료채취 되는 분취액의 부피(㎤)

[eqn: v_{a}^{D}≤0.02×V_{T}]            (27)

* 주 62 : Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), "The retention processes: mechanisms" in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.

* 주 63 : Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), "Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses", in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser., 259, American Chemical Society, Washington, DC.

* 주 64 : Giles C.H., (1970), "Interpretation and use of sorption isotherms" in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, 14-32.

* 주 65 : Giles C.H., McEwan J.H., Nakhwa S.N., and Smith D., (1960), "Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils". J. Chem. Soc., 3973-93.

* 주 66 : Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), "Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l’'adsorption". Ann. Agron., 31, 239-251.

* 주 67 : 토양 흡착-탈착의 데이터 보고 양식

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

분석법 타당성

토양 무게	g
토양 : 건조 질량	g
CaCl2 용액 부피	㎤
최종 용액 예상 농도	㎍/㎤
최종 용액 분석 농도	㎍/㎤

분석법의 원리 :

분석법의 보정 :

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

사용한 분석기법 :

직접법

간접법

병행법

순차법

흡착 시험 : 시험 시료

	기호	단위	평형시간		평형시간		평형시간		평형시간
시험관 번호
토양 무게	-	g
토양 : 건조질량	msoil	g
토양 내 물 부피	VWS	㎤
0.01 M CaCl2 부피		㎤
저장용액 부피		㎤
토양접촉 수용상 총 부피	V0	㎤
시험용액 최초농도	C0	㎍/㎤
시험시작시 시험물질 질량	m0	㎍
원심분리 및 교반 후
간접법
병행법
공시험 보정 후 수용상 내 시험물질의 농도	[eqn: C _{aq} ^{ads} (t _{i} )]	㎍/㎤
순차법
분취액[eqn: v_{a}^{A}] 내 시험물질 측정 질량	[eqn: m _{m} ^{ads} (t _{i} )]	㎍
직접법
토양에 흡수된 시험물질 질량	[eqn: m _{s} ^{ads} (t _{i} )]	㎍
흡착 계산
흡착	[eqn: A _{t _{i}}]	%
	[eqn: A _{DELTA t _{i}}]	%
평균
흡착계수	Kd	㎤/g
평균
흡착계수	Koc	㎤/g
평균

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

흡착 시험 : 공시료 및 대조군

	기호	단위	공시료		공시료		대조군
시험관 번호
토양 무게		g
토양 중 물의 양		㎤
0.01 M CaCl2 첨가부피		㎤
시험물질 첨가 저장용액 부피		㎤
수용상 총 부피		㎤
수용상 내 시험물질의 초기농도		㎍/㎤
원심분리 및 교반 후
수용상 내 농도		㎍/㎤

주의사항 : 필요한 경우 컬럼을 추가한다.

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

질량수지

	기호	단위
시험관 번호
토양 무게	-	g
토양 : 건조질량	msoil	g
토양 내 물 부피	VWS	㎖
0.01 M CaCl2 부피		㎖
저장용액 부피		㎤
토양접촉 수용상 총 부피	V0	㎤
시험용액 최초농도	C0	㎍/㎤
평형상태 도달 시간	-	h
원심분리 및 교반 후
흡착 평형에서 공시험 보정 후 수용상 내 시험물질의 농도	[eqn: C _{aq} ^{ads} (eq)]	㎍/㎤
평형상태 도달 시간	teq	h
제거된 수용상 부피	Vrec	㎤
추가된 용매 부피	ΔV	㎤
첫 번째 용매 추출
용매 내 신호 분석	SE1	var.
용매 내 시험물질 농도	CE1	㎍/㎤
토양과 시험용기 벽면에서 추출한 물질 질량	mE1	㎍
두 번째 용매 희석
제거된 용매 부피	ΔVs	㎤
추가된 용매 부피	ΔV'	㎤
두 번째 용매 추출
용매상 신호 분석	SE2	var.
용매 내 시험물질 농도	CE2	㎍/㎤
토양과 시험용기 벽면에서 추출한 물질 질량	mE2	㎍
두 단계에서 추출된 시험물질 총 질량	mE	㎍
질량수지	MB	%

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

흡착 등온선

	기호	단위
시험관 번호
토양 무게	-	g
토양 : 건조질량	msoil	g
토양 내 물 부피	VWS	㎖
0.01 M CaCl2 부피		㎖
첨가된 저장용액 부피		㎤
토양접촉 수용상 총 부피	V0	㎤
용액 농도	C0	㎍/㎤
평형상태 도달 시간	-	h
원심분리 및 교반 후
공시험 보정 후 수용상 내 시험물질의 농도	[eqn: C _{aq} ^{ads} (eq)]	㎍/㎤
온도	teq	h
단위 토양 당 흡수 질량

회귀분석 :

[eqn: K _{F}^{ads}]값 :

1/n값 :

회귀계수 r2 :

시험물질 명 :

시험 토양 :

토양 건조 질량 조성(105 ℃, 12 h) : ......................................................................%

온도 : ..............................................................................................................................℃

사용한 분석기법 :

간접법

병행법

순차법

탈착 시험

		기호	단위	시간 간격	시간 간격	시간 간격	시간 간격
흡착단계에서의 시험관 번호
흡착평형에서 토양에 흡수된 물질 질량		[eqn: m _{s} ^{ads} (eq)]	㎍
0.01 M CaCl2로 대체한 수용상 부피		VR	㎤
토양과 접촉한 수용상 총 부피	PM	V0	㎤
	SM	VT	㎤
흡착평형 중 부피 대체가 완전하지 못하여 남겨진 시험물질 질량		[eqn: m _{aq} ^{A}]	㎍
탈착 약동
ti에서 토양으로부터 탈착된 물질 측정 질량		[eqn: m _{m} ^{des} (t_{i})]	㎍
시험물질 측정을 위해 시험관(i)으로부터 취한 용액 부피	PM	[eqn: V _{r} ^{i}]	㎤
	SM	[eqn: v _{a} ^{D}]	㎤
ti에서 토양으로부터 탈착된 물질 질량		[eqn: m _{aq} ^{des} (t_{i})]	㎍
Δti 동안 토양으로부터 탈착된 물질 질량		[eqn: m _{aq} ^{des} (Δt_{i})]	㎍
탈착 백분율
ti에서의 탈착율		[eqn: D _{t} _{i}]	%
Δti에서의 탈착율		[eqn: D _{Δt} _{i}]	%
겉보기 탈착계수		Kdes

PM : 병행법

SM : 순차법

* 주 68 : ASTM Standards, E 1195-87, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.

제 7 항  플라스크 진동법을 이용한 분배계수(n-옥탄올/물)             시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 화학물질의 환경적 거동(environmental fate) 연구에서 핵심이 되는 파라미터인 Pow(옥탄올/물 분배계수)를 플라스크 진동법을 사용하여 구하는 것에 있다. 어류에서 어떠한 물질의 Pow와 체내 생물학적 축적량 간에 상관관계가 높다는 사실이 증명되었다. 또한 Pow는 토양과 침전물에서의 흡수를 예측하고 광범위한 생물학적 효과에 관한 구조-활성 관계를 정량적으로 수립하는데 유용한 것으로 알려져 있다.

본 시험법을 이용하면 -2에서 4 사이의 log Pow 범위 내에 있는 Pow값을 측정할 수 있고, 0에서 6 사이의 log Pow 범위 내에 있는 Pow값들은 HPLC를 사용해서 측정할 수 있다.

시험을 수행하기 전에 Pow의 추정치를 제 17 항의 주를 참조하여 계산하거나, 순수한 용매에 대한 시험물질의 용해도 비를 고려하여 계산해 둔다. 또한 Pow를 측정하기 전에 구조식, 해리상수, 물에 대한 용해도, 가수분해, n-옥탄올 용해도, 표면장력 등에 관한 정보를 사전에 확보해 두면 시험을 효율적으로 수행하는데 도움이 될 것이다.

2. 시험의 제한사항

본 시험에서 사용되는 표준물질과 시험물질은 가장 순도가 높은 것을 사용해야 하며, 반드시 분석용 등급의 n-옥탄올과 증류수 또는 이차증류수를 사용하여야 하고 이온교환수지에서 직접 취한 물을 사용해서는 아니 된다. 한편, 시험물질에 존재할 수도 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다.

3. 정의

분배계수(P)는 서로 섞이지 않는 두 용매로 구성된 2 상 시스템에 용해된 시험물질의 평형 농도 비율로서 정의된다. n-옥탄올(n-octanol)과 물의 경우,

Pow=[eqn: {C _{n-옥탄올}} over {C _{물}}]

와 같이 정의되며, 두 농도의 지수가 되는 분배계수는 무한하거나 10을 밑(base)으로 하는 정상 로그치 형태로 표현한다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

2. 시험법 원리

묽은 용액의 경우, 일정한 온도, 압력, pH에서 Nernst 분배법칙을 적용한다. Nernst 분배법칙은 순수한 물질이 두 순수한 용매에 분산되어 있는 경우, 그리고 용질의 각 상에 존재하는 용질의 농도가 0.01 mol/ℓ 이상이지 않을 때에만 적용된다. 만일 몇 가지 서로 다른 용질들이 동시에 하나의 상 또는 두 상에 존재하게 된다면, 결과에 영향을 줄 수 있다. 용해된 분자의 분해나 결합에 따라 분배법칙과 다른 결과를 야기할 수 있다. 그런 편차가 생긴다는 사실은 분배계수가 농도에 의존하게 된다는 사실을 나타낸다. 이온화될 수 있는 물질을 측정해야 할 경우에는 반드시 최소 한 단위 이하의 pH값(자유산)이나 한 단위 이상의 pK값(자유염기)을 나타내는 적절한 완충액을 사용하여 물질을 비이온화된 형태(자유산 또는 자유염기)로 만든 다음에 측정을 실시해야 한다.

3. 시험 방법

3.1. 시험물질과 용매

본 시험에는 반드시 분석용 등급의 n-옥탄올과 증류수 또는 이차증류수를 사용하여야 하며 이온교환수지에서 직접 취한 물을 사용해서는 아니 된다. 물로 포화된 n-옥탄올에 녹인, 농도를 알고 있는 시험물질 저장용액을 준비한다. 저장용액을 보관함에 있어 저장용액의 안정성이 유지될 수 있는 환경 하에서 저장하여 추후 분석에 사용한다.

분배계수를 측정하기 전에 두 가지 용매를 시험온도에서 포화시켜 놓는다. 이를 위해서, 과량의 물과 적정량의 n-옥탄올을 담은 커다란 저장용기를 준비하고 나머지 하나는 과량의 n-옥탄올과 적정량의 물을 담은 커다란 저장용기를 준비하여 24 시간 동안 흔들어 준 다음, 상이 분리될 수 있도록 충분한 시간 동안 방치해 둔다.

3.2. 시험조건

시험은 20~25±1 ℃ 조건 하에서 수행한다. 첫 번째 시험을 수행하기 위해서, 물에 대한 n-옥탄올의 부피와 물질의 양은 아래와 같은 권장기준을 가지고 선택한다.

(1) 분배계수 예비평가

(2) 분석과정 동안 각 상 마다 요구되는 시험물질 최소농도

(3) 각 상 0.01 mol/ℓ에 대한 시험물질의 최대농도

두 번째 시험에서는 원래 선택한 부피 비의 반으로 시험을 수행하고, 그 다음 시험에서는 원래 부피의 두 배로 늘려 시험한다. 두 번째 및 세 번째 시험에서 첨가되는 물질의 양은 상기 언급한 기준치를 충족시키기 위하여 사용한 물질의 양과는 다를 수 있음을 유념하여야 한다. 분석의 정확성을 확보하기 위하여 위에 언급된 세 차례의 시험을 수행하는데 동일한 시료를 담은 용기 두 개를 사용하여 측정한다.

3.3. 부분평형 설정

두 개의 상은 시험용기의 전체 부피를 채워야 하며 그렇게 해야 증발에 의한 손실을 막을 수 있다. 시험용기는 자동 쉐이커를 이용하여 흔들어 주거나 손으로 흔들어 준다. 원심분리기를 사용할 경우 고정된 로터가 아닌 180 도까지 샘플용기가 회전할 수 있는 스윙로터를 사용하여 최소한 5 분에 100 회 회전하도록 원심분리 시킨다.

3.4. 상 분리

일반적으로 두 가지 상으로 분리하는 작업은 원심분리를 통하여 수행하는데, 이 때 원심분리는 시험온도 하에서 수행하는 것이 좋다. 만약 온도 조절이 되지 않는 원심분리기를 사용할 경우에는 분석 시작 최소 1 시간 전에 원심분리 튜브를 시험 온도와 동일하게 맞춘 후 원심분리한다.

3.5. 분석

상기 원심분리를 통하여 분리된 2 개 상 모두에서 시험물질의 농도를 구하되, 측정하고자 하는 물질의 특성에 적합한 분석방법을 선택하여야 한다. 통상적으로 광학측정기(photometry), GC, HPLC 등의 적절한 방법으로 분석하고 원래 첨가되었던 농도와 비교하고 계산한다.

수용액은 n-옥탄올 혼입을 최소화하여야 하는데 이를 위하여 일회용 주사기를 사용할 수 있다. 주사기 시린지에는 공기가 채워져 있는데, n-옥탄올 층이 통과하면서 공기를 천천히 밀어낸다. n-옥탄올 층을 통과한 뒤 원하는 시료를 채취하고 신속하게 다시 n-옥탄올 층을 역으로 통과시킨 뒤 일회용 주사침을 제거하면 오염을 방지할 수 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

Pow값은 각 시험별로 산출된 데이터들을 이용하여 계산한다. 서로 다른 용매 비율로 3 회 중복 시험하거나 시험물질의 양을 서로 달리하는 등의 시험조건 하에서 결과 산출에 사용될 여섯 개의 수치들을 얻는다. 이 때, 얻어진 여섯 개의 log Pow값들은 ±0.3 단위 내의 범위 안으로 들어와야 한다.

2. 시험 보고서

시험보고서에는 다음의 내용을 수록하여야 한다.

(1) 화학물질의 특성과 불순물

(2) 예비시험 결과(계면활성물질과 같이 플라스크 진동법을 적용할 수 없는 경우, 각각의 n-옥탄올과 물에 대한 용해도에 기반하여 계산된 수치들을 제공하여야 한다.)

(3) 결과를 해석하는데 있어 관련 있는 모든 정보, 특히 불순물이나 시험물질의 물리적 상태와 관련된 정보들

(4) 시험조건 : 온도, 시험용기에 들어갈 시험물질의 양, 각 용기별 상의 부피 및 분석 데이터에 기반한 시험물질의 계산된 총 량

(5) 실험 중 사용된 물과 수용액 상의 pH

(6) 완충용액 사용에 관한 정의 ; 완충용액의 조성, 농도 및 pH ; 실험전과 실험후 수용액상의 pH

(7) 원심분리가 사용된 경우 원심분리한 시간 및 속도

(8) 분석 수순

(9) 각 시험마다 측정된 농도(총 12개 농도)

(10) Pow값과 각 시험조건 별 평균 및 전체 평균(분배계수에 따라 제시된 농도가 있을 경우 기재할 것)

(11) 평균에 대한 Pow값 각각의 표준편차

(12) 밑을 10으로 하는 정상 로그치로서 표현된 전체 평균

(13) 계산되거나 측정된 수치가 104 이상일때의 이론적 Pow

제 8 항  물에서의 복합체 형성능력 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험의 목적은 수중의 어떠한 금속에 새로운 화학물질이 접근한 경우 복합체를 형성하는 능력을 측정하는 데 있다. 새로운 화학물질이 가용성 금속 복합체를 형성하는 능력은 금속이 다른 금속과 연쇄를 이루는 능력을 증가시킬 수 있는데, 카드뮴, 구리, 코발트, 크롬, 납, 아연 등과 같은 중금속에 있어 이러한 사실은 매우 중요하다. 어떤 물질이 이와 같은 금속들과 복합체를 형성하는 능력은 복합체 안정도 상수 측정을 할 수 있는 폴라로그래피 기술을 이용하여 평가할 수 있다.

폴라로그래피 방법은 물의 용해도가 10-5 M 이상의 물질에 적용한다. 반파 전위(half-wave potential) E1/2가 바뀌는 것은 적정 수은 전극에서 가역적으로 발생하는 반응에 의해 측정할 수 있다. 적절한 조정과정을 거친다면 가끔씩은 비가역적인 경우일지라도 측정이 가능한 경우도 있다. 예를 들면, Gelling 시험법(주 1)은 비가역적인 환원 데이터로부터 가역적인 과정에 관한 E1/2값을 계산하는데 적용할 수 있다. 또한 준가역(quasi-reversible) 시스템에서는 Grabaric 등(주 1)이 제안한 시험법을 사용하면 편리하게 측정할 수 있다.

본 시험법을 수행하려면 구조식에 대한 정보가 필요하며 적합한 분석법, 물에 대한 용해도, 해리 상수에 대해 미리 파악해 두면 도움이 된다.

2. 시험의 제한사항

본 시험법은 화학물질의 물에 대한 용해도가 10-5 M 이상인 경우에만 적용가능하며 시험대상 화학물질의 형태는 가장 순수한 형태의 것만을 사용해야 한다. 그리고 본 시험법으로 수은 화합물에 대한 측정을 하는 것은 불가능하다.

3. 정의

적정 수은전극 전위 에너지 E는 다음 식으로 나타낸다.

E=E°-[eqn: {RT} over {nF}]ln[eqn: {[M_{a}]} over {[M_{s}]}]

여기에서, E° : 표준 전극 전위

R : 기체상수

T : 절대온도

n : 전극 과정에 포함된 전자 수

F : 패러데이 상수(Faraday constant)

[Ma], [Ms] : 아말감 내에 존재하는 금속의 농도 및 전극 표면에 존재하는 금속 농도

를 나타낸다.

위에 주어진 관계식이 의미하는 바는 자유금속 이온의 확산계수와 복합체의 확산계수가 같다는 것이다.

Mn++pXb-⇌MXp(n-pb)+

은 아래와 같이 주어지는데,

k=[eqn: { [MX_{p}(n-pb)+]} over{ [M^{n+}][X^{b-}]^{P} }]

여기서 Xp는 등위차수를 나타낸다.

복합물 형성 상수는 온도와 확산계수에 의존한다. 위 식들의 연계에 의해 아래의 식이 얻어지는데, 아래의 식은 25 ℃에서 복합체의 가역적인 환원에 적합한 식이다.

E1/2=Em-[eqn: {0.0591}over{m}]logK[X]p

여기에서, E1/2 : 복합체의 반파 전위 (v)

Em : 착화제의 부재 시 금속이온 전위

X : 시험물질의 농도

를 나타낸다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위하여 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다. 아래 제시된 물질들은 본 시험에서 주로 사용되는 표준물질들이다.

(1) EDTA

(2) nitrilotriacetic acid

(3) thioglycolic acid

(4) σ-nitrophenol

2. 시험법 원리

이 방법은 금속이온이 복합체를 형성하면 음(negative)의 상태로 환원된다는 사실에 기초한다. 이따금 양의 상태로 전환되는 경우도 있지만, 그런 경우는 다른 이온이 과량의 복합체 형성제와 결합할 수 있는 능력이 있는 용액 내에 존재할 경우에만 그러하다. 전류가 확산 전류의 반인 폴라로그래픽 파동 상 지점에서의 기전력을 “반파 전위”(E1/2)라 한다. 이 파라미터는 각 금속이온에 관한 특성 상수이다. 복합체 형성 물질이 존재하는 상태에서 E1/2이 변하는 범위는 농도만이 아니라 복합체의 안정성에도 의존한다. 물질농도에 관한 함수로서의 E1/2을 측정하는 데에는 일부 금속 복합체 안정도  상수와 공식 모두를 사용할 수 있다. 이 때, E1/2은 전체적으로 복합체 형성에서 기인하는 것으로 가정하며, 액간 접촉 전위(liquid junction potential)로부터는 배제된 것으로 가정한다.

3. 품질기준

3.1. 반복성

일반적인 조건(특히, 10-3~10-4 M 농도 범위의 금속이온으로 시험 수행 시) 하에서 결과가 ±0.2 % 라면 반복성이 양호하다고 판단할 수 있다. 이 때 온도계수는 대략 온도 1 ℃ 당 1.5~2 %이다. 그러므로 정확한 측정을 위해서는 온도 편차가 ±0.2 ℃ 이내로 조절되어야 한다.

3.2. 감도

시험의 감도는 시험에 사용하기로 채택된 시험의 특정한 수순에 따라 달라지며, 일반적으로 금속이온농도를 10-5 M로 다운시키면 측정할 수 있다.

3.3. 특이성

본 시험법은 10-5 M 이상 농도에서 안정된 수용액을 형성하는 능력을 지닌 물질에 적용할 수 있다.

3.4.  표준화 가능성

표준화될 가능성이 있다.

3.5. 자동화 가능성

자동화될 수 있는 가능성에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.

4. 시험 방법

4.1. 시험 공정법

4.1.1 준비

시험에 사용하기에 적절한 폴라로그래피 기기에 대한 모든 사항은 주 1~8에 자세히 기술되어 있으니 참고한다.

4.1.2. 시험조건

적정전극으로 사용되는 수은은 재증류 등급(redistilled commercial grade) 이상의 순도를 지니고 있어야 하며 사용 전에 정제해야 한다. 시험용액은 완충처리(well-buffered) 한다(주 2). 전류-전극 전위곡선을 측정하기 전에 10~15 분 정도 고순도 질소를 사용하여 탈산소시킨다. 시험하려는 화학물질 농도 4 개 중 가장 낮은 농도가 금속이온농도로 알려진 것이 되도록 한다. 시험에 사용하는 용액들은 대부분 정밀한 뷰렛으로 폴라로그래픽 셀 안에서 편리하게 조제할 수 있다. 시험할 화학물질은 금속이온농도의 25 배를 초과하는 양 이상이 존재해야 하며 그렇게 되면 전극 표면에 존재하는 농도가 용액 안에 있던 농도와 같아질 것이다. 전류는 -0.2 V에서 -1.0 V의 범위 내에서 적용된 전위에서 측정하여야 한다.

천천히 형성된 복합체를 검출해 내기 위해서는 용액을 최소 24 시간 이상 질소 하에 방치해 두고, 복합체가 형성되는 것이 원래 측정에서 종료되었는지를 확인하기 위해서 충분한 수의 시료로 재시험해 보아야 한다.

최대 폴라로그래피를 억제하기 위해서 완충용액이나 계면활성제를 사용하려 한다면 신중하게 고려해야 하는데, 그 이유는 화학반응에서 예상하지 못한 효과나 폴라로그래피 곡선 상에서 나타날 수 있는 원치 않은 결과를 피하기 위함이다.

4.2. 시험 수행

폴라로그래피 기법을 수행하는 자세한 내용은 주 1~8까지에 기술되어 있는데, 시험을 수행할 때의 온도는 25±0.2 ℃에서 진행해야 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

안정도 상수 K는 log[X]P에 대해서 E1/2를 도시함으로써 쉽게 측정할 수 있으며 [X]=1.0 M에 외삽함으로써 측정할 수 있다. 만일 직선이 얻어진다면(경사도 0.0591 ℓ/n) 1 : 1 복합체가 형성되는 것으로 가정한다. 반응이 비가역적이거나 평형상태에서 2 개 또는 그 이상의 복합체들이 형성되면 완만한 곡선이 그려질 수 있다. 마지막에 제시된 경우에는 단계형성 상수를 계산하는 데에 De Ford and Hume 시험법(주 3)을 적용해야 한다.

2. 시험 보고서

시험을 수행한 각 금속이온에 대하여 조사된 반파장 기전력 E1/2과 등위차수 그리고 전체적인 안정도 상수를 시험보고서에 수록하도록 한다. 아울러 아래와 같은 내용을 시험 보고서에 수록한다.

(1) 극성 마이크로 전극의 형태, 표준 전극, 적정 수은 전극, 유량비율(㎎/sec), 방울 수명(drop time)

(2) IR 보정

(3) 최대 억제제

(4) 지지 전해질

(5) 완충액

(6) 측정온도

(7) 전체 이온 세기

(8) 사용된 기법

(9) 시험 수행 중 기술적 문제점

(10) 예상 정확도

(11) 사용된 폴라로그래픽 기법

3. 고찰 및 평가

새로운 물질의 안정도 상수를 얻게 되면 표준물질의 값(앞서 언급된 표준물질 항 참조)과 문헌상으로 비교해본 후 복합체 형성 능력(complexing capacity) 세기를 평가한다.

이 시스템은 (a) 안정도 상수가 양이고 (b) 표준 오차가 이 상수보다 작다면 의미를 가질 수 있다(판단 기준으로서 t-test를 수행해야 한다).

데이터가 유의성이 없다면 분광 광도법이나 NMR 등과 같은 다른 물리화학적 시험원리에 기반한 방법들을 사용할 필요도 있다.

* 주 1 : B. Grabaric, M. Tkalcec, I. Piljac, I. Filipovic, V. Simeon, "Numerial Evaluation of Complex Stability Constanrs for Polarographic Data Series, for Quasi-Reversible Processes", Anal. Chim. Acta, 74,147, (1975)

* 주 2 : D.D. Perrin, B. Dempsey, Buffer for pH and Metal Ion Controls, Chapman and Hall, London, (1974)

* 주 3 : D.D De Ford, D.N. Hume, "The Determination of Consecutive Formation Constants of Complex Ions from Polarographic Data", J. Amer. Chem. Soc., 73,5321 (1951)

* 주 4 : A.I. Vogel and J. Basset, Vogel's Textbook of Qualitative Inorganic Analysis, Chapter XIX, 4th Ed., Wiley, New york(1965)

* 주 5 : D.R. Crow, J.V. Westwood, "The Study of Complexed Metal Ions by Polarographic Methods", Quart.Rev. 19, 51, (1965)

* 주 6 : H. Irving, "The Stabiloty of Metal Complexrces and Their Measurement Polarographically", in Advances in Polarography - Proceedins of the 2nd International Congress, I.S.Langmuir (ed), Pergamon-Press,(1960)

* 주 7 : "Stability Constants of Metal-ion Complexes", Part B: Organic Ligands, Compiled by D.D. Perrin, IUPAC Publication on Chemical Data Series, No. 22, Pergamon Press, (1979)

* 주 8 : I.Piljac, B. Grabaric, I. Filipovic, "Improved Technique for Determination of Stability Constants by Polarographic Method", J. Electroanal. Chem. Interfacal Electrochem, 42, 433 (1973)

제 9 항  고체, 액체 밀도 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 다양한 방법을 통해 고체, 액체 상 물질의 밀도를 측정해 내는 데에 있는데, 액체와 고체의 밀도를 결정하는 대부분의 시험법들은 국제 표준화 대상이다. 본 시험법 지침에서는 이러한 시험법들에 대한 개략적인 수준의 내용들을 수록하였다. 일부 시험법들에 대한 내용들은 과학 전문지에서 입수한 개략적인 수준의 내용을 인용하였으며 시험의 기본 원리는 주 1을 참조한다.

2. 정의

어떠한 물질의 밀도 ρ은 그 물질의 질량과 부피의 비이며 SI 단위 kg/㎥로 나타낸다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

2. 시험법 원리

2.1. 액체 비중계(Hydrometer : 액체 부력 측정 시험법)

액체 비중계는 밀도에 따라서 액체 속에 잠기는 가중 유리 부유물이다. 액체의 밀도는 액체 위 검정판에서 액체의 위치를 읽어 측정한다. 이 때, 그 액체의 동적 점성도가 5 Pa s를 초과하지 않아야 한다.

2.2. 물 정역학 저울(Hydrostatic balance : 액체, 고체 부력 측정 시험법)

고체의 밀도는 공기 중 시료의 무게와 밀도가 알려진 액체(물 등) 내에서의 시료 무게 간의 차이에서 유도된다. 그렇게 측정된 밀도는 벌크 밀도(bulk density)처럼 특정하게 선택된 시료에 대해서만 적용된다.

액체의 밀도를 측정하려면 우선 부피가 확인된 고체 용기를 공기 중에서 칭량하고 그 다음 액체에 침강시킨다. 이 때, 측정하려는 액체의 동적 점성도가 5 Pa s를 초과하지 않아야 한다.

2.3. 액침법(Immersed body method : 액체 부력 측정 시험법)

액체 시험물질을 담은 용기를 저울에 놓고 칭량한다. 그 다음, 부피가 확인된 물체(일반적으로 약 10 ㎤ 부피의 구형 금속제를 사용한다)를 저울과 떨어져 있는 스탠드에 고정시키고 액체에 담근다. 이 때, 액체에 잠긴 물체가 저울에 미치는 작용은 자유롭게 떠다니는 물체와 잠겨있는 물체 간에 차이가 없으며 잠긴 물체의 주변을 둘러싸고 있는 액체의 밀도를 가진다. 액체의 밀도는 부피가 확인된 물체가 액체에 잠기면서 얻어진 무게를 나눔으로써 얻을 수 있다. 이 방법은 동적 점성도가 20 Pa s 이하인 액체에 한해서 적용할 수 있다(주 2).

2.4. 비중병(pycnometer) 측정법(액체, 고체)

밀도는 비중병이 가득 찬 무게와 빈 무게 간의 차이 및 비중병의 부피에서 계산된다. 액체의 경우, 동적 점성도가 500 Pa s 이상이 되면 아니 된다.

2.5. 공기 비교 비중병 측정법(고체)

고체 시료의 부피는 다양한 부피의 실린더 내에 공기나 비활성 가스 중에서 측정한다. 부피를 측정한 다음 시료의 무게를 칭량한다.

2.6. 진동 밀도 측정기(액체)

U자형 튜브 형태구조를 가진 진동자는 무게에 따른 공명 주파수에서 진동한다. 시료를 주입하면 공명 주파수가 변화된다. 장치는 밀도를 이미 알고 있는 두 종류의 액체로 보정되어야 한다. 이 때, 보정에 사용하는 액체들은 그 밀도가 시험에 사용하는 액체 범위 내의 밀도를 가지는 것들을 선택하는 것이 좋다. 이 방법은 동적 점성도가 5 Pa s 이하인 액체에 적용한다(주 3, 4, 5).

3. 시험 조건

시험은 20 ℃ 항온상태에서 수행하는 것이 좋으며 2 회 측정한다.

4. 시험 방법

시험장치와 시험수순에 관한 기술적인 세부사항에 관한 표준은 주 6에 수록되어 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 시험 보고서

시험보고서에는 다음의 내용이 수록되어야 한다.

(1) 시험법에 대한 정보

(2) 시험물질의 화학적 특성(chemical identity) 및 불순물

(3) 정확도 평가결과

(4) 밀도(정확도 평가결과 범위 내에서 2 회 이상 측정한 값의 평균)

(5) 결과 해석과 관련된 모든 정보(특히 불순물 및 시험물질의 물리적 상태와 관련된 정보)

* 주 1 : Weissberger, R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Vol. I, Part 1, Chapter IV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York

* 주 2 : Wagenbreth, H. (1979). Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen, 11, 427-430.

* 주 3 : Leopold, H. (1970). Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 19, 297-302.

* 주 4 : Baumgarten, D. (1975). Die Pharmazeutische Industrie, 37, 717-726.

* 주 5 : Riemann, J. (1976). Brauwirtschaft, 9, 253-255.

* 주 6 : 표준시험법 목록

1. 액체비중계(hydrometer)

(1) ASTM D 1298

액체비중계 시험법을 이용한 원유 및 액상 석유제품의 밀도, 비중(specific gravity) 또는 API 비중 측정

(2) BS 4714

액체비중계 시험법을 이용한 원유 및 액상 석유제품의 밀도, 비중 또는 API 비중 측정

(3) DIN 2790

Laborgeräte aus Glas; Aräometer. Grundlagen für Bau und Justierung

(4) DIN 12791

Laborgeräte aus Glas; Dichte-Aräometer. Allgemeine Anforderungen

(5) DIN 12793

Laborgeräte aus Glas. Sucharäometer für Vormessung und rohe Betriebs-messung

(6) ISO 387

액체비중계 - 구조 및 조정에 관한 원리

(7) ISO 649-1

일반적인 목적의 밀도 액체비중계 - 사양

(8) ISO 649-2

일반적인 목적의 밀도 액체비중계 - 시험법과 사용방법

2. 유체정역학 저울(Hydrostatic balance)

2.1. 고체물질

(1) NFT 20-049

산업화학제품 - 파우더 및 다공질(cellular) 제품 외 고체 밀도 측정

2.2. 액체물질

(1) ASTM D 941-55

(2) ASTM D 1296-67

(3) ASTM D 1481-62

(4) DIN 51757

Prüfung von Mineralölen und verwandten Stoffen. Bestimmung der Dichte

(5) ISO 758

액체화학제품에 대한 20 ℃에서의 밀도 측정법

3. 액침법(Immersed body method)

(1) DIN 53217

Teil 3: Lacke, Austrichstoffe und ähnliche Beschichtungsstoffe, Bestimmung der Dichte. Tauchkörper- Verfahren

4. 비중병 측정법(Pycnometer)

(1) ISO 3507

비중병 측정법

(2) NFT 20-053

산업화학제품 - 파우더 및 액체 내의 고체 밀도 측정법

4.1. 액체물질

(1) BS 4699

석유제품비중 및 밀도측정 시험법(눈금 이중 모세관 비중병 시험법)

(2) BS 5903

모세관 마개 비중병 측정 시험법에 의한 석유제품 상대밀도 측정법

(3) DIN 12797

Laborgeräte aus Glas. Pyknometer nach Gay-Lussac

(점성이 크지 않은 비휘발성 액체에 해당)

(4) DIN 12798

Laborgeräte aus Glas. Pyknometer nach Lipkin

(15℃에서 동적 점성도가 10-4 m2/s 이하인 액체에 해당)

(5) DIN 12806

Laborgeräte aus Glas. Pyknometer nach Hubbard

(페인트, 니스 및 역청 등과 같이 증기압이 크게 높지 않으면서 점성이 있는 모든 형태의 액체에 해당)

(6) DIN 12809

Laborgeräte aus Glas. Pyknometer mit eingeschliffenem thermometer und Seiten Kapillare

(점성이 크지 않은 액체에 해당)

(7) DIN 53217

Teil 2: Lacke, Austrichstoffe und ähnliche Beschichtungsstoffe Bestimmung der Dichte. Pyknometer- Verfahren

(8) ISO 758

액상 화학물질 - 20 ℃에서의 밀도 측정법

4.2. 고체물질

(1) ISO 901

알루미늄 생산에 사용되는 Aluminum oxide - 절대 밀도 측정법

제 10 항  입자크기분포/섬유길이 및 직경분포 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

많은 시험방법들이 입자크기측정에 사용되지만 입자의 전체적인 크기 범위에 적용할 만한 시험법은 없는 실정이다. 입자크기 측정에는 체로 거르기 방법(sieving), 미세 침전법(microscopic sedimentation), 정화법(elutriation techniques) 등이 주로 사용된다. 더불어, 분진이나 연기, 흄 등과 같은 공기 중 입자를 측정하는 데에는 방사선 산란(radiation scattering)과 관성법(inertial method) 등을 사용하는 것이 특히 유용하다. 마지막으로 시험하는 물질의 대표성을 사실적으로 나타내기 위해서 시료 제작 수순을 적절하게 선택해야 한다.

본 시험지침에 기술된 첫 번째 시험법(A, 입자크기분포)은 물과 공기 중 불용성 입자의 침강과 수송에 관한 정보를 제공하기 위함을 목적으로 한다. 한편 두 번째로 제시할 시험법(B, 섬유길이 및 직경 분포)은 섬유 형태의 특수 물질인 경우에 적용하는 것이 좋은데, 이 방법으로는 어떠한 물질의 흡입이나 섭취에 의해 증가되는 건강위해성을 증명하는데 도움을 줄 수 있는 방법이다. 일반적으로 입자크기는 산업현장에서 사용되는 공정에 크게 의존하며, 이렇게 발생한 입자들은 향 후 환경과 인간에 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

시험법 A는 일반적으로 적용되며 자주 사용되는 방법으로서 유체역학적 특성을 지니고 있다. 그리고 시험법 B는 자주 사용되는 방법은 아니지만, 비교적 특이적인 시험법으로서 현미경 검사가 포함되어 있다.

이러한 시험법들은 물에 불용성인 물질에 한정하여 적용할 수 있다(물에 대한 용해도<10-6 g/ℓ). 섬유에 관한 시험법 B의 경우에는 간단한 현미경 검사에 한정하여 적용할 수 있는데, 이미 알려진 섬유나 섬유로부터 배출되는 물질 또는 섬유가 존재할 가능성이 있는 다른 데이터에 대한 유사성에 대하여 조사한다. 이러한 맥락에서, 섬유는 물에 녹지 않는 입자이며, 길이와 직경의 비율이 3 ㎛ 이상, 직경이 100 ㎛이하인 것으로 한다. 길이가 5 ㎛ 미만인 섬유에 대해서는 고려하지 않는다. 유효한 유체역학 반경에 대하여 측정하는 시험인 시험법 A는 섬유 및 비섬유 미립자에 대하여 사전 조사 없이도 적용할 수 있는데, 2 ㎛< Rs < 100㎛의 범위 안에서만 사용할 수 있다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서 사용되는 물질들은 가장 순도가 높은 것을 사용해야 하며, 시험물질에 존재할 수 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다.

2.1. 시험법 A

이 방법은 물에 대한 용해도가 10-6 g/ℓ 미만인 분말 형태 제품에만 적용 가능하다. 그러나 현재까지도 입자크기 분포에 관한 6 개의 국제적 표준 시험법이 통일되어 시험되어 있지 않고 있으며, 침강과 쿨터 카운터(coulter counter) 측정법과 관련된 특정한 문제점이 존재하고 있는 실정이다.

2.2. 시험법 B

이 방법은 섬유 제품에만 적용이 가능하며 입자의 형태에 관한 불순물의 효과를 고려해야 한다.

3. 정의

시험법 A에서 대상이 되는 파라미터들은 유효한 유체역학 반경 또는 유효한 Stoke's 반경 Rs이다. 점성을 지닌 유체 내에서 중력의 영향 하에 낙하하는 작은 구의 최종 속도는 다음과 같이 주어진다.

[eqn: v=2 _{g} R _{s} ^{2} (d _{1} -d _{2} )/9 eta]

여기에서, v는 속도 (m/s)

g는 중력 상수(m/s2)

Rs는 Strokes 반경(m)

d1는 구의 밀도(kg/㎥)

d2는 유체의 밀도(kg/㎥)

η은 유체의 점성도(dynamic viscosity)(Nsec/㎡=Pas)

를 나타낸다.

다른 상황에서 유사한 관계가 적용되기도 하며, 입자 크기는 대개 ㎛(=10-6 m)로 측정한다. 시험법 B는 섬유 길이와 직경(d) 분포에 관한 그래프를 제시한다. 이 그래프에서 세로좌표는 ℓ 또는 d 간격마다 나타나는 입자수의 절대치를 의미한다. 일반적인 그래프는 그림 1과 그림 2에 제시되어 있다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

0.35~650 ㎛ 범위에서 50~200 ㎛ 영역을 제외한 범위 내의 입자 크기를 가진 다섯 종류의 표준물질이 확인되어 있는데, 이 물질들은 입자의 누적 질량 분포 대 평형 도달비율 직경 또는 평형 부피 직경에 관하여 확인이 되어 있다. 이 물질들은 EC 위원회의 “Community Bureau of Reference”에서 인증되었으며, 인증 보고서는 Community Bureau of Reference에서 찾아볼 수 있다(주 1).

1.1. 보정물질(Calibration materials)

시험법 A : 2 원 또는 3 원 혼합 라텍스 구(2 ㎛ ≤ d ≤ 100㎛)

시험법 B : 표준물질 불필요

1.2. 평가물질

시험법 A : 2 ㎛, 50 ㎛, 100 ㎛ 3 원 라텍스 구에 분쇄된 석영 시료를 더한 것

시험법 B : 백석면 사용 권장(시료가 완전히 섞이기까지 오래 걸리지 않는 특성을 지녔다면 링 테스트에서 이상적인 분포를 이루는데 도움이 된다).

2. 시험 원리

2.1. 시험법 A

민감도가 요구되는 표준 시험법 몇 종류가 있다.

원리	방법
침강	ASTM-D 3360, D422 NF-T 30044 DIN-66-115
원심분리법	ASTM-C 678 Chem. Ing. Tech. 46. 729(1974)
쿨터 카운터	ANSI-C 690-75

2.2. 시험법 B

직경이 작은 섬유(0.1 ㎛ 이상)를 대상으로 자료를 수집해야 하기 때문에 SEM(scanning electron microscopy)이나 TEM(transmission electron microscopy)이 필요하다. 아직까지 표준화된 수순은 없으며 현재 개발 중에 있는 석면 오염에 관한 방법은 본 시험지침의 목적을 달성하기 위해서 적용하기에는 더 복잡하고 비용이 높다. 시료를 제작할 때에 시료가 깨지거나 충격을 받거나, 오염이 되지 않도록 세심한 주의가 필요하다. 간략한 초기 공정을 소개하면 다음과 같다. 섬유 이미지의 길이와 직경은 수동, 준-자동 및 자동으로 측정할 수 있으며, 결과를 그래프 형태로 나타낸다(그림 1, 2 참조).

그림 1. 섬유 시료의 길이 분포(시험법 B)

그림 2 섬유 시료의 직경 분포(시험법 B)

3. 품질 기준

3.1. 재현성

유효한 유체역학적 반지름 분포(시험법 A)는 20 %이상 차이나지 않는 2 개 값을 가지고 3 번 측정한다. 시험법 B에서 섬유의 길이 및 직경 분포는 그래프 당 최소 70 개의 섬유를 가지고, 독립적으로 2 회 이상 측정해야 한다. 또한 히스토그램 간격 내에 존재하는 두 값에서 50 % 이상의 차이가 나거나 3 개의 섬유 이상의 차이가 나서는 아니 된다. 그러한 반복성은 현재 관찰된 모델링과 의사결정이 요구하는 바를 충족시킬 수 있어야 한다. 길고 얇은 섬유는 잠재적으로 건강에 해로울 수 있기 때문에 더 정밀한 측정을 수행해야 할 필요가 있다.

3.2. 민감도

시험법 A와 같이 일반적인 경우에는 2 ㎛보다 작고 200 ㎛보다 큰 입자들을 측정할 수 있어야 한다. 이 시험법에서는 반지름 분배곡선을 분석하는데 사용될 충분한 수의 반지름 간격이 요구된다. 시험법 B와 같은 섬유의 경우, 반지름이 0.2 ㎛보다 작고 100 ㎛보다 크며 길이가 5 ㎛보다 짧고 300 ㎛보다 긴 입자들을 측정할 수 있어야 한다.

3.3. 표준화 가능성

본 시험법의 공정은 쉽게 표준화 할 수 있지만, 시료를 제작하거나 사전 준비작업이 통일되지 못하면 시험법 B의 결과에 상당한 편차가 있을 수 있다.

3.4. 자동화 가능성

자동화 및 반자동화가 가능하다. 섬유의 ℓ과 d의 측정 및 분석을 완전히 자동화하는 것 또한 가능하다.

4. 시험 방법

4.1. 준비

4.1.1. 시험법 A

적은 양의 시료를 사용하지만, 사용되는 시료는 그 물질이 생산되는 반응에 대표성을 나타낼 수 있어야 한다. 그러므로 시료의 취급을 신중하게 해야 하는데, 예를 들면 작은 입자들은 응집되기가 쉽기 때문에 입자의 크기를 결정하기 전에 분산제 투여, 교반, 초음파 처리 등의 전처리를 행해야 할 때도 있다. 입자 크기 분포의 변화를 막기 위해서는 많은 주의가 필요하다. 매우 안정된 응집제의 경우, 주요 입자와 집합체간의 구분을 엄격하게 할 필요는 없다. 대표적인 시료 전처리 법은 위에 언급된 시험원리(시험법 A)에 수록된 표준 시험법에서 찾을 수 있다.

4.1.2 시험법 B

시험법 B에는 2 개의 간단한 시료 전처리 공정(B-1, B-2)이 제시되어 있다.

4.1.2.1. 시료 전처리법 B-1

여과된 증류수나 이온화된 물 10~100 ㎖ 내에 시료 적당량을 취한다(현탁액(suspension)은 상대적으로 가볍지만 슬러리(slurry)는 아니다). 100 % 에탄올이나 비이온성 세제 등의 계면 활성제를 사용하면 현탁액 내 입자의 분포를 고르게 할 수 있다. 격렬하지 않게 손으로 교반하거나, vortex를 이용한 혼합 혹은 마그네틱 바를 이용하여 교반하면 분말현탁액을 만들 수 있다.

현탁액은 47 ㎜ 직경의 Millipore* 필터 홀더에 47 nm직경의 Nuclepore* 필터와 Millipore* 막 필터를 끼워 진공을 조심스럽게 가하면서 직접 거른다. 이 때, 분말이 현탁액으로부터 분리되어 침전되지 않도록 조심하여야 한다. 원하는 입자의 크기에 맞추어 구멍(pore)이 맞는 필터를 사용한다. 현탁 입자의 농도는 걸러진 양에 따라 결정된다. 현탁액의 농도가 낮을수록 필터 표면에서 입자의 분포가 증가한다(주 2). 필터 케이스에서 Nuclepore 필터를 벗긴다. 이때 표면의 입자가 떨어지지 않도록 주의한다. 필터는 Whatman No.1 필터지를 끼운 유리 또는 플라스틱 페트리 디쉬에 입자가 입혀진 면이 위로하여 위치시킨다. 페트리 디쉬의 뚜껑을 덮고 건조실이나 진공상태 하에 넣은 다음 완전히 건조되면 적절한 크기로 절단하고 필터면이 위로 가도록 SEM 표본 홀더에 미리 고정시켜 놓은 구리 테이프에 장착한다(양면 테이프를 사용한다). 테이프의 점성을 유지하기 위해 적외선 또는 유사한 가열 방법으로 5~15 분 간 예열한다. SEM 견본 홀더에 맞추기 위해서는 필터의 모서리를 적절히 다듬는다.

4.1.2.2. 시료 전처리법 B-2

B-1법 외에 존재하는 전처리법으로는 SEM 견본홀더 위에 장착된 구리 테이프(접착 전기테이프)에 건조된 분말을 직접 옮기는 방법이 있다. 분말을 아토마이저(atomizer)나 큰 고무구가 장착된 피펫을 사용하여 구리 테이프 표면에 뿌리면 된다.

4.2. 시험조건 및 장치

4.2.1 시험법 A

시험법 A는 일반적인 환경에서 수행한다. 모든 시험법에 대한 측정 장치는 쉽게 이용 가능하며 피펫과 침강저울을 침강법에 쓴다.

4.2.2. 시험법 B

Air-borne 섬유에 의한 오염을 주의한다. 가능하면 후드나 클린룸(clean room)에서 작업하도록 한다. 소규모 전자현미경과 부가장비들이 필요하다.

4.3. 시험 수행

4.3.1. 시험법 A

위에 열거한 표준 시험법(시험 원리)에서 선택한다.

4.3.2. 시험법 B

두 전처리법(B-1, B-2)은 SEM 견본 홀더 위에 장착된 구리 테이프나 필터 테이프상의 분진 시료를 장착한다. 이렇게 한 다음 SEM으로 측정하거나 sputtering 장치 또는 진공 증발기를 사용하여 금속 필름으로 코팅할 수 있다. 시료 표면 내의 대표적인 부분은 시험대상군을 대표하는 시료를 얻기 위해 다양한 배율로 광학적으로 표시한다(원한다면, 시료 오염도를 확인하기 위해 EDXA(energy dispersive X-ray analysis)도 가능하다).

4.3.3. 입자크기분포는 화면으로 직접 측정하거나 사진으로 측정할 수 있다. 만일 SEM에 영상 분석시스템이 장착되어 있다면 직접 군 통계(population statistics)를 낼 수도 있다. 필요하다면 이렇게 측정하는 것을 자동화시키거나 반자동화시키는 것이 가능하다(주 3). 만일 영상에서 시료가 너무 높은 농도를 나타낸다면 묽게 희석하여 반복 실시한다.

4.4. 분석

다른 방법으로 물리적 파라미터들을 측정했을 경우 입자크기분포가 약간 다를 수 있기 때문에 사용한 측정기법을 반드시 보고해야 한다. 대표적인 분석방법들을 주 1~6에 제시하였으니 참고한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

1.1. 시험법 A

시험 데이터는 세 범위(200 ㎛ 이상, 2 ㎛ 이하, 2~200 ㎛ 사이)에서 얻어지는데, 2~200 ㎛ 영역에서 얻어진 데이터들에 관해서는 분산 곡선을 적용해 봐야 한다. 이 때 곡선(소집단)을 해석하기 위해서는 충분한 ㎛의 증가가 있어야 한다. 그래프의 표현은 200 ㎛ 이상과 2 ㎛ 이하 물질의 무게 백분율에 대해서 언급을 해 줄 필요가 있다.

1.2. 시험법 B

길이(ℓ)와 직경(d) 데이터는 d가 0.1 ㎛보다 크고 ℓ이 5 ㎛보다 큰 섬유에 대해서 필요하다. 각각 최소한 50 개의 섬유 시험에 근거를 둔 2 개의 그래프 분포를 준비한다. 직경의 범위는 0.1~10.5, 0.5~1.0, 1~2.1, 2~3, 3~5 ㎛ 그리고 5 ㎛ 이상이어야 하고 길이의 범위는 0~5, 5~10, 15~20 ㎛이어야 한다. 이에 대하여서는 앞서 제시된 그림 1과 그림 2를 참조한다.

2. 시험 보고서

시험 보고서에는 다음의 정보를 수록하여야 한다.

2.1. 시험법 A

(1) 향 후 보고 수치의 백분율 변화 예상치(예. 제품 간 편차)

(2) 사용된 시료 전처리 방법

(3) 사용된 분석 방법

(4) 입자 형태(구형, 판형, 바늘형 등)에 관한 정보

(5) 제품번호, 시료번호

(6) 현탁 매질, 온도, pH

(7) 농도

(8) 2 ≦ Rs ≦ 200 ㎛에 관한 stoke's 반경 Rs 분포

(9) Rs 분포 내 분해 최고점(peak)의 평균치와 대략적인 면적(%)

(10) Rs ≦ 2 ㎛ 입자 %

(11) Rs ≦ 200 ㎛ 입자 %

2.2. 시험법 B

(1) 시료에 대한 자세한 서술, 시험법에 대한 자세한 서술

(2) 영역(field) 당 입자 수

(3) 측정된 섬유의 총 수

(4) ℓ, d 분포(그래프)

(5) Rs 분포 내 분해 최고점의 평균치와 대략적인 면적(%)

* 주 1 : Certification Report on Particles of Defined Particle Size, Community Bureau of Reference, Brussels (1979).

* 주 2 : R.R. Irani and C.F. Callis, Particle Size Measurement, Interpretation and Application.

* 주 3 : S. Orr and J.M. Dallavalle, Fine Particle Measurement.

* 주 4 : T. Allen, Particle Size Measurement, Chapman and Hall, London (1975).

* 주 5 : P.P. McGrath and J. B. Ewell, Application of Electron Microscopy to Problem of Particulate Contaminants in Food, Drugs and Biologicals, Scanning Electron Microscopy, Part III, 1976.

* 주 6 : Symposium on Electron Microscopy of Microfibers, edited by I.M. Asher and P.P. McGrath, Proceedings of the First FDA Office of Science Summer Symposium, (August 23-25, 1976).

* 주 7 : 입자크기와 중요한 입자 등급 측정을 위해 사용되는 방법 요약

제 11 항  pH 함수로 나타낸 가수분해 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

가수분해는 비생물학적 분해과정을 조절하는 가장 대표적인 반응 중 하나이며 환경 속에서 가장 주요하게 일어나는 분해 경로의 하나로서 가수분해 시험을 수행하는데 있어서 시험물질의 지속성(persistence)이 관련되어 있다.

가수분해율 측정 수순은 원래 물질(parent compound)이나 시험물질의 중요한 분해 산물인 가수분해 산물에 대해서 또 다른 시험을 수행해야 하는지 알아내는 데에도 중요하다.

가수분해의 양상은 환경 중 pH 수치(pH 4~9) 하에서 측정되어야 하며 생리학적인 목적으로 측정하려 한다면 산성조건(pH 1~2) 하에서 측정한다.

표면조절반응(surface-controlled reaction)이 벌크 용액의 가수분해에서보다 더 우월하게 나타날 수 있는데, 특히 토양 환경 속에서 더욱 그러하다. 이러한 현상은 균질한 용액을 대상으로 한다면 본 지침에서 예상한 비율과 분해율이 다르게 나타날 수도 있다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서는 고순도(pure grade) 및 일반순도(commercial grade)의 시험물질이 사용되는데, 시험물질에 존재할 수도 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다.

본 시험법에 대한 지침은 수용성 화합물에만 적용되며 고온에서의 결과를 실제 환경농도로 외삽(extrapolation)시킬 경우에는 예상되지 못한 불확실성이 있을 수 있음을 유념하여야 한다.

3. 정의

가수분해란 반응 중에 X기(group X)와 OH기가 서로 치환되는, 화학물질 RX와 물과의 반응이라 할 수 있다.

RX + HOH → ROH + HX

rate = K[H2O][RX]: second order reaction 또는

K[RX] : first order reaction

RX가 감소하는 농도의 비율은 반응률 결정 단계에 따라서 다음과 같이 주어진다. 물의 양이 화학물질의 양에 비해서 상당히 많은 양으로 존재하기 때문에 이런 형태의 반응은 유사(pseudo) 일차반응이라고도 하는데, 일반적으로 관찰된 비율상수(the observed rate constant)가 다음과 같이 주어진다.

Korbs = K･[H2O]

측정은 다음과 같이 한다.

Kobs=[eqn: { 2.303} over {t }][eqn: log _{ 10}]Co/Ct

여기에서 t = 시간

Co = 시간 0에서의 RX의 농도

Ct = 시간 t에서의 RX의 농도

여기서의 상수 단위는 (시간)-1 그리고 반응 반감기(RX가 50 % 반응하는데 걸리는 시간)로써 아래와 같이 주어진다.

T½ = 0.693/Kobs (주 1)

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

- 아스피린(Aspirin)

- 디아지논(Diazinon)

어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

주 2에 수록된 “OECD/EEC -실험실 내부 비교 시험법”에 관련 내용이 제시되어 있으니 참고한다.

2. 시험법 원리

환경 중에서 화학물질들은 대개 물이 과량으로 존재하는 “용액” 안에 녹아 있으므로 가수분해 중에도 물의 농도는 반드시 일정하게 유지된다. 일반적으로 가수분해는 pH와 온도가 고정된 상황에서 일차 반응과 유사한 형태로 작용한다.

가수분해 반응은 특이적인 산 촉매 또는 염기성 촉매라고도 하는 H3O+(H+)와 OH-에 의해 영향을 받을 수 있다.

한편, 시험물질의 농도는 시간에 의한 함수로 측정된다. 농도의 대수(logarithms)는 시간에 대하여 그려지며 결과값 직선의 기울기는 그 식에서 비율상수(the rate constant)를 나타낸다.

Kobs = -[기울기]･[2.303] : log10 사용 시

특정 온도에서 비율상수를 직접 측정할 수 없을 경우, Arrhenius 관계식을 사용하여 계산할 수 있다.

3. 품질 기준

3.1 반복성(repeatability)

Mabey와 Mill의 보고에 의하면 13 종류의 유기 구조에 대한 가수분해 비율상수 측정이 표준편차 2 % 이내로 매우 정밀하다. 하나의 pH와 온도에 대한 비율상수를 측정하려면 2.5 %의 편차 이내로 두 번 측정해야 하는데, 이 때 이례적인 상황(예. 분석적인 어려움)이 발생하여 결과를 얻는데 영향을 받아서는 안 되며, 이러한 상황이 발생했다면 자세하게 보고가 되어야 한다. 시험의 반복성은 민감한 인자들을 조절하는 능력이 향상됨에 의해서 개선될 수 있는데, 특히 pH와 산소와 같은 인자가 잘 조절된다면 시험의 반복성이 크게 향상될 수 있다.

3.2 감도(sensitivity)

대부분의 가수분해 반응은 1 차 반응 비율에 따르기 때문에 가수분해 반응의 반감기는 농도에 비의존적인 경향이 있다. 이와 같은 이유에 의해 일반적으로 실험실에서 얻은 결과는 10-2~10-3 M부터 10-6 M 이하(환경적인 조건)에서 측정된다(주 3).

3.3 특이성(specificity)

주 3(Mabey와 Mill)에 다양한 화학물질을 대상으로 순수한 물과 자연 상태의 물에서 가수분해 비율을 측정한 사례들이 소개되어 있다.

4. 시험 수순

시험 수순에 대한 전체적인 개요를 그림 1에 요약하여 제시하였다.

그림 1 가수분해 시험의 개요

4.1 조제

4.1.1 시험물질

4.1.1.1 완충용액

가수분해 시험은 아래와 같은 pH 수치에서 실시한다.

① pH 1.2 (생리학적으로 의미가 있을 경우)

② pH 4.0

③ pH 7.0

④ pH 9.0

시험을 수행하기 위해서 0.05 M 멸균 완충용액을 만들어야 하는데, 이 때 증류, 멸균된 물과 특급시약 등급의 화학물질을 사용하여 조제한다. 주 2에 보면 몇 가지 완충체계(buffer system)가 수록되어 있는데, 이 완충체계는 시험 대상 화학물질의 분석 요구사항을 바탕으로 한다. 이 때, 사용하려는 완충체계가 가수분해 비율에 영향을 줄 수 있음에 유념해야 하며, 시험 상 적용해야 하는 대체 완충체계(alternative buffer system)도 발견이 되어 있다. Mabey와 Mill은 추천할 만한 완충용액으로서 인산(phosphate) 대신 붕산(borate)이나 초산(acetate) 완충용액을 권장하였다.

각 완충용액의 pH는 0.1 이상의 정밀도를 가지는 것이 좋으며, 시험하려는 온도에서 pH 미터를 사용하여 정밀도를 사전에 점검하여야 한다.

4.1.1.2 시험용액

시험하려는 화학물질은 멸균된 완충 매질(buffer medium)이 더해진 증류, 멸균된 물에 용해시켜야 한다.	이 때, 용액의 농도는 0.01 M을 초과하지 않아야 하며 포화농도의 절반이 넘어도 안 된다. 그리고 용액을 만들기 위해서 사용하는 화학물질은 가장 순수한 형태의 것이어야 한다.

혼합된 용매는 시험하려는 화학물질이 물에 대한 용해도가 낮을 경우에만 사용하도록 권장하며, 이 때에도 사용하는 용매의 양이 1 % 미만이 되도록 조절해야 하고, 가수분해 과정에 방해를 주는 용매를 사용해서는 안 된다.

4.1.1.3 유리 기구

모든 유리 기구들은 시험의 pH 범위 내에서 비활성이어야 하며, 가수분해 반응이 수행되는 동안에 사용할 마개가 있는 부피 플라스크(stoppered volumetric flask, 기름기(grease)가 없어야 함)는 미리 멸균되어 있어야 한다. 만일, 화학물질이나 완충 체계가 휘발성이거나 온도가 올라가는 상황에서 시험이 수행된다면 봉합된 튜브(sealed tube)나 격막이 닫혀있는 튜브(septum-closed tube)를 사용하는 것이 좋으며 튜브의 윗 공간을 사용하는 것은 피해야 한다.

4.1.2 분석 방법

분석방법은 시험물질의 성질에 따라 결정된다. 또한 시험용액의 농도에서 다양한 화학물질 종을 측정할 수 있도록 충분한 감도와 특이성을 가져야 하며 다음과 같은 사항이 제대로 갖추어져 있어야 할 것이다.

(1) pH 전극

(2) UV-vis 분광광도계

(3) 전도성(conductivity)

(4) GC(gas chromatography)

(4) HPLC(high pressure liquid chromatography)

(5) 유도체의 추출과 형성 및 적절한 분석법에 따른 농도결정

4.2 시험조건

4.2.1 온도

외삽을 하려 한다면, 측정온도의 편차가 적어도 ±0.1 ℃ 이내로 유지되는 것이 중요한데, 적당한 항온조를 사용하면 된다. 만약 물질의 가수분해 양상이 알려져 있지 않은 경우, 50 ℃에서 예비시험을 실시해야 한다. 이 예비시험단계 다음에 실시되는 시험에서 온도범위 0~40 ℃ 사이의 데이터가 측정된다. 그 데이터들은 이 범위 내의 두 온도 지점에서 측정하여 산출되거나 더 높은 온도 세 지점으로부터 추론하여 얻을 수 있다. 어떠한 경우에서든지 각각 10 ℃ 이상의 온도차를 두고 측정을 수행하여야 한다.

4.2.2 빛과 산소

모든 가수분해 반응은 광분해적인 효과를 피할 수 있는 적절한 방법을 선택하여 실시하여야 한다. 그리고 모든 측정방법에서 산소가 영향을 미쳐서는 안 된다(예. 용액 조제 전 5 분 간 질소와 아르곤 거품을 일어나게 함으로써 산소의 영향력을 배제시킴).

4.3 시험수행

4.3.1 예비시험

예비시험은 pH 조건 4.0, 7.0, 9.0, 온도 조건 50±0.1 ℃ 하에 수행되어야 한다. 5 일(t1/2 > 1 년)이 경과된 후 관찰하였을 때 반응의 10 % 미만이 진행되었다면 그 화학물질은 가수분해적으로 안정한 것으로 간주하며 더 이상의 시험을 할 필요가 없다. 화학물질이 환경 중 온도에서 불안정한 것으로 이미 알려져 있는 경우에도 예비시험을 수행할 필요가 없다. 그리고 분석 방법은 최초 농도의 10 %가 감소하는 것을 감지해 낼 수 있을 만큼 충분히 정밀하고 민감해야 한다.

4.3.2. 불안정한 물질의 가수분해

시험물질이 위에서 제시된 예비시험에서 규정한 것처럼 불안정할 경우, 아래와 같이 시험을 수행한다.

시험물질의 완충 시험용액은 선택된 온도로 자동 조절되어야 한다. 일차 반응 양상을 시험하기 위해서는 각 반응용액들에 대해서 시험물질이 정상적으로 20 %에서 70 %까지 가수분해 되는 구간에서 최소 6 개 지점을 선택할 수 있는 시간 간격을 두고 분석해야 한다. 그리고 각각 선택된 온도 별로 세 가지 pH(4, 7, 9)에 대하여 조사하고 선택된 온도 중 하나를 골라(상승된 온도 측정의 경우 중간 온도) 다시 세 가지 pH에 대하여 조사하여야 한다.

4.3.3 pH 1.2에서의 가수분해

위에서 제시된 가수분해적으로 불안정한 화합물에 대한 시험은 생리적 온도인 37 ℃와 생리적 pH 1.2의 조건에서 1 회 실시해야 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

일차 동태(first order kinetics)의 확인 : 산출된 데이터들은 log10Ct 대 t로 그려야 하며 반응 비율상수 kobs는 회귀분석(regression)이나 기울기로부터 계산되어야 한다.

kobs = 2.303 . slope

2. 결과 해석

데이터가 직선상으로 얻어지지 않았다면 그 반응은 1 차 동태 반응이 아니며, 그 데이터는 본 시험 원리에서 제시된 방법으로는 분석할 수 없으므로 다른 방법을 적용하여 분석하도록 한다.

3. 시험 보고서

시험보고서에는 다음과 같은 정보를 수록해야 한다.

(1) 시료의 순도

(2) 표준물질이 적용된 시험수순에 부합하는 모든 결과

(3) 각 시험 별 온도, pH 및 완충 용액에 대한 정보가 포함된 구체적인 시험 수순

(4) 액상 물질에서 시험물질을 분리하기 위해 추출 방법이 사용된 경우, 추출 방법과 데이터 복구에 대한 구체적인 방법이 포함된 시험물질에 대한 구체적인 분석법

(5) 비선형 log 농도-시간 그래프를 그리기 위해 관찰된 반응과 관련된 모든 농도-시간 데이터 지점

(6) 산, 염기 촉매의 가능성

주 2에 보고서 양식의 예제가 수록되어 있다.

* 주 1 : H. M. Gomaa, I. H. Suffet, S. D. Faust, "Kinetics of Hydrolysis of Diazoxon", Residue Reviews 29: 171 (1969)

* 주 2 :

1. 완충용액 혼합물

1.1 CLARK AND LUBS

"CLARK AND LUBS" 완충용액 혼합물

* 아래의 표에 제시된  pH수치들은 Sörensen의 표준 방정식(1909)을 사용하여 계산된 것이다. 보정된 pH 수치는 도표화된 수치보다 0.04 정도 더 높다.

(1) 20 ℃에서 0.2 N HCl 과 0.2 N KC1

조 성	pH
47.5 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	1.0
32.25 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	1.2
20.75 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	1.4
13.15 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	1.6
8.3 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	1.8
5.3 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	2.0
3.35 ㎖ HCl + 25 ㎖ KC1을 100 ㎖까지 희석	2.2

(2) 20 ℃에서 0.1 M potassium biphthalate + 0.1 N HC1

조 성	pH
46.70 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	2.2
39.60 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	2.4
32.95 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	2.6
26.42 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	2.8
20.32 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	3.0
14.70 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	3.2
9.90 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	3.4
5.97 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	3.6
2.63 ㎖ 0.1 N HC1 + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	3.8

(3) 20 ℃에서 0.1 M potassium biphthalate + 0.1 N NaOH

조 성	pH
0.40 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	4.0
3.70 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	4.2
7.50 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	4.4
12.15 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	4.6
17.70 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	4.8
23.85 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	5.0
29.95 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	5.2
35.45 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	5.4
39.85 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	5.6
43.00 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	5.8
45.45 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ biphthalate을 100 ㎖까지 희석	6.0

(4) 20 ℃에서 0.1 M monopotassium phosphate + 0.1 N NaOH

성분	pH
5.70 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	6.0
8.60 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	6.2
12.60 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	6.4
17.80 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	6.6
23.45 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	6.8
29.63 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	7.0
35.00 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	7.2
39.50 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	7.4
42.80 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	7.6
45.20 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	7.8
46.80 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ phosphate을 100 ㎖까지 희석	8.0

(5) 20 ℃에서 0.1 M H2BO2 in 0.1 M KC1 + 0.1 N NaOH

성분	pH
2.61 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	7.8
3.97 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	8.0
5.90 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	8.2
8.50 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	8.4
12.00 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	8.6
16.30 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	8.8
21.30 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	9.0
26.70 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	9.2
32.00 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	9.4
36.85 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	9.6
40.80 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	9.8
43.90 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ boric acid을 100 ㎖까지 희석	10.0

1.2 KOLTHOFF AND VLEESCHHOUWER

"KOLTHOFF AND VLEESCHHOUWER" 구연산 완충용액

(1) 18 ℃에서 0.1 M monopotassium citrate 와 0.1 N HC1

(곰팡이 증식 방지를 위해 작은 티몰(thymol) 결정이나 수은 몇 mg을 첨가)

조 성	pH
49.7 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	2.2
43.4 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	2.4
36.8 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	2.6
30.2 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	2.8
23.6 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	3.0
17.2 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	3.2
10.7 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	3.4
4.2 ㎖ 0.1 N HCl + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	3.6

(2) 18 ℃에서 0.1 M monopotassium citrate와 0.1 N NaOH

(곰팡이 증식 방지를 위해 작은 티몰 결정이나 요오드화 수은(mercuric iodide) 첨가)

성분	pH
2.0 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	3.8
9.0 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	4.0
16.3 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	4.2
23.7 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	4.4
31.5 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	4.6
39.2 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	4.8
46.7 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	5.0
54.2 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	5.2
61.0 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	5.4
68.0 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	5.6
74.4 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	5.8
81.2 ㎖ 0.1 N NaOH + 50 ㎖ citrate을 100 ㎖까지 희석	6.0

1.3 SÖRENSEN

"SÖRENSEN"의 borate 혼합물

(1) 0.05 M borax +0.1 N HCl

조 성		Sörensen 18 ℃	Walbum, pH
ml. Borax	ml. HCl		10 ℃	40 ℃	70 ℃
5.25	4.75	7.62	7.64	7.55	7.47
5.50	4.50	7.94	7.98	7.86	7.76
5.75	4.25	8.14	8.17	8.06	7.95
6.00	4.00	8.29	8.32	8.19	8.08
6.50	3.50	8.51	8.54	8.40	8.28
7.00	3.00	8.08	8.72	8.56	8.40
7.50	2.50	8.80	8.84	8.67	8.50
8.00	2.00	8.91	8.96	8.77	8.59
8.50	1.50	9.01	9.06	8.86	8.67
9.00	1.00	9.09	9.14	8.94	8.74
9.50	0.50	9.17	9.22	9.01	8.80
10.00	0.00	9.24	9.30	9.08	8.86
0.05 M borax + 0.1 N NaOH
10.0	0.0	9.24	9.30	9.08	8.86
9.0	1.0	9.36	9.42	9.18	8.94
8.0	2.0	9.50	9.57	9.30	9.02
7.0	3.0	9.68	9.76	9.44	9.12
6.0	4.0	9.97	10.06	9.67	9.28

2. 일부 화학물질에 관한 비율상수와 반감기

2.1 아스피린과 디아지논 참고치

아스피린과 디아지논에 대한 참고치는 참고문헌 별로 아래와 같이 제시되어 있다.

(1) Diazinon (0,0-ondiethyl-0-(6-methyl-2-isopropyl-4-pyrimidinyl phosphrothioate).

H.M Gomma, I.H Suffet, S.D. Faust, Residue Reviews 29, 171(1969)

pH	10.43	0.061(310)	0.13(150)	0.41(48)	15(12)	K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
	9.0		0.0059(3300)			K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
	7.4		0.00043(4400)			K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
	5.0		0.026(740)			K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
	3.1	0.75(260)	1.6(120)	6.6(29)	25(7.8)	K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
		10 ℃	20 ℃	40 ℃	60 ℃	온도

(2) Aspirin(2-acetylsalicylic acid). L.J. Edwards. Trans. Faraday Soc. 723-735(1950)

	0.065 (300)	0.15 (130)	0.13 (150)	0.37 (52)	16 (1.2)	K［[eqn: 10 ^{5}]/sec］［t1/2(h)］
pH (17 ℃)	3.5	5.0	7.4	9.5	11.3

2.2 OECD-EEC 실험실 비교 시험 프로그램, Part 2(4) 결과

- 아스피린

- 디아지논

여기 제시된 결과 중 일부에는 시험 지침서에서 제시된 바와 차이가 있을 수 있다. 이 차이는 시험 시스템에서 서로 다른 완충용액을 사용한 결과에서 특히 그러하며 산소의 영향에 의해서도 그러할 수 있다.

그렇다할지라도 전문가 집단에서는 그들이 OECD-EEC 실험실 간 비교 시험 프로그램의 시험 지침서에 따라서 얻어 낸 결과만큼 이러한 결과들을 제시하고 있다.

가수분해 pH 함수 결과 요약

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

시험물질 : 아스피린

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	1.013	1.278	126.2	0.019～1.916	2
3.0	20 40 60	0.080 0.556 -	0.056 0.112 -	70.3 20.1 -	0.040～0.119 0.044～0.635 -	2 2 -
7.0	20 40 60	0.033 0.004 -	0.003 0.004 -	15.9 0.3 -	0.182～0.228 1.336～1.341 -	2 2 -
9.0	20 40 60	0.016 0.006 -	0.160 0.006 -	51.7 0.6 -	0.196～0.442 0.949～0.957 -	2 2 -

가수분해 pH 함수 결과 요약

반감기(t1/2)

시험물질 : 아스피린

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	93.71	118.3	126	10.05～177.36	2
3.0	20 40 60	319.7 35.4 -	222.5 7.1 -	70 20 -	162.3～477.0 30.3～40.4 -	2 2(1 lab) -
7.0	20 40 60	95.1 14.4 -	15.1 0.0 -	20 - -	84.4～105.8 14.4～14.4 -	2 2(1 lab) -
9.0	20 40 60	72.1 20.2 -	37.3 0.1 -	50 0.0 -	45.7～98.5 20.1～20.3 -	2 2(1 lab) -

가수분해 pH 함수 결과 요약

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

시험물질 : 디아지논

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	30.36	8.10	27.0	21.4～38.46	4
3.0	20 40 50 60	2.866 9.038 5.77 36.085	0.825 2.447 4.27 11.088	28.8 27.1 74.0 30.7	1.675～3.841 5.708～14.165 0.86～8.58 25.535～51.449	7 11(10 lab) 3(2 lab) 6
7.0	20 40 50 60	0.933 0.231 0.200 1.638	1.796 0.294 0.023 3.154	192.4 127.3 11.3 192.6	0.005～3.626 0.042～0.895 0.184～0.216 0.303～9.413	4 8 2 8(7 lab)
9.0	20 40 50 60	1.103 2.568 0.292 2.801	2.113 6.900 0.034 4.125	191.6 268.7 11.6 147.3	0.007～4.271 0.064～20.955 0.268～0.316 0.241～12.604	4 9 2 8(7 lab)

가수분해 pH 함수 결과 요약

반감기(t1/2)

시험물질 : 디아지논

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	0.672	0.187	27.9	0.501～0.900	4
3.0	20 40 50 60	7.27 2.25 9.00 0.57	2.40 0.57 11.53 0.17	33 25 128 29	5.0～11.5 1.4～3.3 2.24～23.31 0.37～0.75	7 11(10 lab) 3(2 lab) 6
7.0	20 40 50 60	1707.75 215.16 97.07 38.63	1875.18 166.12 10.97 20.98	110 77 11 54	5.3～3660.9 21.5～460.7 89.31～104.83 2.0～63.5	4 8 2 8(7 lab)
9.0	20 40 50 60	1150.75 124.38 66.40 25.13	1335.58 102.45 7.74 25.67	116 82 12 102	4.5～2840.5 0.9～298.7 60.92～71.87 1.5～79.8	4 9 2 8(7 lab)

2.3 OECD-EEC 실험실 비교 시험 프로그램 추가 자료

본 프로그램에서 다음의 세 가지 화합물은 유사한 시험법에 의해 조사되며 그 결과는 다음과 같다.

- 아트라진(Atrazine)

- 디에틸-헥실프탈레이트(Diethyl-hexylphthalate)

- 에틸아세테이트(Ethylacetate)

가수분해 pH 함수 결과 요약

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

시험물질 : 아트라진

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	0.546	0.416	76.3	0.076～0.948	4
3.0	20 40 60	0.014 0.140 0.808	0.008 0.082 0.379	56.8 58.4 49.1	0.005～0.020 0.028～0.222 0.282～1.283	3 6 5
7.0	20 40 60	- 0.009 -	- 0,011 -	- 124.8 -	- 0.001～0.016 -	2 2 -
9.0	20 40 50 60	0.013 0.008 -	0.016 0.010 -	130.1 123.7 -	0.001～0.024 0.001～0.015 -	- 2 - 8(7 lab)

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

가수분해 pH 함수 결과 요약

반감기(t1/2)

시험물질 : 아트라진

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	54.76	44.36	81.0	20.3～115.35	4
3.0	20 40 60	1867.88 240.50 31.42	77.0 99.6 69.0	77.0 99.6 69.0	980.7～353714 111.71～696.79 15.0～68.3	3 6 5
7.0	20 40 60	- 9000.15 -	- 123.0 -	- 123.0 -	- 1198.1～16802.2 -	2 2 -
9.0	20 40 60	17921.05 8005.35 -	135.0 119.0 -	135.0 119.0 -	817.4～35024.7 1259.9～14750.8 -	2 2 -

가수분해 pH 함수 결과 요약

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

시험물질 : DOP

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	-	-	-	-	-
3.0	20 40 60	0.048 0.166 0.084	0.051 0.202 0.022	107.8 121.8 26.3	0.009～0.106 0.023～0.309 0.068～0.099	3 2 2
7.0	20 40 60	0.073 (1.627) (0.092)	0.064 - -	88.8 - -	0.027～0.118 - -	2 1 1
9.0	20 40 60	0.040 (0.126) -	0.040 - -	135.0 119.0 -	0.007～0.073 - -	2 1 -

가수분해 pH 함수 결과 요약

반감기(t1/2)

시험물질 : DOP

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	-	-	-	-	-
3.0	20 40 60	990.20 452.56 239.33	996.32 551.98 63.75	101 122 27	182.4～2103.5 62.25～842.86 194.25～284.41	3 2 2
7.0	20 40 60	440.30 (11.83) (208.19)	391.35 - -	89 - -	163.57～717.02 - -	2 1 1
9.0	20 40 60	1606.74 (152.53) -	1898.79 - -	118 - -	265.51～2947.97 - -	2 1 -

가수분해 pH 함수 결과 요약

105 ℓ/s에서의 반응비율상수

시험물질 : 에틸아세테이트

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	-	-	-	-	1
3.0	20 40 60	(0.0012) (0.012) (0.355)	- - -	- - -	- - -	1 1 1
7.0	20 40 60	(0.003) (0.008) (0.137)	- - -	- - -	- - -	1 1 1
9.0	20 40 60	(0.063) (0.153) (1.547)	- - -	- - -	- - -	1 1 1

가수분해 pH 함수 결과 요약

반감기(t1/2)

시험물질 : 에틸아세테이트

pH 수치	온도(℃)	평균치	표준편차	변화상수	범위	n°
1.2	35～40	-	-	-	-	-
3.0	20 40 60	(01656) (1612.85) (54.30)	- - -	- - -	- - -	1 1 1
7.0	20 40 60	(7553.1) (2511.81) (140.38)	- - -	- - -	- - -	1 1 1
9.0	20 40 60	(305.55) (125.71) (12.44)	- - -	- - -	- - -	1 1 1

3. 보고서 양식

o 실험실 :

o 시험물질 :

o 날짜 :

시험 프로토콜

A. 예비시험수행여부

□ 예              □ 아니오

사용된 완충 체계

pH 4.0 ..............................................................................................................................

pH 7.0 ..............................................................................................................................

pH 9.0 ..............................................................................................................................

pH	4.0	7.0	9.0
포화농도 근사치 (mole/ℓ)
C0(초기농도, mole/ℓ)
Ct (t일 경과 후의 최종농도, tmax=5, mole/ℓ)
t
[eqn: {C_{0}-C_{t}} over { C_{0}}×100%] (50±0.1 ℃)

B. 측정결과

(1) 시험물질

선택된 온도들에서 pH 4.0, 7.0, 9.0으로 나누어 측정하고 선택된 온도 중 하나(상승된 온도에서 측정하는 경우에는 중간 온도)를 택해 한 번 더 측정한다.

1) pH 4.0

사용된 완충용액 .................................................................................................

온도 .......................................................................................................................

포화농도 근사치 .................................................................................................

t [     ] 0

Ct(mole/ℓ)
log Ct

2) pH 7.0

사용된 완충용액 .................................................................................................

온도 .......................................................................................................................

포화농도 근사치 .................................................................................................

t [     ] 0

Ct(mole/ℓ)
log Ct

3) pH 9.0

사용된 완충용액 .................................................................................................

온도 .......................................................................................................................

포화농도 근사치 .................................................................................................

t [     ] 0

Ct(mole/ℓ)
log Ct

(2) pH 1~2에서의 가수분해

사용된 완충용액 .................................................................................................

pH ..........................................................................................................................

온도 .......................................................................................................................

포화농도 근사치 .................................................................................................

t [     ] 0

Ct(mole/ℓ)
log Ct

(3) 최종 데이터

pH	온도 (C)	초기농도 C0 (mole/ℓ)	반응비율상수 Kobs (ℓ/s×105)	반감기(T1/2)	상관계수 r2

C. 시험방법에 관한 보고서

(1) 시험조건에 대한 구체적 기술

1) 멸균상태 유지에 관한 사항

2) 광분해 효과를 피하기 위한 방법

3) 산소를 배제시키기 위한 대책

4) 시험용액 조제에 관한 사항

(별도의 기록지를 사용할 것)

(2) 연계 분석법 관련 정보

pH 전극
UV-vis spectrophotometry
전도도(conductivity)
G. C.(gas chromatography)
HPLC (high pressure liquid chromatography)
유도체 추출 및 형성 (extraction and formation of derivatives)

(3) 분석 세부 사항

기기 종류 .............................................................................................................

시험 조건 .............................................................................................................

(4) 다른 어떠한 방법에서 있어서도 본 실험의 정확성을 확신하는가?

1) 특수한 상황 :

2) 소견 :

* 주 3 : W. Mabey and T. Mill, "Critical Review of Hydrolosis of Organic Compounds in Winter Under Environmental Conditions", J. Phys, Chem.Ref. Data 7 (2), 383-415(1978).

제 12 항  물에서의 해리상수 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

수용액 중에서 일어나는 화학물질의 해리는 환경에 대한 영향을 평가하는데 중요하며, 반응이나 전이 상태에 따라 물질의 형태가 좌우된다. 그렇기 때문에 어떠한 화학물질이 가지는 물에서의 해리상수를 측정하는 일은 물질의 특성에 관한 연구만이 아니라 환경에 대해서 대상 화학물질이 미치는 영향을 연구하는 데 있어서도 중요하다. 본 시험법 지침의 목적은 화학물질이 물에서 가지는 해리상수를 측정하는 것이며 이를 수행하기 위한 시험법 세 가지(적정법, 분광 광도법, 전도도 시험법)를 제시한다.

본 시험을 수행하기 전에 적합한 분석방법과 물질의 용해도, 구조식 에 대하여 조사해 둘 것을 권장하는 바이며 전도도 시험법을 수행할 경우에는 전기 전도율 등을 사전에 조사해 두면 유용한 자료로서 활용할 수 있다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서 사용되는 표준물질과 시험물질은 가장 순도가 높은 것을 사용해야 하며, 시험물질에 존재할 수 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다. 본 시험법에 속하는 세 가지 시험 중 적정법(titration method)은 용해도가 낮은 화합물에 적용하기에는 부적합하며 분광 광도법은 감지할 수 있는 정도의 서로 다른 UV-VIS 흡수 스펙트럼을 가지고 있는 화합물들에만 적용이 가능하다. 하지만 분광 광도법은 용해도가 낮은 화합물에 적용하여도 좋으며, 비산/비염기 해리에도 적합한 장점이 있다(예. 복합체 형성). Onsager식을 갖는 경우에 전도법이 사용되고 일반적으로 저농도 그리고 비산/염기 평형인 경우에도 사용한다.

3. 정의

해리란 두 개 또는 그 이상의 이온화되는 화학물질로 분리되는 가역반응이며 이것은

RX  ⇌ [eqn: R ^{+}] + [eqn: X ^{-}]

으로 표현될 수 있다. 이 때, 반응에 관여하는 농도 평형상수는

K=[eqn: {LEFT [ R ^{+} RIGHT ] LEFT [ X ^{-} RIGHT ]} over {LEFT [ RX RIGHT ]}]

로 나타낼 수 있다. 예를 들어, R이 수소(시험물질은 산)인 경우와 같이 특수한 경우, 상수는 다음과 같이 표현된다.

KA=[eqn: LEFT [ H ^{+} RIGHT ] {LEFT [ X ^{-} RIGHT ]} over {LEFT [ HX RIGHT ]}] 또는 pKa= pH - log[eqn: {LEFT [ X ^{-} RIGHT ]} over {LEFT [ HX RIGHT ]}]

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다. 아래에 제시된 표는 본 시험에 사용되는 대표적인 표준물질에 대한 목록이다.

	pKa	온도(℃)
파라니트로 페놀(p-Nitrophenol)	7.15	25
벤조산(Benzoic acid)	4.12	20
파라클로로아닐린(p-Chloroaniline)	3.93	20
구연산(Citric acid)	3.14	20
	4.77	20
	6.39	20

2. 시험법 원리

일반적인 화학공정은 주위 온도 범위 내에서 온도에 의존하는 경향이 약간 있다. 해리상수를 측정하려면 화학물질이 분리된 형태 및 분리되지 않은 형태에서의 농도를 측정할 필요가 있다. 앞서 언급된, 정의 부분에서 나타낸 해리반응 화학량론(stoichiometry) 정보로부터 적절한 상수를 결정할 수 있다. 본 지침에 기술되어 있는 특별한 경우로서 산이나 염기처럼 행동하는 것이 있는데, 이것을 측정함에 있어 시험물질이 이온화된 형태와 이온화되지 않은 형태의 상대적인 농도 및 용액의 pH를 측정하는 방법을 사용하면 매우 편리하다. 이러한 용어들 사이의 관계는 앞서 언급된 정의 부분의 pKa에 관한 관계식으로 주어진다. 일부 화합물들에는 하나 이상의 해리상수가 존재하는데, 이로 인해 원래 관계식과 유사하지만 완전히 일치하지는 않는 관계식이 개발될 수 있다. 본 지침에 기술되어 있는 시험법들은 비산성/비염기 해리에 대해서도 적용할 수 있다.

3. 품질 기준

본 시험에 있어서의 재현성에 대하여 판단하고자 한다면 최소 3회 이상 측정했을 때 해리상수가 ±0.1 log 단위 내에서 재현되는지를 고려한다.

4. 시험 방법

pKa를 결정하려면 기본적인 두 가지 방법으로 접근할 수 있다. 그 중 첫 번째 방법은 표준 산이나 표준 염기로 양을 알고 있는 물질을 적정하는 것이며, 두 번째 방법은 이온화되었거나 이온화되지 않은 형태에서의 상대 농도 및 pH 의존도를 측정하는 것이다.

4.1. 조제

본 지침에 수록된 원리를 기반으로 하는 시험법들은 적정, 분광 광도 및 전기 전도도 수순 등으로 분류할 수 있다.

4.1.1. 시험용액

적정법과 전기 전도도법에서는 시험하고자 하는 화학물질을 증류수에 용해시키고 분광광도법이나 그 외의 시험법을 적용하려 한다면 완충용액을 사용한다. 이 때, 시험물질의 농도는 0.01 M 미만이 되어서도 안 되며 포화농도의 반을 초과해도 안 된다. 또한 용액을 조제할 때 가장 순수한 형태의 시험물질을 사용해야 한다. 만일 시험물질이 용해도가 좋지 않은 물질이라면 앞서 언급한 농도만큼을 더하기에 앞서, 소량의 물에 녹을 수 있는 용매에 시험물질을 용해시켜도 무방하다.

보조용매(co-solvent)를 사용해서 용해도를 향상시키려 하는 경우, 우선 틴들 빔(tyndall beam)을 사용하여 용액에 에멀젼이 존재하는지를 점검해야 한다. 한편 완충용액을 사용하는 경우에는 완충용액의 농도가 0.05 M이 넘어가지 않도록 주의한다.

4.2. 시험 조건

4.2.1. 온도

시험은 20 ℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 이 때 온도 편차가 ±1 ℃ 이내로 조절되어야 한다. 만일 온도 의존성이 크다고 추정된다면 시험온도로 정해진 온도 이 외에 최소 두 개의 온도를 선정하여 시험을 수행해 본다. 이 때 선정하는 온도들은 원래 온도와 10 ℃ 이상 차이가 있으면 곤란하며, 마찬가지로 온도 편차를 ±1 ℃로 조절하도록 한다.

4.2.2. 분석

시험에 사용하려는 물질의 특성에 따라 분석방법이 결정되며, 분석에 적용하고자 하는 분석방법은 분석하려는 농도의 시험용액에 존재하는 다양한 화학종들을 측정할 수 있을 만큼의 민감도를 지녀야 한다.

4.3. 적정법(titration method)

적정법에서는 표준 산이나 표준 염기 용액으로 시험용액을 적정하는데, 적정제(titrant)를 각각 첨가한 후 pH를 측정한다. 평형에 도달하기 이전에 최소 10 개 이상의 부가액(incremental addition)을 만든다. 평형이 신속하고 충분하게 진행되었다면, 전위차계(potentiometer)를 사용하여 기록한다. 이 때, 중요한 사항은 시험물질의 총량과 농도가 정확하게 알려져 있어야 한다는 사실이다. 그리고 시험 전에 반드시 이산화탄소를 제거해야 함에 주의해야 한다. 시험수순에 관한 구체적 사항이나 주의사항 및 계산법은 주 1, 2, 3, 4에 나타난 표준 시험법을 참조한다.

4.4. 분광 광도법(spectrophotometric methods)

파장은 이온화된 형태의 화합물이나 이온화되지 않은 형태의 화합물이 분명하게 서로 다른 흡수계수를 가지는 경우에 발견된다. UV-VIS 흡수 스펙트럼은 물질이 본질적으로 이온화되지 않거나 완전히 이온화되는 pH 조건과 일부 중간 pH 조건 하에서 농도가 일정한 용액으로부터 얻어진다. 이런 현상은 초기의 pH가 높고(또는 낮고) 다양한 조성으로 구성된 완충용액에 녹인, 상대적으로 부피가 많은 화합물 용액에다가 농축된 산(또는 염기) 증가분을 더한 경우에 그러하거나 또는 물이나 메탄올을 용매로 하여 용해시켜 놓은 화합물 저장 용액 동 부피를 원하는 pH 범위를 포함하는 다양한 완충용액 일정 부피에 더함으로써 그렇게 될 수 있다. 선택된 파장의 pH와 흡광도로부터 pKa에 관한 값들을 충분하게 계산해 낼 수 있는데, 이 때 화합물이 10 % 이상에서부터 90 % 이하까지 이온화되는 범위 안에 있는 pH 다섯 군데로부터 산출된 데이터들을 계산하는 데에 사용한다. 실험에 관한 더 구체적인 사항이나 계산법들은 주 1에 주어져 있으니 참고한다.

4.5. 전도도 시험법(conductometric method)

셀 상수가 알려져 있는 셀을 사용하여, 농도가 약 0.1 M이고 전도성 있는 물에 녹아 있는 화합물 용액에 대한 전도도를 측정한다. 그리고 정확하게 조제된 이러한 용액 다수에 대한 전도도 역시 측정한다(이 농도는 측정할 때 마다 반으로 하며, 측정하는 농도들은 최소한의 규칙성을 가지고 있어야 한다). 극도로 희석된 용액에서 전도도가 제한되는 현상은 나트륨 염을 사용한 유사 실험을 실시하고 외삽을 해보면 알 수 있다. 그 다음으로 Onsager 관계식을 사용해서 각 용액의 전도도로부터 해리도를 계산할 수 있으며, C가 리터 당 몰 단위의 농도라고 하고 α가 해리된 일부 단편이라고 했을 때, Ostwald 용액 법칙을 사용하여 해리상수를 K=α2C/1-α로 계산해 낼 수 있다. 이 때, CO2가 배제되도록 해야 한다는 사실에 주의한다. 시험에 대한 더 구체적인 사항이나 계산법 등은 표준 문건 및 주 1, 5, 6에 제시되어 있으니 참고한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

1.1. 적정법

pKa는 적정 곡선상의 10 개 측정 지점으로부터 계산할 수 있다. 그렇게 pKa값의 평균과 표준편차도 계산할 수 있다. 한편, 표준염기나 표준산에 대하여 도시한 pH는 표의 형식으로 만들어 제시하도록 한다.

1.2. 분광 광도법

각 스펙트럼 별 흡광도와 pH를 표 형식으로 만들어 제시한다. 그리고 중간 스펙트럼 데이터 지점들로부터 최소한 5 개 이상의 pKa값을 계산해 내고, 이러한 결과들의 평균과 표준편차를 계산한다.

1.3. 전도도 시험법

Λ는 당량전도(equivalent conductance)로 산성 농도 각각에 대하여 계산되며, 또한 1 당량의 산에 0.98 당량의 탄산이 없는 수산화나트륨(carbonate-free sodium hydroxide)을 더한 혼합물 각각에 대하여 계산된다(과량의 산은 가수분해에 의해서 OH-가 과량이 되는 것을 방지). 그리고 1/Λ는 [eqn: sqrt {C}]및 0 농도에 외삽하여 알 수 있는 염의 Λ0값에 대하여 도시한다. 산의 Λ0값은 H+ 및 Na+ 참고치를 사용해서 계산할 수 있고, pKa값은 농도 각각에 대해서 α=Λi/Λ0 및 Ka=α2C/1-α에서 계산할 수 있다. 이동성과 활성을 수정하면 더욱 좋은 Ka값을 얻을 수 있다. pKa값의 평균과 표준편차 역시 계산하여야 한다.

2. 시험 보고서

모든 시험 기초 자료 및 산출된 pKa값들을 제출하는데, 이 때 앞서 기술된 계산법과 함께 제출한다(주 1에서 제시된 바와 같이 표형식을 갖추는 것이 좋음). 적정법에 관해서는 적정제의 표준화에 대한 구체적인 내용을 제시해 준다. 그리고 분광 광도법에 관해서는 모든 스펙트럼에 대한 사항을, 마지막으로 전도도 시험법에서는 셀 상수 측정에 대한 구체적인 내용을 보고해야 한다. 시험에 사용된 기술적인 정보, 분석 방법 및 완충용액의 성질 등도 제시하고 시험 온도 역시 보고해야 한다.

* 주 1 : Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of A cids and B ases, Wiley, Inc., New York, 1962.

* 주 2 : Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).

* 주 3 : ASTM D 1293 - Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

* 주 4 : Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

* 주 5 : ASTM D 1125 - Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

* 주 6 : Standard Method 205 - APHA/AWWA/NPCF.

제 13 항  공기 중 안정성과 열 안정성에 관한 스크리닝 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 다른 시험을 수행함에 있어 지침을 제공하기 위하여 시험 물질의 열과 공기에 대한 안정성을 사전에 판단하는 것에 있다.

본 시험 지침서에서 논의되는 저장 안정성 측정 시험법들은 균질한 고체 및 액체물질에 적용할 수 있고 이러한 물질들의 혼합물에도 적용할 수 있다.

발열분해과정(exothermic decomposition process)은 시차열분석(differential thermal analysis, DTA)으로 측정할 수 있다. 흡열효과를 측정하려면 반응이 분해반응이며 상 전이(phase transition)가 일어나지 않는 것이 확인되어야 한다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서는 고순도(pure grade) 및 일반순도(commercial grade)의 시험물질이 사용되는데, 시험물질에 존재할 수도 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다.

3. 정의

3.1. 열분석(Thermal analysis, TA)

어떠한 물질의 물리적 수치 변화를 측정하여 온도의 함수로 나타내는 분석 시험법을 설명하는 일반적인 용어

3.2. 시차열분석(DTA)

시료와 표준물질 간의 온도 차를 측정하여 시간의 함수 또는 온도의 함수로서 나타냄

3.3. 열중량 분석(Thermogravimetric analysis, TGA)

등온과정(isothermal procedure)이나 비등온과정(anisothermal proced-

ure)으로 어떠한 물질의 중량 변화를 측정하여 시간의 함수나 온도의 함수로서 나타냄

3.4. 피크(peak)

기준선으로부터 기록되는 곡선의 상향, 하향 최고 편차

3.5. 피크온도(peak temperature)

최대 피크에서의  온도

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

본 시험에 사용하기에 적합한 표준물질은 요소(urea), 4-니트로소페놀(4-nitrosophenol), α-나프틸아민(α-naphthylamine), 나프탈렌(naphthalene) 등이 있다. 표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다.

2. 시험법 원리

2.1 가속 저장 시험

장기간 저장했을 때의 불안정성은 단기간 동안 높은 온도를 적용하는 것으로 모의 시험해 볼 수 있다. 이러한 “선별시험(screening test)”은 CIPAC에서 제시한 “살충제의 안정성 시험에 대한 권장사항(주 1)”에 기술되어 있다. 이 시험에서는 시험물질을 54~55 ℃ 온도로 14 일 동안 저장한 다음 분석한다. 간단한 시험의 경우, 이 시험을 수행함으로써 시험물질의 저장 전과 저장 후 특성(예. 녹는점)을 측정할 수 있다.

2.2 열분석 시험법(Thermal analysis methods)

시료와 표준 표준물질을 시험에 맞게 결정된 가스체 내에서 일정한 비율로 최종 온도까지 가열하고, TGA나 DTA 장치 혹은 연계 시스템 내에서 시료의 중량 변화나 열흡수/방출량을 측정하여 기록한다. 화학반응의 양상이 예측 가능한 시료에 대하여 조사된 온도 범위 내에 피크가 관찰되면, 즉시 그 피크가 생성된 온도 부근에서 열분석을 반복 실시해야 한다.

3. 품질 기준

3.1 반복성

DTA와 TGA는 화학물질의 열 안정성을 측정하는데 있어 널리 알려진 방법이다.

3.2 감도

본 시험법의 감도는 측정 장치(장비 종류)와 시험 조건의 감도에 의해서 측정된다.

3.3 표준화 가능성

열분석 시험조건의 표준화에 대한 정보를 얻으려면 주 2(McAdie, 1967)를 참고한다.

3.4 자동화 가능성

자동화될 가능성이 있다.

4. 시험 수순

4.1 가속 저장 시험법

4.1.1 장치

(1) 자동으로 온도가 조절되는 오븐

(2) 시료를 담을 용기(250 ㎖ 비이커, 유리병, 봉합된 앰플 등)

4.1.2 진행 수순

병에 시료 20 g을 담는다. 이 때, 시료가 휘발성 물질이라면 봉합된 앰플(ampoule)에 넣는다. 시험용 가스체로는 포화 수증기 기체를 사용한다. 시료용기를 꽉 밀봉하고 14 일 동안 55±2 ℃의 오븐에 둔다. 14 일이 지난 다음 시료용기를 오븐에서 꺼내어 실온으로 냉각시키고, 적당한 방법(예. 녹는점 측정)으로 분해가 일어났는지 또는 시료가 다른 화학물질로 변했는지를 측정한다.

4.2 DTA와 DSC

4.2.1 장치

DTA나 DSC 장치는 일반적으로 널리 사용되는 종류의 장치이다(그림 1, DTA의 블록 다이어그램 참조). 열 흐름 방식과 에너지 보상 방식에 적용된 방법은 두 장치 모두 동일하다. 휘발성 물질의 경우 밀폐된 시료용기를 사용하거나 압력을 상승시킨 상태에서 측정한다.

4.2.2 시험조건

시험에 사용되는 시료용기는 다양한 종류를 사용할 수 있는데, 개방형 또는 봉합형 유리 튜브, 금속 접시(pan) 또는 항압 도가니(crucible) 등을 사용할 수 있다. 단, 산소가 포함된 가스체 환경 하에서 측정하려면 개방형 시료용기 만을 사용해야 한다.

시험 가스체로는 질소와 일반 공기를 사용한다. 일반 공기를 사용할 경우 시료를 개방형 접시에 두고 시험한다.

그림  DTA 장치의 블록 다이어그램

1. 2-채널 기록계

2. D.C. 증폭기

3. 퍼니스

4. 측면 열원

5. 온도 조절기

6. 시료물질 도가니 P와 열전대(thermocouple)

7. 표준물질 도가니 V와 열전대

8. 열전대 접속점

시험하려는 온도범위 안에서 아무런 변화가 없을 경우에는 비활성 표준물질을 선택한다. 비활성 대조시료의 열전도율과 열용량은 조사하려는 시료와 거의 같아야 한다. 비활성 물질을 시험하려는 경우에는 알루미늄 옥사이드(aluminium oxide)를 많이 사용한다.

4.2.3 진행 수순

시료를 5~50 ㎎ 칭량하여 시료용기 안에 넣고 닫는다. 가열하는 비율은 분당 2~20 K 범위 이내가 되도록 한다. 제일 먼저 정상 압력에서 시험물질의 DTA 다이어그램(그림 2 참조)이 기록된다.

만일 열에 의한 효과(피크)가 실온과 150 ℃ 사이에서 발견되면 다음과 같이 진행한다.

(1) 발열효과에 의해서 피크가 나타난 경우, 분해가 일어난 것으로 가정한다.

(2) 흡열효과에 의해서 피크가 나타난 경우, 그 피크의 온도와 시험물질의 녹는점을 비교해야 한다.

(3) 피크가 녹는점과 관계가 없는 흡열효과에 의해 나타난 경우라면, 더 높은 압력(10~50 bar)에서 DTA를 다시 실시하거나 밀폐된 시료용기로 다시 실시해 보아야 한다. 높은 온도에서 피크가 바뀌었다면, 그것은 증발 과정에 의한 것으로 볼 수 있다.

(4) 흡열효과가 용융(melting)에 의해서도 증발에 의해서도 나타난 것이 아니라면, 피크가 나타난 온도 주위에서 가열 사이클 과정을 다시 수행해 본다. 피크가 지속되지 않으면 화학적 전환이 일어난 것이다.

그림 2 DTA 곡선

T : 참조물질의 온도

ΔT : 시료와 참조물질간의 온도차이

4.3 TGA

4.3.1 장치

일반적으로 널리 쓰이는 TGA 장치는 일반 공기와 비활성 가스체에서 시험물질을 가열할 수 있도록 디자인되어 있다(그림 3 참조).

그림 3 TGA 장치의 다이어그램

W	천칭 지지 빔	ND	0점 판독기
P	시료	MS	자석 코일(무게로 보정)
O	퍼니스	SG	제어기
S	기록장치	TP	온도조절 프로그램

4.3.2 시험조건

시험에 사용하는 가스체는 일반적으로 질소와 일반 공기이다. 시험에는 산화에 안정한 공기를 가스체로서 사용한다.

4.3.3 진행 수순

약 10~500 ㎎ 정도의 시료를 질소와 공기 중에서 가열하고 중량 손실을 기록해 둔다. 가열하는 비율은 분당 2~20 K 범위 이내가 되어야 한다. 시험물질의 증발에 의해 발생하지 않은 중량 손실은 분해에 의해 발생한 것으로 간주한다.

만일 150 ℃ 이하의 온도에서 분해가 일어나는 것이 관찰된 경우, 등온 측정법으로 분해율을 측정할 수 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 해석

다음과 같은 경우 시험물질이 실온에서 안정한 것으로 간주한다.

(1) “가속 저장 시험(CIPAC-Test)”에서 녹는점(도는 그 외의 특성)이 일정했거나 또는 분석에 의해서 측정되어 줄어든 시험물질의 양이 원래 함량의 5 %가 안 되는 경우

(2) DTA나 TGA를 실시한 결과 분해가 일어나지 않았거나 150 ℃ 이하에서 화학적 전환이 발견된 경우

2. 시험 보고서

시험 보고서에는 다음과 같은 정보들이 수록되어야 한다.

(1) 가속 저장 시험

- 시료용기의 종류

- 화학적 전환을 측정한 방법

- 전형적인 특성 변화 내용 또는 14 일 간 저장한 후 발생한 분해 백분율

(2) 열분석

- 사용한 장치의 종류

- 전처리와 시료 형태

- 표준물질과 시험물질에 대한 정확한 정보

- 조사 온도범위, 온도증가 비율, 등온 수순에 관한 온도 내역

- 물질의 양

- 시험 가스체의 조성과 순도

- 시료용기 종류

- 시험이 끝난 후와 시험 수행 중에 관찰된 시료의 변화

- 화학적 전환이 시작된 온도

- 본 시험법으로부터의 이탈 상황

- 분해산물이 발생했다면 그 분해산물의 성질에 관한 내용

* 주 1 : CIPAC Handbook, Volume I. Analysis of Technical and Formulated Pesticides, G R. Raw, ed., Collaborative International Pesticides Analytical Council Ltd., p. 951 f., (1970).

* 주 2 : H. G. McAdie, Anal. Chem. 39,543 (1967) and H. G. McAdie, Z. anal. Chem. 231,36(1967)

제 14 항  액체 점도 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

유체의 점성(viscosity)은 유체가 토양으로 침투하는 성질과 환경적인 연관성을 가지게 되며, 그러한 이유로 유체의 점성이 지하수에서 나타나는 유해한 효과와 관련성을 가지게 될 수도 있다. 그러나 이 문제에 관하여 점성 하나만을 고려하는 것은 충분하지 못한데, 왜냐하면 이러한 문제에는 점성과 더불어 흡습성, 혼화성 및 용해성 뿐만 아니라 표면장력까지도 일부 영향을 미치기 때문이다.

낮은 점성의 방향성에는 환경적으로 관계된 제한이 없다. 점성이 낮으면 유체는 토양으로 더욱 쉽게 스며든다. 실온에서 액체의 가장 낮은 점도(dynamic viscosity)는 약 0.2 mPas로서, 이 점도는 20 ℃ 물이 지닌 점성도의 1/5이라고 한다. 한편, 높은 점성에 대한 방향성의 제한에 대해서는 정확하게 언급하기가 어렵다. 점도가 약 107 mPas 이상이 되면 토양으로 침투하기에 점성도가 너무 높아서 침투가 이루어지지 않는다.

반죽이나 연고 등과 같이 수득치(yield value)를 가지는 물질의 경우, 수득치가 초과된 이후 점성도가 낮아진 상태이더라도 여전히 토양으로 침투되지 않았을 가능성이 있다. 그 물질이 물에 녹을 수 있거나 에멀젼 상태가 될 수 있다면, 유량 한계가 존재하더라도 환경적인 문제를 일으킬 수 있다.

2. 시험의 제한사항

본 시험법 지침에서 소개될 다섯 가지 시험법들의 원리는 뉴튼 액체(Newtonian liquids)를 대상으로 하는 조사에 적합하다. 비-뉴튼 액체(non-Newtonian liquids)는 회전 점도계(rotational viscometer)로만 측정할 수 있다.

3. 시험 전 수집 정보

(1) 회전구 점도측정시험법(rolling ball viscometer method)을  수행하기 위한 밀도 정보

(2) 녹는점/녹는 범위

(3) 끓는점/끓는 범위

4. 편차계수(Coefficient of variation)

편차계수는 시험대상 화학물질이 어떤 것이냐에 따라 좌우되며, "OECD 실험실 비교 시험, partⅠ(1979)"에서 제시된 평균치로부터 계산한다. 그러나 특별한 언급이 없으면, 편차계수의 범위는 0.004~0.09까지이다.

5. 정의 및 단위

점도(viscosity)이란 유체물질이 변형률에 따라 변형되는 과정 중에서 응력을 흡수하는 특성이다. 즉, 응력은 변형률의 원인으로 볼 수 있다. 전단응력 τ와 전단율 D에 관한 방정식은 다음과 같다.

τ = η × D

여기에서, η은 점도(dynamic viscosity)를 나타낸다.

뉴튼 액체의 점성은 모든 전단률에서 일정하고 압력과 온도 변화에 의해서만 좌우되는 반면, 비-뉴튼 액체의 점성은 전단률에 따라 달라진다.

압력이 적용되지 않은 모세관 점도계로 측정된 점성은 밀도에 대한 점성도의 비율로써 얻어지는데, 이것을 동점도(kinematic viscosity) ν라고 부르기도 한다.

점성도의 SI 단위는 Pascal second(Pas)이다. 실제로 사용할 때에는 약수(submultiple)를 사용하는 것이 더욱 편리하다. 기본적인 단위는 1 mPas=10-3 Pas이다(현재는 거의 쓰이지 않는 cgs 시스템에서는 1 센티푸아즈(centipoise, cP)).

한편, 동적 점성도의 SI 단위는 square metre per second(㎡/s) 이며 이것으로부터 square millimetre per second(㎟/s, cgs 시스템에서는 1 ㎟/s=1 센티스토크, cSt)가 유도된다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

표 1에 제시된 표준물질 목록은 IUPAC에서 권장하는 목록에서 발췌한 것이다.

2. 시험법 원리

점도 측정은 주로 다음과 같은 3 가지의 측정원리에 따라 수행한다.

(a) 중력 하에서 모세관(모세관점도계 또는 플로우컵)을 통과한 유량

(b) 농도 실린더, 원추형 판, 평형 판(회전 점도계) 간의 유체 전단

(c) 점도는 액체로 채워진 수직 실린더 튜브나 기울어진 실린더 튜브(예. Höppler 회전구 점도계, 낙차구 점도계 등) 안에 존재하는 구의 움직임으로 측정

Höppler 점도계를 사용할 때에는 점도를 계산하기 위한 밀도가 반드시 알려져 있어야 한다.

표 1 표준물질 목록(IUPAC)

화학물질 명(n°)	확인된 수치 및 정확도	출처	비고
미네랄 오일 류 (탄화수소물, 부분적인 천연물, 부분적인 합성제품)	20 ℃에서 1 mPas에서 27,000 mPas까지 (1.25 ㎟/s에서 30,000 ㎟/s까지) ±0.2 %의 불확실성이 있음 4,000 mPas 이상에서는 ±0.3 %	1	수준 측정기(level)가 달린 모세관점도계에 의해 측정된 뉴튼 액체 20 ℃～100 ℃ 사이의 다른 온도에 관한 자료 있음
Type JS 2.5-2000 (액체 10종)	mPas 단위의 점도 및 ㎟/s 단위의 동점도 확인됨 점성 범위 : 20 ℃에서 2～1,800	3
Type 60 H	20 ℃에서 60,000 ㎟/s	3
Type 200 H	20 ℃에서 200,000 ㎟/s,	3
미네랄 오일	20 ℃에서 11～1,000 mPas (±0.1 %)	2	뉴튼 액체 밀도와 동점도도 확인됨
미네랄 오일	20 ℃에서 103～104 mPas (±0.5 %)
Polyisobutene	20 ℃에서 104～105 mPas (±1.5 %)		뉴튼 액체 로타리 실린더 점도계 방법 사용
미네랄 오일 11 종	20 ℃에서 mPas 단위로 점도 확인됨 범위는 1.503±0.1 %～1729±0.2 %	4	동점도와 밀도 확인됨 50 ℃, 80 ℃에 대한 자료 있음
Polyisobutylene 7 종	20 ℃에서 mPas 단위로 점도 확인됨 범위는 4,170±1.3 %～589×103±1.0 %	4	50 ℃, 80 ℃, 100 ℃에 대한 자료 있음

* 출처의 숫자단위는 실험결과가 보고된 국가를 나타낸다.

1. 독일

2. 헝가리

3. 일본

4. 폴란드

3. 품질 기준

시험에 적용하고 범위를 측정하며 표준화하는데 필요한 액체 점도 측정 시험법 비교자료를 아래의 표 2에 수록하였으니 품질기준에 참고한다.

표 2 품질 기준

측정방법	점도 (mPas)	동점도 (㎟/s)	측정 범위 (mPas 또는 ㎟/s)	표준법	필수 항온범위(℃)
모세관 점도계		X	0.5～105	ISO 3104	±0.1
플로우 컵 점도계		X	8～700	ISO 3105	±0.5
회전 점도계	X		10～109	ISO 3218.2	±0.2
회전구 점도계	X		0.5～105	국제표준은 없음 DIN 53015참조	±0.1
낙차구 점도계	X		0.5～107	국제표준은 없음 DIN 52007 part2(초안) 참조	±0.1

4. 표준화 가능성

본 시험법에 대한 표준화 가능성은 표 2를 참조한다.

5. 자동화 가능성

자동화될 가능성이 있다.

6. 시험 절차

6.1. 시험장치

6.1.1. 모세관 점도계

모세관 점도계 디자인은 아래에 나열된 자료에 기술되어 있다

* ISO 3104; ISO 3105; DIN 51550; DIN 51562 part 1; DIN 51372; ASTM D-1200-70; ASTM D-2393; ASTM D-914 part 25 ~ part 37; ASTM D-88-56.

6.1.2. 회전 점도계

회전 점도계에 관한 표준법들은 극히 일부를 제외하고, 흐름의 형태, 전단응력 범위, 속도각 및 특정 물질과 관련된 일반적인 시방서를 포괄한다.

* ISO 3219-1977; DIN 51398; DIN 51377; DIN 53214 ;DIN 51366; DIN 53019 part 1; DIN 52312 part 2; DIN 53921; ASTM D-562-55; ASTM D-3346-74; ASTM D-2983.

6.1.3. 강제 구 점도계(forced ball viscometer)

강제 구 점도계는 아래와 같은 국제적 표준에 최적화되어 있다.

* DIN 53015, DIN 52007 part 2, ASTM D-914 part 25~37.

6.2. 시험조건

점도를 측정할 때마다 시험이 수행되었던 온도가 얼마였는지 제시되어야 한다. 주로 20 ℃에서 한 번, 20 ℃보다 높은 온도에서 또 한 번을 측정하는 것이 일반적이다(온도 조절범위는 표 2를 참조). 각 온도 별로 최소 2 회 이상 측정한다.

6.3. 시험 수행

시험을 수행할 때에는 각각의 표준법에 따라 수행한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

점도를 측정한 결과는 모세관 점도계 및 강제 구 점도계 표준법에 따라 평가를 수행한다. 회전 점도계의 경우에는 뉴튼 액체에 한해서만 최적화되어 있다. 비-뉴튼 액체에서 얻어낸 결과들은 다양한 유동 법칙에 적합하다는 가정 하에서 해석되어야 하는 플로우 커브 형태로 나타나는 경향이 있다.

2 시험 보고서(구체화된 시험 및 평가 수행서)

시험보고서는 시험에 적용된 표준법에 따라 작성하며, 각 시험온도에 따라 얻어진 개별 수치들과 평균치를 포함해야 한다. 표준 시험법으로부터 이탈된 사항이 있었다면 구체적으로 기록해야 한다.

제 15 항  수용액에서의 표면장력 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 각기 다른 점도를 지닌 다양한 수용액들의 표면장력을 측정하는 데 있다. 본 시험법의 장점은 물질의 순도와는 상관없이 대부분의 수용액상 물질에 적용할 수 있다는 점이며, 시험을 수행하기 전에 물에 대한 용해도, 물질의 구조, 가수분해 특성, 마이셀(micelle) 형성에 관한 핵심 농도 등과 같은 사전 정보를 확보하면 더욱 효율적으로 시험을 수행할 수 있다. 본 시험법에 대한 기본적인 원리는 주 1에 제시되어 있다.

2. 시험의 제한사항

시험물질의 물에 대한 용해도가 1 mg/ℓ보다 낮은 물질은 시험할 필요가 없으며, 링 장력 시험법(ring tensiometer method)으로 표면장력을 측정하려면 점성도(dynamic viscosity)가 200 mPa 미만인 수용액이어야 한다.

3. 정의 및 단위

표면적 단위당 자유표면 엔탈피는 표면장력으로 표현된다. 즉 SI 단위로는 N/m이고 지수단위는 10-3 N/m로 표현된다. 현재는 잘 쓰이지 않는 cgs 단위계로 환산하면 1 N/m=103 dynes/㎝이고 10-3 N/m=1 dyne이다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다. 표면장력과 관련된 표준물질 목록은 주 2에 제시되어 있다.

2. 시험법 원리

본 시험법은 액체의 표면에 접촉한 등자(stirrup)나 링을 표면으로부터 분리하기 위해서 수직으로 걸리는 힘을 측정하거나 표면과 접촉한 면을 가진 평판에서 형성되어 있는 막을 끌어당기기 위해서 수직으로 나타나는 힘을 측정하는 방법에 기초한다.

3. 시험방법

3.1. 평판 시험법(Plate method)

이 시험법은 ISO 표준법 304(주 3)에 자세히 기술되어 있다.

3.2. 등자 시험법(Stirrup method)

이 시험법은 ISO 표준법 304(주 3)에 자세히 기술되어 있다.

3.3. 링 시험법(Ring method)

이 시험법은 ISO 표준법 304(주 3)에 자세히 기술되어 있다.

3.4. OECD 링 시험법(OECD harmonized ring method)

이 시험법은 ISO 표준 304(주 3), DIN 53914(주 4), ASTM-D-1590(주 5) 그리고 ASTM-D-1331(주 6)를 기본으로 한다.

4. 장치

4.1. 장치의 구성

일반적인 장력측정기(tensiometer)를 사용하면 된다. 시험장치의 구성은 다음과 같다.

(1) 이동 가능한 시료 테이블

(2) 힘(force) 측정 시스템

(3) 측정 물체(링)

(4) 측정용기

4.2. 시료테이블

시료 테이블은 측정용기를 지지하는데 사용되며 힘 측정 시스템과 같이 고정하여 세팅한다.

4.3. 힘 측정 시스템

힘 측정 시스템은 시료 테이블 위에 위치시킨다. 힘 측정 시 오차는 ±10-6 N을 초과하면 안 되며, 질량 측정에 있어서도 오차 한계가 ±0.1 ㎎ 이내여야 한다. 대부분의 장력측정기의 측정범위는 mN/m에서 계산되며 0.1 mN/m의 표면장력을 읽어낼 수 있는 정확도를 가지고 있다.

4.4. 링

링은 일반적으로 대략 0.4 ㎜ 두께의 백금-이리듐 와이어로 만들어져 있으며 평균 둘레는 약 60 ㎜ 정도이다. 링은 힘 측정 시스템과 연결하는 목적으로 설치하는 금속 핀과 와이어 마운팅 브라켓(wire mounting bracket)으로부터 수평으로 걸려있다(그림 1 참조). 만약 링이 수평으로 걸려있지 않으면 결과에 오류가 생길 수 있다(주 8).

4.5. 측정용기

시험용액을 담는 측정용기는 온도가 조절되는 유리용기이다. 측정용기는 측정하는 동안 시험용액과 시험용액 위에 존재하는 가스의 온도가 일정하게 유지되도록 디자인되어야 하며 시료가 증발되지 않아야 한다. 원통형 유리용기는 내부직경이 45 mm 이하이면 된다.

그림 1 힘 측정 장치 (단위 : ㎜)

5. 시험 전 준비

5.1. 세척

측정용기는 꼼꼼히 세척한다. 필요 시 뜨거운 크롬-황산액(chromo-sul

furic acid)으로 세척한 다음, 끈적한 인산(H3PO4 무게의 83~98 %)과 수돗물(tap water)로 헹구고 중성 반응이 나타날 때 까지 2 차 증류수(double-distill

ed water)로 세척한다. 그 후 건조시키거나 측정하려는 액체로 헹군다.

링은 우선 전체적으로 물에 헹구어 물에 녹을 수 있는 물질을 제거하고, 크롬-황산액에 잠시 담궈 둔 다음, 중성 반응이 나타날 때까지 2 차 증류수로 세척하고 마지막으로 알콜 램프(methanol flame)로 잠시 동안 가열한다.

실리콘 등과 같이, 크롬-황산액이나 인산 용액으로도 용해되거나 파괴되지 않는 오염물질들은 적절한 유기 용매를 사용하는 방법 등을 동원하여 제거해야 한다.

5.2. 영점(zero point) 조정

시험장치들은 장력측정기에 부착되어 있는 기포관 수준기(spirit level) 등을 이용해서 수준 조정 나사(adjusting the levelling screws)로 조절해야 한다. 그리고 링을 기기 위에 놓고 액체 표면과 수평한 지를 점검한다. 이를 위해 액체 표면을 거울로써 사용할 수 있다. 링을 액체에 담그기 전에 장력측정기를 영(0)으로 조정한다. 이 때, 분동이나 물을 사용해서 보정할 수 있다.

5.3. 분동을 사용한 보정

질량이 0.1~1.0 g으로 알려진 분동을 링에 위치시킨다. 보정계수(calibration factor) Φa(모든 장비에서 두 번씩 읽어야 함)는 다음에 주어진 식으로 나타난다.

Φa=[eqn: {sigma _{r }} over {sigma _{a}}]

여기에서

σr=[eqn: {mg} over { 2b}](mN/m)

이며, m = 분동의 질량(g)

g = 중력 가속도(해발 0m에서 981 ㎝/s2)

b = 링의 평균 둘레(㎝)

σa = 링에 분동을 위치시킨 다음 읽은 장력측정기의 수치(mN/m)

이다.

5.4. 물을 사용한 보정

순수한 물을 사용해서 진행되는 보정의 경우 질량을 사용해서 보정하는 경우보다 더 빨리 수행되는 장점이 있지만, 불순물이 일시적인 계면활성제로 작용하여 물의 표면장력(예. 23 ℃에서 72.3 mN/m)을 변화시킬 우려가 있다. 보정계수 Φb는 다음과 같이 주어진다.

Φb=[eqn: {sigma _{o}} over {sigma_{ g}}]

여기서, σo = 참고문헌에서 인용된 물의 표면장력 참고치(mN/m)

σg = 측정된 물의 표면장력 (mN/m)

이며, 온도가 같아야 한다.

6. 조제

시험용액은 증류수로 조제하며 포화 용해도의 90 % 농도가 되도록 한다. 이 때, 조제한 시험용액의 농도가 1 g/ℓ를 초과하게 되면 시험에는 1 g/ℓ의 농도를 사용한다. 먼지나 가스 같은 이물질들은 측정에 방해가 되므로 보호 커버를 장착시킨 상태에서 시험을 수행한다.

7. 시험조건

시험은 20 ± 0.5 ℃에서 실시하도록 한다.

8. 시험 수행

측정하려는 수용액은 거품이 발생되지 않도록 조심스럽게 측정 용기로 옮기고, 옮긴 시간을 기록해 둔다. 측정용기를 시험장치 위에 놓고 링이 시험 용액 표면 아래로 잠길 때까지 들어올린다. 그 후, 링이 표면에서 떨어지도록 힘이 최대가 될 때까지 테이블 상단 부분을 약 0.5 ㎝/min의 속도로 점차 낮춰간다. 이 때 힘은 장력측정기로 판독한다. 링과 붙은 액체의 외곽은 링에서 떨어져서는 아니 된다. 첫 번째 측정이 끝난 다음, 일정한 표면장력 수치에 도달할 때까지 시험을 반복한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 처리

표면장력을 계산하기 위해서는 먼저 시험장치로부터 mN/m 단위로 얻어진 수치들을 보정수순에 따라서 보정계수 Φa나 Φb로 변환시켜야 한다. 이렇게 얻은 수치들은 근사치이므로 보정 작업이 필요하다. Harkens와 Jordan(주 8)은 링의 넓이, 액체의 밀도 및 액체의 표면장력에 따른 보정계수를 경험적으로 산출해 내었다. 그렇지만 시험을 실시할 때마다 Harkens와 Jordan 표로부터 보정계수를 산출하는 것은 어려운 일이므로, 액체 수용액에 적용할 수 있는 단순화된 수순을 사용해도 무방하다. 뒤에서 제시될 표 1에서 보정된 표면장력 수치를 택한다. 내삽법(interpolation)은 표의 수치들 간의 범위를 읽어내는데 사용된다. 표는 Harkins-Jordan의 보정 자료에 기초한다. 이것은 물과 액상 용액(밀도=1 g/㎤)에 관한 표준법 DIN 53914(주 4)와 유사하며 평균 반경이 9.55 ㎜이고 와이어 반지름이 0.185 ㎜인 통상적인 링을 사용하는 시험에 적용된다. 표에는 무게로 보정하거나 물로 보정한 다음 사용할 수 있는 측정 보정수치가 제시되어 있다.

사전에 보정과정을 수행하지 않은 경우라면 다음 식에 의해서 표면장력을 계산할 수 있다.

[eqn: sigma = {f TIMES F} over {4 pi R}]

여기서, F = 막이 깨지는 순간에 검력기(dynamometer)로 측정한 힘

R = 링의 반경

f = 보정계수(주 8, 9)

이다.

2. 시험보고서

시험 보고서에는 다음의 내용이 포함되어야 한다.

(1) 사용된 시험법

(2) 사용된 물과 액체 형태

(3) 물질에 대한 정확한 사양(특성 및 불순물)

(4) 측정결과 : 해독된 데이터, 데이터의 산술평균 및 보정된 평균, 용액의 농도

(5) 시험온도

(6) 용액을 사용했던 기간, 특히 용액을 조제하여 측정한 사이에 소요된 시간

(7) 용액을 측정용기에 옮긴 후 나타나는 표면장력의 시간 의존성에 대한 설명

(8) 결과 해석과 관계된 모든 정보, 특히 불순물이나 물질의 물리적 상태와 같은 정보

표 1 측정된 표면장력의 보정

ρ ≈ 1 g/㎤ (수용액에 한하여)

R = 9.55 mm (평균 링 반경)

r = 0.185 mm (링 와이어 반경)

실험수치 σ‘ (mN/m)	보정수치σ (mN/m)
	물 보정치	무게 보정치
20 22 24 26 28 30	18.1 29.1 22.1 24.1 26.1 28.1	16.9 18.7 20.6 22.4 24.3 26.2
32 34 36 38 40	30.1 32.1 34.1 36.1 38.2	28.1 29.9 31.8 33.7 35.6
42 44 46 48 50	40.3 42.3 44.4 46.5 48.6	37.6 39.5 41.4 43.4 45.3
52 54 56 58 60	50.7 52.8 54.9 57.0 59.1	47.3 49.3 51.2 53.2 55.2
62 64 66 68 70	61.3 63.4 65.5 67.7 69.9	57.2 59.2 61.2 63.2 65.2
72 74 76 78	72.0 - - -	67.2 69.2 71.2 73.2

* 주 1 : Weissberger, R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Vol. I, Part I, Physical Methods of Organic Chemistry, Chapter XIV, 3rd ed., Interscience Publ., New York.

* 주 2 :  Pure Appl. Chem. (1976). 48, 511.

* 주 3 :  ISO 304 (1985)

* 주 4 : DIN 53914

* 주 5 : ASTM D 1590

* 주 6 : ASTM D 1331

* 주 7 : Gaonkar and Neuman (1984). J. Colloid. Interface Sci. 98, 112.

* 주 8 : Harkins, W.D. and Jordan, H.F. (1930). J. Amer. Chem. Soc., 52, 1751.

* 주 9 : Fox, H.W., and Chrisman, C.H. (1952). J. Phys. Chem., 56, 284.

제 16 항  고체, 액체의 지방용해도 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험의 목적은 어떠한 물질(고체나 액체)의 지방에 대한 용해도를 측정하는 것으로서, 어떠한 물질의 지방 용해도는 생체 조직 내에서 지방에 녹을 수 있는 물질들이 저장되는 것에 대한 평가 데이터의 하나이다. 지방용해도는 물에 대한 용해도가 너무 낮아서 분배계수를 측정하기 어려운 경우에 더욱 유용하게 활용될 수 있으며, 또한 지방용해도는 포장재에 있던 화학물질들이 음식으로 옮겨가는 현상과도 관련이 있다.

2. 시험의 제한사항

본 시험법은 순수한 물질에만 적용할 수 있다. 시험물질은 최소 24 시간 동안 50 ℃의 온도에서 안정해야 하며 같은 조건에서 휘발성이 있어서는 곤란하다. 중성 지방과 중성 기름은 조성이 명확하게 알려져 있지 않은 관계로 지방용해도를 측정하는데 사용되어서는 안 된다. 트리글리세라이드(triglyceride)와 반응하는 물질은 본 시험 방법을 적용 할 수 없다.

3. 정의

지방용해도(fat solubility)는 액상 지방(오일)과 화학반응을 일으키지 않고 균일한 상(phase)을 형성하는 물질에 대하여 그 혼합 물질 내 존재하는 해당 물질의 질량분율로서 정의한다. 그러한 질량분율의 최대치를 포화 질량분율이라 하며, 이것은 온도의 함수이다.

지방의 구성은 유기체마다 각각 다르며, 심지어는 한 유기체 안에서도 다른 구성을 이루고 있을 수 있다. 바람직한 결과를 얻기 위해서 여러 실험실에서 얻어진 결과를 서로 비교하는데 필요한 것이 표준 지방이다. 표준 지방은 자연적으로 발생하는 물질들과 구성 및 작용 양상에 있어서 서로 유사해야 하는데, 부록에서 소개된 일반적인 트리글리세라이드 혼합물(triglyceride mixture)이 이러한 요구사항에 적합하여 표준 지방으로서 사용하기 적당한 물질이다. 어떠한 물질의 포화 질량분율은 표준 지방의 g/kg 단위 및 37±0.5 ℃와 관련하여 주어진다. 다음은 용액 1,000 램 당 그램 용해도(S')와 용매 1,000 그램 당 그램 용해도(S) 간에 존재하는 관계식을 나타낸 것이다.

[eqn: S= {1000 TIMES S´} over {1000 -S´ }]

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

아래의 내용은 필수적으로 사용되는 사항은 아니지만 참고자료로서 활용할 수 있다.

	지방용해도(g/1,000 g(지방))
hexachlorobenzene	11.4(11.1～12.1)
mercury(Ⅱ)chloride	20.1(14.7～24.3)
urea	0.17(0.05～0.28)

2. 시험법 원리

시험물질을 액상 “표준 지방”에 녹이고, 적절한 분석 시험법으로 측정된 질량분률 의존적 변수가 일정한 수치에 도달할 때까지 지속적으로 첨가하여 시험물질의 포화 질량분율을 구한다.

3. 품질 기준

3.1. 반복성

본 시험의 반복성에 대하여서는 현재까지도 알려진 바가 없다.

3.2. 감도

본 시험법의 감도는 분석 과정에서의 감도에 의해 결정된다.

3.3. 특이성

시험결과에는 반드시 표준 지방을 적용해야 하며, 상대적으로 순수한 물질에 적용하는 것이 적합하다. 표준 지방은 37 ℃에서 에멀젼이나 고체 물질 현탁액 형태일 수 있는데, 이런 경우 질량분율을 측정하는 후속 시험에 방해가 될 수 있으므로 표준 지방이 에멀젼이나 현탁액 형태가 되는 것을 피해야 한다.

4. 시험 수순

4.1. 시험 전 준비

4.1.1. 장치

시험을 수행하기 전에 다음과 같은 장치를 준비한다.

(1) 실험용 유리기구 일체

(2) 저울

(3) 자동온도조절이 되는 원심분리기

(4) 온도조절기와 연결된 교반기

(5) 서모스탯(자동온도조절장치) 또는 항온조

4.1.2. 예비시험

본 시험을 실시하기 전에 예비시험을 실시하여야 하는데, 예비시험의 목적은 시험온도(37 ℃)에서 포화 질량분율을 구하는데 필요한 시험물질의 양을 결정하기 위함이다. 고체물질의 경우 포화 평형상태에 이르는 속도는 입자 크기에 의존하는 바가 클 수 있다. 그러므로 그런 물질들로 시험해야 할 경우에는 잘게 분쇄한 후 시험을 실시한다.

4.1.3. 시험물질 조제

8 개의 시료를 칭량하여 50 ㎖ 플라스크에 담아 둔다. 이 때, 칭량하는 양은 포화되는데 필요한 양(예비시험에서 측정한)의 두 배가 되어야 한다. 녹여서 섞어 놓은 표준 지방 약 25 g을 더한 다음, 교반기에 설치한 플라스크 마개를 잘 닫는다. 준비한 플라스크의 반(그룹 I)은 30 ℃, 나머지 반(그룹 II)은 약 50 ℃에서 각각 한 시간 가량 교반한다.

4.2. 시험조건

지방 용해도 측정 시험은 37±0.5 ℃에서 수행한다.

4.3. 시험 수행

두 그룹으로 나눈 플라스크들을 37±0.5 ℃에서 교반하는데, 어느 정도까지 교반을 해야 평형에 이를지는 예측하기 어렵다. 액체물질일 경우 수 분 이내에 포화될 수 있지만, 고체물질일 경우에는 몇 시간이 걸릴 수도 있다. 액체의 경우, 교반하는 시간은 3 시간이면 충분하며, 3 시간 교반 후, 두 그룹에서 플라스크 두 개씩을 골라 교반을 멈추고 녹지 않은 시험물질이 분리되어 균일한 상을 형성하도록 37 ℃에서 적어도 한 시간 이상 방치한다. 에멀젼이나 현탁액이 형성(예. 틴들(Tyndall) 효과)된다면 자동온도조절 원심분리기를 사용하는 등의 적절한 방법으로 에멀젼이나 현탁액 상태를 제거해 주어야 한다. 한편, 두 그룹에서 아직 남아있는 세 번째 플라스크와 네 번째 플라스크는 37±0.5 ℃에서 한 시간 동안 방치하기 전에 최소 24 시간 동안 교반해 주어야 한다. 이 과정을 수행한 후에 침전물이 없거나(고체물질) 상분리가 없을 경우(액체물질), 많은 양의 시험물질로 다시 시험해야 한다.

4.4. 분석

각각의 포화 지방 상으로부터 하나씩의 시료를 취해 분석을 실시한다. 이 때, 취해지는 시료의 중량을 기록하고 질량분율을 그 물질에 특정지어진 분석 시험법으로 측정하는데, 이에 적합한 분석 시험방법으로는 다음과 같은 것들이 있다.

(1) 광학적 방법

(2) G.C.(가스크로마토그래피)

(3) 물을 사용한 추출을 실시한 다음 매질에서 직접 측정하거나 유기용매로 역추출하여 측정하는 방법

III. 시험결과 및 보고

1. 결과 처리

불포화, 과포화에 의해서거나 또는 각 과정에 소요된 시간이 짧거나 길었던 것에 의해서 시험결과에 중대한 편차가 발생하였다면, 오랜 시간동안 다시 교반한 후 시험을 반복한다.

2. 시험 보고서

시험결과는 앞서 기술된 바대로 평가되어야 하며, 그대로 시험 보고서에 수록한다.

만일 관찰된 결과에 큰 편차가 없으면 각각의 수치와 평균값, 표준 편차를 보고서에 기록한다. 그러나 결과에 중대한 편차가 있다면, 재시험한 결과라 할지라도 각각의 수치만 보고서에 기록하도록 한다.

아래에 제시된 항목들 역시 보고서에 포함해야 한다.

(1) 시험물질(시험물질의 조제 및 특성 등에 관한 구체적 사항)

(2) 지방(특성, 기원, 설명 등)

(3) 분석방법, 편차, 특이사항 등

* 주 : 표준 지방에 대하여

1. 개요

일반적으로 많이 사용되는 표준 지방은 HB 307(NATEC 社, 독일)이다. HB 307은 지방산과 포화 트리글리세라이드의 합성물이며 코코넛의 지방과 트리글리세라이드 분포가 유사하다.

2. 표준 지방(HB 307)의 지방산 분포

지방산 내 탄소원자 수	6	8	10	12	14	16	18	기타
GLC 범위(%)	0.5	7.5	10.3	50.4	13.9	7.8	8.6	1

3. 표준 지방의 글리세라이드 분포

지방산 내 탄소원자 수	22	24	26	28	30	32	34	36
GLC 범위(%)	0.1	0.3	1.0	2.3	4.9	10.9	13.9	21.1
지방산 내 탄소원자 수	38	40	42	44	46	48	50
GLC 범위(%)	16.1	11.7	9.8	4.4	2.2	1.1	0.2

4. 표준 지방의 순도

글리세라이드 단량체 함량	0.1 % 이하
디글리세라이드 함량	0.4 % 이하
불감화* 함량	0.1 % 이하
Wijs 수	0.5 % 이하
산(acid)의 수	0.02 %
물 함량(K. Fischer)	0.1 % 이하
녹는 점	28.5 ℃

- 불감화(不鹼化, Unsaponifiable) : 알칼리로 비누화 되지 않는 성질

5. 표준 지방(HB 307)의 흡수 스펙트럼

(막 두께 d=1 cm, 비교대상 : 35 ℃의 물)

파장(nm)	290	310	330	350	370	390	430	470	510
투과율(%)	2	15	37	64	80	88	95	97	98

- 303 nm에서 최소한 10 %의 빛이 투과 할 것

제 17 항  HPLC 분배계수(n-옥탄올/물) 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 화학물질의 환경적 거동(environmental fate) 연구에서 핵심이 되는 파라미터인 Pow(옥탄올/물 분배계수)를 HPLC를 사용하여 구하는 것에 있다. 어류에서 어떠한 물질의 Pow와 체내 생물학적 축적량 간에 상관관계가 높다는 사실이 증명되었다. 또한 Pow는 토양과 침전물에서의 흡수를 예측하고 광범위한 생물학적 효과에 관한 구조-활성 관계를 정량적으로 수립하는데 유용한 것으로 알려져 있다.

-2에서 4 사이의 log Pow 범위 내의 Pow값은 플라스크 진동법(the shake-flask method, OECD 시험법 107번)으로 측정할 수 있다. 한편, 0에서 6 사이의 log Pow 범위 내에 있는 Pow값들은 HPLC를 사용해서 측정할 수 있다(주 1~4). HPLC 시험법에서는 일반적으로, 계산을 통해서 사전에 Pow값을 평가해 둘 필요가 있다. 이 때의 계산법은 본 지침의 부록에 간략하게 소개되어 있다.

2. 시험의 제한사항

이 시험에서 사용되는 표준물질과 시험물질은 가장 순도가 높은 것을 사용해야 하며, 시험물질에 존재할 수도 있는 불순물에 의한 영향을 고려하여야 한다.

3. 정의

분배계수(P)는 서로 섞이지 않는 두 용매로 구성된 2 상 시스템에 용해된 시험물질의 평형 농도의 비율로서 정의된다. n-옥탄올(n-octanol)과 물의 경우,

Pow=[eqn: {C _{n-옥탄올}} over {C _{물}}]

와 같이 정의되며, 두 농도의 지수가 되는 분배계수는 무한하거나 10을 밑(base)으로 하는 정상 로그치 형태로 표현된다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 모두 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적이 있을 때 사용한다.

화학물질의 Pow값과 측정된 용량계수 K값을 서로 연관시키려면 최소 6 개 지점을 사용하여 보정 그래프를 그려야 한다. 사용자가 적당한 표준물질을 선정하는데, 이 때 가능하면 적어도 하나 이상의 표준물질의 Pow값은 시험물질의 Pow값보다 높아야 하며, 다른 것들은 시험물질의 Pow값보다 낮아야 한다. 4 이하의 log Pow값들은 플라스크 진동법에서 산출된 데이터들을 기반으로 보정할 수 있으며, 4 이하의 값들이 계산된 수치들과 일치한다면 참고치를 기본으로 하여 보정할 수 있다.

주 5와 6에는 다양한 종류의 화학물질들에 대한 넓은 범위의 log Pow 수치 목록이 제시되어 있다. 구조적으로 관련 있는 화합물들의 분배계수 데이터가 없을 경우, 다른 표준물질로 실시된 좀 더 일반적인 보정법을 사용해도 좋다. 이에 대한 권장 표준물질들과 그에 따른 Pow 수치가 표 1에 제시되어 있다. 이온화될 수 있는 물질들에 대해서는 그 물질들이 이온화되지 않은 형태일 경우에 이 수치들을 적용할 수 있다. 실험실 간 비교시험을 수행하는 동안에는 이 수치들의 개연성(plausibility)과 신뢰성(quality)에 관해서 점검해 볼 필요가 있다.

2. 시험법 원리

HPLC는 화학적으로 실리카와 결합된 긴 탄화수소 사슬(예. C8, C18)을 지닌 고체상(solid phase)으로 채워진 분석 컬럼 상에서 수행된다.

컬럼에 주입된 화학물질들은 이동상(mobile solvent phase)과 탄화수소 고정상(hydrocarbon stationary phase) 사이를 따라 분리되면서 이동하며, 수용성 화학물질들이 먼저 용출되고 지용성 화학물질들이 나중에 용출되는 순서로, 탄화수소와 물에 대한 각자의 분배계수 비율에 따라 남아 있게 된다. 이 때문에 역상(reverse phase) 컬럼 상에서 잔류하는 시간과 n-옥탄올/물 분배계수 간의 관계가 구축된다. 분배계수는 아래와 같이 표현되는 용량계수 K로부터 추론된다.

K = [eqn: {t_{R}-t _{o}} over {t _{o}}]

여기에서, tR은 시험물질의 잔류 시간이며, t0는 용매 분자들이 컬럼을 통과하는데 소요되는 평균 시간이라고 할 수 있는 데드 타임(dead-time, 불감(不感) 시간)이다. 정량적인 분석 방법에서는 잔류 시간을 측정하는 것 외에는 필요하지 않다. 만일 표준 표준물질을 사용할 수 있고 실험 조건이 표준적인 상황이라면, HPLC 시험법이 플라스크 진동법보다 더 빠르게 수행될 수 있다.

HPLC를 사용하면 0에서 6 사이의 log Pow 범위 내에서 분배계수를 계산해 낼 수 있다. 단, 강산이나 강염기, 금속 복합체, 용출된 물질들과 반응하는 물질 또는 계면 활성제를 시험하는 데에는 적용할 수 없다. 이온화될 수 있는 물질들은 그 물질이 이온화되지 않은 형태(자유산(free acid)이나 자유염기(free base))에서 측정해야 하는데, 이 때 반드시 자유산에 대해서는 pK 이하의 pH 완충용액을 사용해야 하고 자유염기에 대해서는 pK 이상의 완충용액을 사용해야 한다(예. pH=2에는 인산, pH=7.5에는 0.01~0.02 M 인산 완충용액).

HPLC 시험법은 플라스크 진동법보다 시험물질 내의 불순물에 덜 민감하다. 그럼에도 불구하고 불순물에 의해서 피크가 불확실하게 나타나는 것 때문에 결과를 해석하기 어려워지는 경우도 있다. 불확실한 결과가 나타난 혼합물에 대해서는 log P의 상한과 하한이 정해져야 한다(주 3).

3. 품질 기준

측정 상 신뢰도를 높이려면 2회 중복 측정을 실시하여야 한다. 각 측정에서 유도된 log Pow값은 ±0.1 log 단위 범위 내에 들어야 한다.

실험실 간 비교시험에서 HPLC 시험법의 log Pow값이 플라스크 진동법의 ±0.5 단위 이내에서 산출될 수 있음이 증명되었다(주 7). 그리고 이 밖에도 여러 비교자료들이 주 3, 4, 8, 9, 10에 수록되어 있다. 구조적으로 관련된 표준물질들에 기초하여 작성된 상관관계 그래프는 가장 정확한 결과를 제공한다(주 11).

4. 시험 수순

4.1. 분리계수 예비평가

시험물질의 분리계수는 주로 보정법(부록 참조)으로 계산되거나, 순수한 용매 내에서의 시험물질의 용해도 비율을 사용해서 계산된다(주 12).

4.2. 장치

시험을 수행하려면 편차와 진동 없는 고성능 펌프(pulse-free pump)가 장착된 액상 크로마토그래프와 적절한 감지장치가 필요하다. 주입 밸브는 주입 고리(injection loop)가 있는 것을 사용하는 것이 좋다. 고정상에 극성을 띄는 작용기(functional group)가 있는 경우 HPLC 컬럼의 동작에 심각한 손상을 줄 수 있다. 그러므로 고정상에는 극성을 띄는 기의 함유량을 최소화해야 한다(주 13). 이 때, 상용화된 미세입자 역상 패킹이나 패킹되어 있는 컬럼(ready-packed column)을 사용한다. 가드 컬럼(guard column)은 주입 시스템과 분석 컬럼 사이에 위치해야 한다.

4.3. 이동상

용출 용매를 만들 때에는 HPLC 등급 메탄올과 증류수를 사용해서 조제하며, 사용하기 전에 가스를 제거한다. 이동상 용매의 구성성분이 일정한 일정용매조성법(isocratic elution)을 사용해야 한다. 시험에 사용되는 메탄올과 물의 비율은 물의 함량이 최소 25 %여야 한다. 일반적으로 부피비가 3:1인 메탄올-물 혼합물이 유량 1 ㎖/min에서 한 시간 내에 log P가 6인 화합물을 용출시키는데 최적화되어 있다. log P가 6 이상인 화합물에서는 이동상의 극성을 줄이거나 컬럼 길이를 줄임으로써 시험물질의 용출 시간(과 표준물질들의 용출시간)을 단축시킬 필요가 있다.

시험물질과 표준물질은 검출이 가능할 만큼 충분한 농도가 이동상에 녹을 수 있어야 한다. 예외적인 경우에 한해서만 메탄올-물 혼합물과 함께 첨가물을 사용할 수 있는데, 왜냐하면 첨가물들이 컬럼의 성질을 변화시키기 때문이다. 이런 경우에는 종류가 같은 컬럼을 쓰되, 분리된 컬럼을 사용해야 한다. 메탄올-물 혼합물을 사용하기 곤란한 경우에는 에탄올(ethanol)-물이나 아세토니트릴(acetonitrile)-물 혼합물과 같은 유기용매-물 혼합물을 사용할 수 있다.

용출 물질의 pH는 이온화될 수 있는 화합물의 경우에 있어 중요하다. 일반적으로 pH는 컬럼이 작동하는 pH 범위인 2에서 8 사이가 되어야 하며 완충 용액을 사용할 것을 권장한다. 일부 유기상이나 완충 혼합물에 의해 발생할 수 있는 염(salt) 침전물과 컬럼 기능 저하가 발생하지 않도록 주의한다. pH 8 이상의 실리카 고정상으로 수행하는 HPLC 측정은 알카라인 이동상을 사용하여 컬럼의 기능을 저하시키기 때문에 권장할 만하지 못하다.

표 1. 권장 참조 화합물

참고물질	log Pow	pKa
2-Butanone	0,3
4-Acetylpyridine	0,5
Aniline	0,9
Acetanilide	1,0
Benzil alcohol	1,1
4-Methoxyphenol	1,3	pKa=10,26
Phenoxyacetic acid	1,4	pKa=3,12
Phenol	1,5	pKa=9,92
2,4-Dinitrophenol	1,5	pKa=3,96
Benzonotrile	1,6
Phenylacetonitrile	1,6
4-Methylbenzil alcohol	1,6
Acetophenone	1,7
2-Nitrophenol	1,8	pKa=7,17
3-Nitrobenzoic acid	1,8	pKa=3,47
4-Chloraniline	1,8	pKa=4,15
Nitrobenzene	1,9
Cinnamic alcohol	1,9
Benzoic acid	1,9	pKa=4,19
p-Cresol	1,9	pKa=10,17
Cinnamic acid	2,1	pKa=3,89 cis
		4,44 trans
Anisole	2,1
Methyl benzoate	2,1
Benzene	2,1
3-Methylbenzoic acid	2,4	pKa=4,27
4-Chlorophenol	2,4	pKa=9,1
Trichloroethene	2,4
Atrazine	2,6
Ethyl benzoate	2,6
2,6-Dichlorobenzonitrile	2,6

참고물질	log Pow	pKa
3-Chlorobenzoic acid	2,7	pKa=3,82
Toluene	2,7
1-Naphthol	2,7	pKa=9,34
2,3-Dichloroaniline	2,8
Chlorobenzene	2,8
Allyl phenyl ether	2,9
Bromobenzene	3,0
Ethylbenzene	3,2
Benzophenone	3,2
4-Phenyl phenol	3,2	pKa=9,54
Thymol	3,3
1,4-Dichlorobenzene	3,4
Diphenylamine	3,4	pKa=0,97
Naphthalene	3,6
Phenyl benzoate	3,6
Isopropylbenzene	3,7
2,4,6-Trichlorophenol	3,7	pKa=6
Biphenyl	4,0
Benzyl benzoate	4,0
2,4-Dinitro-6 sec.butyl phenol	4,1
1,2,4-Trichlorobenzene	4,2
Dodecanoic acid	4,2
Diphenyl ether	4,2
Phenanthrene	4,5
n-Butylbenzene	4,6
Fluoranthene	4,7
Dibenzyl	4,8
2,6-Diphenylpyridine	4,9
Triphenylamine	5,7
DDT	6,2

4.4. 용질

시험이나 보정을 목적으로 사용하는 화합물은 가능하면 이동상에 녹이는 것이 좋다.

4.5. 시험조건

측정 중 온도는 ±2 ℃ 이상 변화가 생기면 안 된다.

4.6. 데드타임(t0) 측정

데드타임 t0는 남지 않는 유기화합물(예. 티오유레아(thiourea)나 포름아마이드(formamide))을 사용하여 측정할 수 있다. 또한 약 일곱 종류의 동족열(homologous series, 예. n-알킬메틸케톤(n-alkylmethylketone)) 일체에 관하여 측정된 잔류시간으로부터 유도될 수 있다(주 14). 잔류시간 tR(nc+1)은 tR(nc)에 대하여 그려지는데, nc는 탄소원자의 수이다. 일차방정식 tR(nc+1)=A․tR(nc)+1-A(t0)에 의해 직선이 구해지는데, A는 상수로서, k(nc+1)/k(nc)를 나타낸다. 데드타임은 절편 (1-A)t0와 기울기 A에서 구해진다.

4.7. 보정 그래프

다음 단계는 시험물질의 값과 가까운 log P값을 가지는 적절한 표준물질에 관하여 log P에 대한 log K의 상관 그래프를 그리는 것이다. 시험 시, 다섯 종류에서 열 종류에 달하는 표준물질들을 동시에 주입한다. 잔류시간은 검출 시스템과 연결된 기록 적분기(recording integrator)에서 측정된다. 용량계수의 상관대수, log K가 계산되고 log P의 함수로서 도시된다. 보정 작업은 일정한 간격으로 최소한 하루에 한 번은 실시하며, 컬럼 작동 상 생길 수 있는 변화를 설명해 줄 수 있다.

4.8. 시험물질의 Pow 측정

시험물질은 최대한 적은 양을 주입하고, 잔류시간은 두 번 측정한다. 시험물질의 분배계수는 보정 그래프에서 계산된 용량계수를 내삽(interpolation)하여 산출한다. 아주 낮거나 아주 높은 분배계수에 대해서는 외삽(extrapolation)을 할 필요성이 있다. 이런 경우들에 있어서는 회귀선(regression line)의 신뢰도 한계(confidence limit)에 특히 주의한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 시험 보고서

시험 보고서에는 다음의 내용을 기술해야 한다.

(1) 시험물질과 표준물질 및 물질별 순도

(2) 장비에 대한 설명과 작동 상태 : 분석 컬럼, 가드 컬럼

(3) 이동상, 검출방법, 온도범위, pH

(4) 용출 개요

(5) 데드타임 및 데드타임 측정방법

(6) 칼럼 내에 도입된 시험물질과 표준물질의 양

(7) 잔류 데이터(retention data) 및 보정에 사용된 표준물질의 log P 값 참고치

(8) 회귀선에 대한 구체적인 정보(log K 대 log P)

(9) 분배계수 사전 측정치 및 분배계수를 측정하는데 사용한 방법. 보정법이 사용된 경우, 데이터베이스에 대한 확인사항과 단편(fragment) 선택에 대한 정보를 자세히 기술할 것

(9) 평균 잔류 데이터 및 시험물질의 log P를 내삽한 값

* 주 1 : C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere 12, 1459 (1983).

* 주 2 : C.V. Eadsforth, Pestic. Sci. 17, 311 (1986).

* 주 3 : H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci. 12, 219 (1981).

* 주 4 : B. McDuffie, Chemosphere 10, 73 (1981).

* 주 5 : C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Willey, New York (1979).

* 주 6 : Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chariman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, California 91711 (1982).

* 주 7 : W. Klein, W. Kördel, M. Weisz and H.J. Poremski, Chemosphere 17, 361 (1988).

* 주 8 : L.O. Renberg, S.G. Sundstroem and K. Sundh-Nygård, Chemosphere 9, 683 (1980).

* 주 9 : W.E. Hammers et al., J. Chromatogr. 247, 1 (1982).

* 주 10 : J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat. 7, 675 (1984).

* 주 11 : S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mater. Res. 15, 787 (1981).

* 주 12 : O. Jübermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Band I/I, Allgemeine laboratoriumpraxis (edited by E. Müller), pp. 223-239, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1958).

* 주 13 : R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem. 14, 479 (1979).

* 주 14 : G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, and J. Inczédy, J. Liq. Chromat. 3, 1669 (1980).

* 주 15 : Pow 보정법

1. 개요

본 항목에서는 Pow 보정법에 대하여 간단히 소개한다. 보정된 Pow 수치는 다음과 같이 쓰인다.

(1) 실험에 적용할 방법 결정 : log Pow값이 -2~4인 경우 플라스크 진동법을 적용하고, 0~6인 경우 HPLC 방법을 적용

(2) HPLC 시험에 적용할 조건 선택(표준물질, 메탄올-물 비율 등)

(3) 실험방법을 통해 산출된 수치들의 개연성(plausibility) 확인

(4) 실험방법을 적용할 수 없는 경우 평가치 제공

2. 보정법의 원리

보정법은 신뢰할 만한 log Pow 증가치가 이미 알려져 있는, 적합한 구조의 분자에 대한 이론적 분열(theoretical fragmentation)을 바탕으로 한다. log Pow는 분자 단편들의 수치와 분자 내 상호작용 보정항목(correction term)들을 합하여 산출된다.

3. 계산수치의 신뢰도

일반적으로, 연구 대상 물질이 복잡한 구조를 가지고 있을수록 보정법의 신뢰도가 떨어진다. 분자량이 낮고 작용기가 하나 또는 둘 정도인 단순한 분자의 경우, 서로 다른 분열 시험법의 결과와 예상할 수 있는 측정치 간 편차는 0.1~0.3 log Pow 단위이다. 에러 마진은 사용된 단편상수의 신뢰성, 분자 간 상호작용의 능력(예. 수소결합) 및 보정항목의 올바른 사용에 따라 좌우된다. 이온화 화합물의 경우 전하와 이온화도를 반드시 고려해야 한다.

4. Fujita-Hansch π-방법

Fujita 등이 최초로 제안한 혐수성 치환기 상수(hydrophobic substituent constant) π는 다음과 같이 정의된다.

πX=log Pow(PhX) - log Pow(PhH)

여기에서 PhX는 방향성 유도체이며 PhH는 모화합물이다.

예시 : πCl = log Pow(C6H5Cl) - log Pow(C6H6) = 2.84 - 2.13 = 0.71

π 시험법을 적용하기 좋은 화합물은 방향족 화합물들이다.

5. Rekker 시험법

Rekker 시험법으로 log Pow값을 다음과 같이 계산한다.

Log Pow=[eqn: sum _{i} ^{} a _{i} f _{i} + sum _{} ^{} (상호작용항)]

여기에서 ai는 분자에 존재하는 단편의 수이며 fi는 단편의 log Pow 증가치 이다. 상호작용 항(interaction term)은 Cm 상수 여럿으로 된 적분으로 표현한다(그래서 Cm은 “마술 상수(magic constant)”라고도 일컬어진다). 단편상수 fi와 Cm은 다중 회귀분석을 사용하여 분석한 825 개의 화합물에서 얻어진 1,054 개의 Pow값들의 목록에서부터 결정된다. 상호작용 항은 따로 마련된 규칙에 따라서 결정한다.

6. Hansch-Leo 시험법

Hansch-Leo 시험법으로 log Pow값을 다음과 같이 계산한다.

Log Pow=[eqn: sum _{i} ^{} a _{i} f _{i} + sum _{j} ^{} b _{j} F _{j}]

여기에서 fi는 단편상수이며 Fj는 보정항목(보정요소), ai와 bj는 발생빈도이다. 보정항목 Fj에 대한 원자와 작용기의 단편적인 수치 목록은 Pow 실험값으로부터 시행착오를 겪어가며 유도된 것이다. 보정항목은 몇몇 다양한 종류로 나누어진다. 이에 대한 모든 규칙과 보정항목을 설명하는 소프트웨어 패키지가 개발되어 있다.

7. 연계 시험법

어떤 복잡한 화합물이 기존에 수행된 실험에서 제시된 신뢰성 있는 log Pow값을 적용할 수 있는 큰 구조로 나눠진다면, 그 분자의 log Pow값을 계산하는 것이 상당히 수월해진다. 그런 단편들(예. 이종 환 화합물(heterocycles), 안쓰라퀴논(anthraquinone), 아조벤젠(azobenzene))은 이후 Hansch-π 값이나 Rekker 또는 Leo 단편상수와 연계시킬 수 있다.

8. 주의사항

8.1. 보정 방법은 보정요소를 고려해야할 경우 부분적으로 이온화된 화합물이나 완전히 이온화된 화합물에만 적용할 수 있다.

8.2. 분자 간에 수소결합이 존재할 것이라 가정할 수 있는 경우, 관련 보정항목(약 +0.6~+1.0 log Pow 단위)이 추가되어야 한다. 그러한 결합이 존재한다는 사실은 스테레오 모델이나 분광학적 데이터에서 얻어낼 수 있다.

8.3. 대상 물질이 몇 가지 호변 형태(tautomeric form)가 되는 것이 가능하다면, 보정에 사용하는 형태는 가장 대표적인 형태의 것을 사용해야 한다.

8.4. 단편상수 개정목록을 이용할 때에는 주의를 요한다.

제 18 항  겔투과크로마토그래피법에 의한 고분자의 평균 분             자량 및 분자량 분포 측정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

고분자들의 평균 분자량을 조사하고 그 분자량이 어떻게 분포되어 있는지 알고자 한다면 겔투과크로마토그래피법(gel permeation chromatograp-

hy, GPC)을 사용하여 측정한다. 그러나 고분자의 특성은 매우 다양하므로, 여러 가지 고분자에서 발생되는 분리 및 평가 조건을 모두 아우르는 단일한 방법으로 기술하지는 못한다. 특히 복합적인 고분자 시스템에서는 GPC(겔투과크로마토그래피)를 적용할 수 없는 경우도 더러 발생된다. GPC를 적용할 수 없는 경우에는 본 시험법 지침 말미의 부록에 제시된 방법으로 분자량을 산정해야 한다. 그러한 때에는 그 적용 방법에 관한 사항을 상세하게 제시해야 한다.

한편, 본 시험법 지침에서 기술하는 방법은 독일규격 DIN 55672(주 1)에 기반을 둔 것이다. 시험을 시행하고 그 데이터를 평가하는 방법에 대한 세부사항은 이 규격에서 찾을 수 있다. 시험조건의 변경조정이 필요한 경우에는 합리적으로 적용해야 하며, 이 때 적용하려는 다른 시험법에 대해서 충분히 검토해야 한다. 다음의 방법에서는 이미 알고 있는 폴리머 분산성을 가진 폴리스티렌 시료를 검정용으로 이용하고 있으므로, 수용성의 폴리머나 장쇄분지형의 폴리머와 같은 폴리머류에 대해서는 적절하게 조정하여 사용할 수도 있다.

2. 정의

분자수평균 분자량 Mn 및 중량평균 분자량 Mw는 다음의 식으로 산정한다.

[eqn: M _{n} = {sum _{i=1} ^{n} H _{i}} over {sum _{i=1} ^{n} {H _{i}} over {M _{i}}}]        [eqn: M _{w} =` {sum _{i=1} ^{n} H _{i} TIMES M _{i}} over {sum _{i=1} ^{n} H _{i}}]

여기에서, Hi : 유지(체류량) 부피 Vi의 기준선에서 일탈하는 검지기 지시치

Mi : 유지 부피 Vi에서의 폴리머 분율의 분자량

n : 측정 데이터의 숫자

이다. 분자량 분포의 폭은 시스템의 분산성의 척도이고, Mw/Mn의 비율로 제시한다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

GPC는 상관적인 기법이므로, 검정을 해야 한다. 이를 위해, 조밀한 분포성과 직선성을 가지며 평균 분자량이 Mn과 Mw인 폴리스티렌 표준물질과 분자량 분포성이 알려진 물질을 통상적으로 이용하고 있다. 이러한 검정선은 미지 시료의 분자량 측정에만 이용할 수 있다. 다만 시료와 표준물질의 분리 조건이 동일한 경우이어야 한다. 분자량과 용리 부피의 상관관계도 특정한 시험의 특정한 조건에서만 이용해야 한다. 그러한 조건에는 온도, 용매(혼합물), 크로마토그래피 조건, 분리 컬럼, 컬럼 시스템 등이 포함되어야 한다. 이와 같이 측정한 시료의 분자량은 상대적인 값을 가지므로, “폴리스티렌 당량 분자량”이라고 한다. 그 의미를 보자면, 시료와 표준물질 사이의 물리적 및 화학적 차이성에 따라 그 분자량이 절대치로부터 어느 정도 일탈할 수 있는 것이다. 이 외의 다른 표준물질(예를 들면 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴 산) 등)을 사용한다면, 그에 대한 타당성을 기술하고 제시해야 한다.

2. 시험법 원리

시료와 분자량 분포, 평균 분자량(Mn, Mw)은 GPC 방법을 이용하여 산정할 수 있다. GPC는 시료를 개별 성분의 유체역학적 부피에 따라 분리하는 특정한 형태의 액체 크로마토그래피이다. 그 분리작용은 시료가 다공성의 유기성 겔로 충전된 컬럼을 통과함에 의해 발생하게 되는 것이다. 시료 중의 작은 분자는 겔의 공경을 통과하게 되지만, 큰 분자는 배제되게 된다. 큰 분자의 통로는 짧아지고, 점차 처음부터 용리되게 된다. 중간 정도 크기의 분자는 공경의 일부분을 통과하게 되어, 점차로 용리되게 된다. 겔의 공경보다 평균 유체역학적 직경이 훨씬 작은 분자는 겔의 공경을 모두 통과하게 된다. 이들은 맨 나중에 용리되게 된다.

이상적인 조건이라면, 그 분리작용은 분자 종의 크기에만 지배되게 되지만, 실제적으로는 흡수작용의 방해를 피하기 어렵다. 불균일한 충전과 사공간도 분리작용을 악화시키게 된다(주 2).

검지작용은 굴절계수나 UV-흡수작용에 영향을 받아 단순한 분포 곡선을 만들게 된다. 그러나 실제적인 분자량의 값을 그 곡선에 할당하려면, 기지의 분자량의 폴리머를 통과시켜가면서 컬럼의 눈금을 매긴다. 이상적으로는, 동일한 물리적 구조를 가진 다양한 폴리스티렌 등의 표준물질로 해야 한다. 전형적인 가우시안 곡선이 만들어지지만 그 후미 부분은 저분자량의 방향, 용리되는 다양한 분자화학종(분자종)을 나타내는 수직축의 방향, 분자량의 대수치를 나타내는 수평축의 방향으로 일그러지게 된다.

3. 품질 기준

용리 부피의 재현성(상대표준편차=RSD)은 0.3 % 이상이어야 한다. 그 크로마토그램이 시간-의존적이고 0.3 % 이상의 기준에 일치하지 않는다면, 분석에서 요구되는 재현성은 내부 표준법으로 보정해야 한다(주 1). 폴리머의 분산성은 표준물질의 분자량에 의존적이다. 전형적인 폴리스티렌 표준물질의 경우는 다음과 같다.

Mp < 2,000      Mw/Mn < 1.20

2,000 ≤ Mp ≤ 106       Mw/Mn < 1.05

Mp > 106        Mw/Mn < 1.20

(Mp는 피크 시에서의 표준물질의 분자량이다)

4. 시험 수순

4.1. 폴리스티렌 표준용액의 조제

4.1.1. 폴리스티렌 표준물질을 선정한 용리액에 조심스레 혼합하며 용해시킨다. 용액의 조제 시에는 그 제조업체의 권장사항을 준수해야 한다.

4.1.2. 선정한 표준물질의 농도는 주입 부피, 용액의 점도 및 검지기의 감도 등과 같은 여러 인자의 영향을 받는다. 최대 주입 부피는 컬럼의 길이에 적합해야 하지만, 컬럼의 용량이 초과되지 않도록 유의해야 한다. 30 ㎝×7.8 ㎜의 컬럼을 가진 GPC 분리분석장치에 대한 전형적인 주입 부피는 통상적으로 40~100 ㎕이다. 더 이상의 부피로 할 수 있지만, 250 ㎕를 초과해서는 아니 된다. 주입 부피와 농도와의 최적 비율은 컬럼의 눈금 매김 이전에 산정해야 한다.

4.2. 시료용액의 조제

시료 용액의 조제 시에도 동일한 요구사항을 적용한다. 시료를 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran ,THF)과 같은 적절한 용매에 조심스레 교반하며 용해시킨다. 어떤 조건에서도 초음파 수조에서 용해시켜서는 안 된다. 필요하다면 시료용액을 0.2~2 ㎛ 공경의 멤브레인 필터로 여과시킨다. 비용해성 입자의 존재는 보다 큰 고분자 화학종에 기인하므로 최종 보고서에 반드시 기재한다. 적정한 기법을 이용하여 비용해성 입자의 무게를 퍼센트로 표시한다. 조제 용액은 24 시간 이내에 사용한다.

4.3. 장치

GPC 장치는 다음과 같은 요소로 구성된다.

(1) 용매 저장조

(2) 가스배출기(적정한 위치)

(3) 펌프

(4) 펄스 감쇠기(적정한 위치)

(5) 주입 시스템

(6) 크로마토그래피 컬럼

(7) 검지기

(8) 유량계(적정한 위치)

(9) 데이터 기재 및 처리 시스템

(10) 폐기물 저장조

* GPC 시스템에 사용되는 용매는 시스템과 비활성관계이어야 한다(예로써, THF 용매와 스틸 모세관).

4.4. 주입 및 용매전달 시스템

일정 부피의 시료용액을 자동 샘플러나 수동샘플러로 컬럼에 조심스레 채운다. 시린지(syringe)의 플런저(plunger)를 너무 빨리 당기거나 누르게 되면, 분자량 분포에 이상을 초래할 수 있다. 가능하면 용매전달 시스템에는 펄스가 없어야 하므로, 펄스 감쇠기를 부착하는 편이 최선이다. 유량은 1 ㎖/min 정도이어야 한다.

4.5. 컬럼

시료에 따라, 1 개 컬럼이나 여러 개를 시리즈로 연결한 컬럼을 사용하여 폴리머를 특성화할 수 있다. 지정된 공경이나 배제한계 등의 특성치를 가진 다공성의 컬럼 충전물질은 시판되는 것이어야 한다. 분리 겔이나 컬럼 길이는 시료의 특성(유체역학적 부피, 분자량 분포 등) 및 분리 조건(용매, 온도, 유량(주 1, 2, 3)에 따라 달리 선정해야 한다.

4.6. 이론단(Theoretical plates)

분리용의 컬럼은 이론단의 숫자로 특성화하고 있다. 용리 용매가 THF인 경우에는 그(기지) 길이의 컬럼에 에틸벤젠의 용액이나 여타 비극성 용질의 용액으로 충전할 수 있다. 이론단의 수는 다음의 식으로 산정한다.

[eqn: N``=`5.54( {V _{e}} over {W _{1/2}} ) ^{2} ````````혹은```````N`=`16( {V _{e}} over {W} ) ^{2} ``]

N : 이론단의 수

Ve : 피크 시의 용리 부피

W : 피크 시의 기준 폭

W1/2 : 중간 높이에서의 피크 폭

4.7. 분리 효율

이론단의 수는 컬럼의 밴드 폭을 결정하는 양이므로, 검정선의 예리함에 의해 산정되는 분리 효율도 고려해야 한다. 컬럼의 분리 효율은 다음의 식으로 구한다.

[eqn: {V _{e,`Mx} ```````-```````V _{e,(10.`Mx)}} over {컬럼의`단면적} GEQ 6.0[ {㎤} over {㎠} ]]

여기에서,  Ve,Mx : 분자량 Mx의 폴리스티렌에 대한 용리 부피

Ve,(10.Mx) : 분자량이 10 배 이상 큰 폴리스티렌에 대한 용리 부피

이다. 한편, 시스템의 분해능은 다음 식으로 산정한다.

[eqn: R _{1,2} ``=``2 TIMES {V _{e1} ``-`V _{e2}} over {W _{1} ``+``W _{2}} ` TIMES ` {1} over {log _{10} ( {M _{2}} over {M _{1}} )}]

여기에서, Ve1, Ve2 : 피크 시의 2 개 폴리스티렌 표준물질의 용리부피

W1, W2 : 기준선에서의 피크 폭

M1, M2 : 피크 시의 분자량(10 배 이상으로 달라야 한다)

이다. 이 때, 컬럼 시스템의 R 값은 1.7 이상이어야 한다(주 4).

4.8. 용매

모든 용매는 고순도(THF는 99.5 % 사용)여야 한다. 용매조는 대기와 비활성적이어야 하고, 컬럼의 검정과 몇 가지의 시료 분석에 충분한 용량이어야 한다. 용매는 펌프로 컬럼에 이송되기 이전에 탈기되어야 한다.

4.9. 온도 제어

중요한 내부 요소(주입 루프, 컬럼, 검지기, 튜브 등)의 온도는 일정하고 용매의 특성과 부합되는 것이어야 한다.

4.10. 검지기

검지기의 목적은 컬럼으로부터 용리되는 시료의 농도를 정량적으로 기록하는 것이다. 피크치의 불필요한 광폭화를 방지하기 위해, 미소투명(큐벳)한 검지기 셀의 부피를 가능하면 소량으로 유지해야 한다. 광산란 및 점도 검지기를 제외하고서는 10 ㎕ 이상이어서는 안 된다. 일반적으로는 미분 굴절계로 검지한다. 그러나 시료나 용리 용액의 특정한 특성치를 필요로 하는 경우에는, UV-VIS나 IR 및 점도 검지기 등과 같은 형태의 검지기를 사용할 수 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 해석

1.1. DIN 규격(주 1)은 데이터의 수집과 처리에 연관되는 요구사항 및 평가기준에 관한 규격이다.

1.2. 각각의 분석 시료에 대해서는, 두 가지의 독립적인 실험을 시행해야 한다. 그리고 개별적으로 해석해야 한다.

1.3. 모든 측정치에 대해 Mn, Mw, Mw/Mn, Mp가 제공되어야 한다. 측정치는 표준물질의 분자량에 해당하는 상대치이기 때문이다.

1.4. 유지부피와 유지시간(내부 표준법으로 보정)을 산정한 후에는, log Mp(여기서 Mp는 검정 표준물질의 피크치)를 그러한 양들의 각각에 대해 플롯한다. 10 개 한 벌의 분자량에 대해 적어도 2 개의 검정 포인트를 필요로 하고, 전체의 검정 곡선을 그리기 위해서는 적어도 5 개의 측정 포인트를 필요로 한다. 그러면 시료의 산정 분자량을 커버할 수 있는 것이다. 검정 곡선의 저분자량 종말점은 n-헥실 벤젠 혹은 적정한 비극성 용질로서 산정한다. 분자수평균 분자량 및 중량평균 분자량은 일반적으로 앞서 제시된 공식에 의한 전산처리로 산정하고 있다. 수작업으로 하는 경우에는, ASTM D 3536-91에 의하는 편이 좋다(주 3).

1.5. 분포 곡선은 표의 형태로 제시하거나 그림의 형태(log M에 대한 빈도 및 누적비율)로 제시해야 한다. 그림으로 나타내는 경우에는, 10 개 한 벌 분자량을 4 ㎝의 폭으로 하고, 피크치의 높이는 8 ㎝로 해야 한다. 적분 분포 곡선의 경우에는, 0~100 %의 가로 좌표의 차이 마디를 10 ㎝로 해야 한다.

2. 시험 보고서

시험 보고서에 포함되어야 할 내용들은 아래와 같다.

2.1. 시험물질

(1) 시험물질 정보(특성, 첨가물, 불순물)

(2) 시료의 처리기법 설명, 관찰사항, 문제점

2.2. 측정사항

(1) 용리물 저장조, 비활성 기체, 용리물의 탈기, 용리액 조성, 불순물

(2) 펌프, 펄스 감쇠기, 주입 시스템

(3) 분리 컬럼(제조자, 공경, 분리재의 성질, 컬럼 수와 길이 및 차원)

(4) 컬럼의 이론단의 수, 분리효율(시스템의 분해능)

(5) 피크치의 대칭성

(6) 컬럼 온도, 온도 제어

(7) 검지기(측정원리, 형태, 큐벳 부피)

(8) 유량계(제조자, 측정원리)

(9) 데이터(하드웨어, 소프트웨어)의 수집 처리 체계

2.3. 시스템의 검정

(1) 검정선을 만드는데 사용된 기법의 상세 설명

(2) 그 기법의 품질 확인 기준(상관계수, 오차 제곱합 등)

(3) 모든 외삽치와 가정치 및 근사치(시험, 평가, 데이터 처리 시)

(4) 검정선 작성 시의 모든 측정치

1) 시료의 명칭

2) 시료의 제조자

3) 제조자가 제공하거나 산정 시에 적용한 표준물질의 Mp, Mn, Mw, Mw/Mn값

4) 주입 부피와 주입 농도

5) 검정 시에 사용한 Mp 값

6) 피크 시의 용리 부피 또는 보정한 유지 시간

7) 피크 시에 산정한 Mp

8) 산정한 Mp 값과 검정값의 퍼센트 에러

2.4. 평가

(1) 시간 기준의 평가 : 필요한 재현성을 보증하는 모든 방법(보정법, 내부 표준법 등)

(2) 용리부피 또는 유지시간의 기준에서 영향 미치는 사항

(3) 피크가 완전히 해석되지 않는 경우의 평가 한계성

(4) 마무리 기법 설명

(5) 시료의 제조 및 전처리 절차

(6) 비용해성 입자의 존재성

(7) 주입 부피(㎕) 및 주입 농도(㎎/㎖)

(8) 이상적인 GPC로부터의 일탈에 영향 미치는 사항

(9) 모든 시험절차의 보정 사항에 대한 상세 설명

(10) 에러 범위에 대한 상세 설명

(11) 결과치의 해석과 연관 있는 여타의 정보 및 관찰 사항

* 주 1 : DIN 55672, (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

* 주 2 : Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds., (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons.

* 주 3 : ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography - GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

* 주 4 : ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

* 주 5 : 폴리머의 분자수평균 분자량 Mn의 측정방법의 실례

겔투과크로마토그래피는 특히 일련의 표준물질 입수가 가능하고 그 표준물질의 물리적 구조가 폴리머의 구조와 공통성이 있는 경우, Mn의 산정에 있어서 선호하는 방법이다. 그러나 실제적으로 GPC의 적용이 어렵거나 그 물질이 Mn의 규제기준을 충족시킬 수 없다고 예상되는 경우에는 다음과 같은 대안적인 방법을 모색해야 한다.

1. 총괄적 특성치의 이용

1.1. 끓는점 상승 측정법/어는점 하강 측정법

폴리머를 추가할 때에 발생되는 용매의 끓는점 상승을 측정하거나 용매의 어는점 하강을 측정하는 기법이다. 그 용액의 끓는점/어는점에 미치는 용해 폴리머의 영향이 그 고분자의 분자량에 따라 달라진다는 논리에 의거하고 있다.

* 적용범위 : Mn < 20,000

1.2. 증기압 강하 측정법

이미 그 양을 알고 있는 폴리머를 추가하는 전후에 그 표준액체의 증기압을 측정하는 기법이다.

* 적용범위 : Mn < 20,000 (이론적인 경우 외에는 한계치가 가짐)

1.3. 멤브레인 삼투압 측정법

삼투압을 측정하는 기법이다. 삼투(압) 현상은 용매 분자가 반투막을 통해 희박용액에서 농축용액으로 이동하여 농도평형을 이루는 자연 현상이다. 시험에서는, 희박용액에서의 폴리머 농도는 0으로 하고, 농축용액은 고분자를 함유하는 것으로 한다. 용매가 막을 통하여 이동하게 되면 양측 용액의 압력차이가 발생되게 된다. 그 압력차이는 폴리머의 농도와 분자량에 따라 달라지는 것이다.

* 적용범위 : Mn=20,000~200,000

1.4. 증기삼투 측정법

순수한 용매 에어로졸이 고분자가 함유된 에어로졸로 증발되어 들어가는 증발 속도를 비교하는 기법이다. 폴리머의 농도도 세 가지로 하고, 폴리머 함유 에어로졸도 세 가지 이상으로 하는 것이다.

* 적용범위 : Mn < 20,000

2. 말단기 분석법

이 기법을 사용하기 위해서는, 폴리머의 총괄적인 물리화학적 구조 및 고분자 연쇄의 말단기의 구조를 알고 있어야 한다. 그 말단기의 구조와 고분자의 주된 연쇄구조를 NMR나 적정법/유도화법에 의해 구분하는 것이다. 고분자에 존재하는 말단기의 분자 농도를 측정하게 되면, 분자량을 산정할 수 있다.

* 적용범위 : Mn ≤ 50,000 (신뢰성은 분자량이 증가할수록 저하)

제 19 항  겔투과크로마토그래피법에 의한 고분자의 저분자량            폴리머 함량 측정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

고분자들의 평균 분자량을 조사하고 그 분자량이 어떻게 분포되어 있는지 알고자 한다면 겔투과크로마토그래피법(gel permeation chromatograp-

hy, GPC)을 사용하여 측정한다. 그러나 고분자의 특성은 매우 다양하므로, 여러 가지 고분자에서 발생되는 분리 및 평가 조건을 모두 아우르는 단일한 방법으로 기술하지는 못한다. 특히 복합적인 고분자 시스템에서는 GPC(겔투과크로마토그래피)를 적용할 수 없는 경우도 더러 발생된다. GPC를 적용할 수 없는 경우에는 시험법 제 18 항의 말미에 수록된 부록에 제시된 방법으로 분자량을 산정해야 한다. 그러한 때에는 그 적용 방법에 관한 사항을 상세하게 제시해야 한다.

한편, 본 시험법 지침에서 기술하는 방법은 독일규격 DIN 55672(주 1)에 기반을 둔 것이다. 시험을 시행하고 그 데이터를 평가하는 방법에 대한 세부사항은 이 규격에서 찾을 수 있다. 시험조건의 변경조정이 필요한 경우에는 합리적으로 적용해야 하며, 이 때 적용하려는 다른 시험법에 대해서 충분히 검토해야 한다. 다음의 방법에서는 이미 알고 있는 고분자 분산성을 가진 폴리스티렌 시료를 검정용으로 이용하고 있으므로, 수용성의 고분자나 장쇄분지형의 고분자와 같은 고분자류에 대해서는 적절하게 조정하여 사용할 수도 있다.

2. 정의

수평균 분자량 Mn 및 중량평균 분자량 Mw는 다음의 식으로 산정한다.

[eqn: M _{n} = {sum _{i=1} ^{n} H _{i}} over {sum _{i=1} ^{n} {H _{i}} over {M _{i}}}]        [eqn: M _{w} =` {sum _{i=1} ^{n} H _{i} TIMES M _{i}} over {sum _{i=1} ^{n} H _{i}}]

여기에서, Hi : 유지(체류량) 부피 Vi의 기준선에서 일탈하는 검지기 지시치

Mi : 유지 부피 Vi에서의 고분자 분율의 분자량

n : 측정 데이터의 숫자

이다. 분자량 분포의 폭은 시스템의 분산성의 척도이고, Mw/Mn의 비율로 제시한다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

GPC는 상대분자량을 측정하는 방법이므로, 검정을 해야 한다. 이를 위해, 좁은 분포성과 직선성을 가지며 평균 분자량이 Mn과 Mw인 폴리스티렌 표준물질과 분자량 분포성이 알려진 물질을 일반적으로 이용하고 있다. 이러한 검정선은 미지 시료의 분자량 측정에만 이용할 수 있다. 다만 시료와 표준물질의 분리 조건이 동일한 경우이어야 한다. 분자량과 용리 부피의 상관관계도 특정한 시험의 특정한 조건에서만 이용해야 한다. 그러한 조건에는 온도, 용매(혼합물), 크로마토그래피 조건, 분리 컬럼, 컬럼 시스템 등이 포함되어야 한다. 이와 같이 측정한 시료의 분자량은 상대적인 값을 가지므로, “폴리스티렌 당량 분자량”이라고 한다. 그 의미를 보자면, 시료와 표준물질 사이의 물리적 및 화학적 차이성에 따라 그 분자량이 절대치로부터 어느 정도 일탈할 수 있는 것이다. 이 외의 다른 표준물질(예로써 폴리 에틸렌글리콜, 폴리 에틸렌옥사이드, 폴리 메틸메타크릴레이트, 폴리 아크릴 산 등)을 사용한다면, 그에 대한 타당성을 기술하고 제시해야 한다.

2. 시험법 원리

시료와 분자량 분포, 평균 분자량(Mn, Mw)은 GPC 방법을 이용하여 산정할 수 있다. GPC는 시료를 개별 성분의 유체역학적 부피에 따라 분리하는 특정한 형태의 액체 크로마토그래피이다. 그 분리작용은 시료가 다공성의 유기성 겔로 충전된 컬럼을 통과함에 의해 발생하게 되는 것이다. 시료 중의 작은 분자는 겔의 공경을 통과하게 되지만, 큰 분자는 배제되게 된다. 큰 분자의 통로는 좁아지고, 먼저 용리되게 된다. 중간 정도 크기의 분자는 공경의 일부분을 통과하게 되어, 점차로 용리되게 된다. 겔의 공경보다 평균 유체역학적 직경이 훨씬 작은 분자는 겔의 공경을 모두 통과하게 된다. 이들은 맨 나중에 용리되게 된다.

이상적인 조건이라면, 그 분리작용은 분자 종의 크기에 의해서만 좌우되지만, 실제적으로는 흡수작용의 간섭을 피하기 어렵다. 불균일한 충전과 사공간도 분리작용을 악화시키게 된다(주 2).

검지작용은 굴절계수나 UV-흡수작용에 영향을 받으므로 단순한 분포 곡선을 만들게 된다. 그러나 실제적인 분자량의 값을 그 곡선에 할당하려면, 기지의 분자량의 고분자를 통과시켜가면서 컬럼의 눈금을 매긴다. 이상적으로는, 동일한 물리적 구조를 가진 표준물질로 해야 한다. 전형적인 가우시안 곡선이 만들어지지만 그 후미 부분이 저분자량의 방향, 용리되는 다양한 분자종을 나타내는 수직축의 방향, 분자량의 대수치를 나타내는 수평축의 방향으로 일그러지게 된다. 이러한 곡선으로부터 저분자량의 함량을 도출하는 것이다. 저분자량 화학종이 전반적으로 그 고분자와 질량기준에서 당량적으로 일치하는 경우에만 그 산정치가 정확하게 된다고 할 수 있다.

3. 품질 기준

용리 부피의 재현성(상대표준편차=RSD)은 0.3 % 이상이어야 한다. 그 크로마토그램이 시간-의존적이고 0.3 % 이상의 기준에 일치하지 않는다면, 분석에서 요구되는 재현성은 내부 표준법으로 보정해야 한다(주 1). 고분자 분산성은 표준물질의 분자량에 의존적이다. 전형적인 폴리스티렌 표준물질의 경우는 다음과 같다.

Mp < 2,000      Mw/Mn < 1.20

2,000 ≤ Mp ≤ 106       Mw/Mn < 1.05

Mp > 106        Mw/Mn < 1.20

(Mp는 피크 시에서의 표준물질의 분자량이다)

4. 시험 수순

4.1. 폴리스티렌 표준용액의 조제

4.1.1. 폴리스티렌 표준물질을 선정한 용리액에 조심스레 혼합하며 용해시킨다. 용액의 조제 시에는 그 제조업체의 권장사항을 준수해야 한다.

4.1.2. 선정한 표준물질의 농도는 주입 부피, 용액의 점도 및 검지기의 감도 등과 같은 여러 인자의 영향을 받는다. 최대 주입 부피는 컬럼의 길이에 적합해야 하지만, 컬럼의 용량이 초과되지 않도록 유의해야 한다. 30 ㎝×7.8 ㎜의 컬럼을 가진 GPC 분리분석장치에 대한 전형적인 주입 부피는 통상적으로 40~100 ㎕이다. 그 이상의 부피로도 시험은 가능하만, 250 ㎕를 초과해서는 아니 된다. 주입 부피와 농도의 최적 비율은 컬럼의 눈금 매김 이전에 산정해야 한다.

4.2. 시료용액의 조제

시료 용액의 조제 시에도 동일한 요구사항을 적용해야 한다. 시료를 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran ,THF)과 같은 적절한 용매에 조심스레 교반하며 용해시킨다. 어떤 조건에서도 초음파 수조에서 용해시켜서는 아니 된다. 필요하다면 시료용액을 0.2~2 ㎛ 공경의 멤브레인 필터로 여과시켜야 한다. 비용해성 입자의 존재는 보다 큰 고분자 화학종에 기인하므로 최종 보고서에 반드시 기재해야 한다. 적정한 기법을 이용하여 비용해성 입자의 무게를 퍼센트로 표시해야 한다. 조제 용액은 24 시간 이내에 사용해야 한다.

4.3. 불순물 및 첨가물 함량에 대한 보정

비고분자성 특정성분(불순물, 첨가물 등)의 존재와 영향에 대한 M < 1,000의 화학종 함량에 대한 보정은 통상적으로 시행해야 한다. 그 함량치가 항상 1 % 이하인 경우가 아니라면 보정해 주어야 한다. 이는 고분자 용액이나 GPC 용리물을 직접 분석하여 시행하는 것이다. 용리물이 컬럼을 통과한 후에 분석했을 때에도 지나치게 희박한 경우에는 더 농축시켜야 한다. 용리물을 증발시켜 건조시킨 후에 다시 용해시키는 방법을 사용해도 좋다. 용리물의 조성에서 전혀 변화가 발생되지 않는 조건에서도 용리물의 농도는 영향을 받게 된다. GPC 단계 이후의 용리물 처리는 정량적 측정에서 사용하는 분석방법에 따라 달라져야 하는 것이다.

4.4. 장치

GPC 장치는 다음과 같은 요소로 구성된다.

(1) 용매 저장조

(2) 가스배출기(적정한 위치)

(3) 펌프

(4) 펄스 감쇠기(적정한 위치)

(5) 주입 시스템

(6) 크로마토그래피 컬럼

(7) 검지기

(8) 유량계(적정한 위치)

(9) 데이터 기재 및 처리 시스템

(10) 폐기물 저장조

* GPC 시스템에 사용되는 용매는 시스템과 비활성관계이어야 한다(예. THF 용매와 스틸 모세관).

4.5. 주입 및 용매전달 시스템

일정 부피의 시료용액을 자동 샘플러나 수동으로 컬럼에 조심스레 채운다. 시린지(syringe)의 플런저(plunger)를 너무 빨리 당기거나 누르게 되면, 분자량 분포에 이상을 초래할 수도 있다. 가능하면 용매전달 시스템에는 펄스가 없어야 하므로, 펄스 감쇠기를 부착하는 편이 최선이다. 유량은 1 ㎖/min 정도이어야 한다.

4.6. 컬럼

시료에 따라, 1 개 컬럼이나 여러 개를 연결한 컬럼을 사용하여 고분자를 특성화할 수 있다. 지정된 공경이나 배제한계 등의 특성치를 가진 다공성의 컬럼 충전물질은 일반적인 것을 사용해도 무방하다. 분리 겔이나 컬럼 길이는 시료의 특성(유체역학적 부피, 분자량 분포 등) 및 분리 조건(용매, 온도, 유량(주 1, 2, 3))에 따라 달리 선정해야 한다.

4.7. 이론단(Theoretical plates)

분리용의 컬럼은 이론단의 숫자로 특성화하고 있다. 용리 용매가 THF인 경우에는 이미 제시되어 있는 길이의 컬럼에 에틸벤젠의 용액이나 여타 비극성 용질의 용액으로 충전할 수 있다. 이론단의 수는 다음의 식으로 산정한다.

[eqn: N``=`5.54( {V _{e}} over {W _{1/2}} ) ^{2} ````````혹은```````N`=`16( {V _{e}} over {W} ) ^{2} ``]

N : 이론단의 수

Ve : 피크 시의 용리 부피

W : 피크 시의 기준 폭

W1/2 : 중간 높이에서의 피크 폭

4.8. 분리 효율

이론단의 수는 컬럼의 밴드 폭을 결정하는 양이므로, 검정선의 예리함에 의해 산정되는 분리 효율도 고려해야 한다. 컬럼의 분리 효율은 다음의 식으로 구한다.

[eqn: {V _{e,`Mx} ```````-```````V _{e,(10.`Mx)}} over {컬럼의`cross``section`구역} GEQ 6.0[ {㎤} over {㎠} ]]

여기에서,  Ve,Mx : 분자량 Mx의 폴리스티렌에 대한 용리 부피

Ve,(10.Mx) : 분자량이 10 배 이상 큰 폴리스티렌에 대한 용리 부피

이다. 한편, 시스템의 분해능은 다음 식으로 산정한다.

[eqn: R _{1,2} ``=``2 TIMES {V _{e1} ``-`V _{e2}} over {W _{1} ``+``W _{2}} ` TIMES ` {1} over {log _{10} ( {M _{2}} over {M _{1}} )}]

여기에서, Ve1, Ve2 : 피크 시의 2 개 폴리스티렌 표준물질의 용리부피

W1, W2 : 기준선에서의 피크 폭

M1, M2 : 피크 시의 분자량(10 배 이상으로 달라야 한다)

이다. 이 때, 컬럼 시스템의 R 값은 1.7 이상이어야 한다(주 4).

4.9. 용매

모든 용매는 고순도(THF는 99.5 % 사용)여야 한다. 용매조는 대기와 비활성적이어야 하고, 컬럼의 검정과 몇 가지 시료 분석에 충분한 용량이어야 한다. 용매는 펌프로 컬럼에 이송되기 이전에 탈기해야 한다.

4.10. 온도 제어

중요한 내부 요소(주입 루프, 컬럼, 검지기, 튜브 등)의 온도는 일정하고 용매의 특성과 부합되는 것이어야 한다.

4.11. 검지기

검지기의 목적은 컬럼으로부터 용리되는 시료의 농도를 정량적으로 기록하는 것이다. 피크치의 불필요한 광폭화를 방지하기 위해, 미소투명(큐벳)한 검지기 셀의 부피를 가능하면 소량으로 유지해야 한다. 광산란 및 점도 검지기를 제외하고서는 10 ㎕ 이상이어서는 아니 된다. 일반적으로는 미분 굴절계로 검지한다. 그러나 시료나 용리 용액의 특정한 특성치를 필요로 하는 경우에는, UV-VIS나 IR 및 점도 검지기 등과 같은 형태의 검지기를 사용할 수 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 해석

1.1. DIN 규격(주 1)은 데이터의 수집과 처리에 연관되는 요구사항 및 평가기준에 관한 규격이다.

1.2. 각각의 분석 시료에 대해서는, 두 가지의 독립적인 실험을 시행해야 한다. 그리고 개별적으로 해석해야 한다.

1.3. 모든 측정치에 대해 Mn, Mw, Mw/Mn, Mp가 제공되어야 한다. 측정치는 표준물질의 분자량에 상당하는 상대치이기 때문이다.

1.4. 측정치는 표준물질의 분자량에 상당하는 상대적인 수치라는 사실을 분명하게 유념해 둔다.

1.5. 모든 경우에 대하여 시료와 동일한 조건에서 처리한 공시험 데이터를 산정해 둘 필요가 있다.

1.6. 유지부피와 유지시간(내부 표준법으로 보정)을 산정한 후에는, log Mp(여기서 Mp는 검정 표준물질의 피크치)를 그러한 양들의 각각에 대해 플롯하는 것이다. 10 개 한 벌의 분자량에 대해 적어도 2 개의 검정 포인트를 필요로 하고, 전체의 검정 곡선을 그리기 위해서는 적어도 5 개의 측정 포인트를 필요로 한다. 그러면 시료의 산정 분자량을 커버할 수 있는 것이다. 검정 곡선의 저분자량 종말점은 n-헥실 벤젠 혹은 적정한 비극성 용질로서 산정한다. 분자량 1,000 이하에 상당하는 곡선 부분을 산정하여 불순물과 첨가물에 대해 필요한 보정을 해두어야 한다. 용리 곡선은 일반적으로 전자정보처리에 의해 평가하고 있다. 수작업으로 하는 경우에는, ASTM D 3536-91에 의하는 편이 좋다(주 3).

1.7. 컬럼에 비용해성 고분자가 존재하는 경우, 그 분자량은 용해 부분의 분자량보다 높다. 그러므로 이를 고려하지 않는 것은 저분자량 폴리머의 함량을 과대평가하는 결과를 초래하게 된다. 비용해성 고분자에 대한 저분자량 폴리머의 함량을 보정하는 지침은 부록에 수록되어 있으니 참고한다.

1.8. 분포 곡선은 표의 형태로 제시하거나 그림의 형태(log M에 대한 빈도 및 누적비율)로 제시해야 한다. 그림으로 나타내는 경우에는, 10 개 한 벌 분자량을 4 ㎝의 폭으로 하고, 피크치의 높이는 8 ㎝로 해야 한다. 적분 분포 곡선의 경우에는, 0~100 %의 가로 좌표의 차이 마디를 10 ㎝로 해야 한다.

2. 시험 보고서

시험 보고서에 포함되어야 할 내용들은 아래와 같다.

2.1. 시험물질

(1) 시험물질 정보(특성, 첨가물, 불순물)

(2) 시료의 처리기법 설명, 관찰사항, 문제점

2.2. 측정사항

(1) 용리물 저장조, 비활성 기체, 용리물의 탈기, 용리액 조성, 불순물

(2) 펌프, 펄스 감쇠기, 주입 시스템

(3) 분리 컬럼(제조자, 공경, 분리재의 성질, 컬럼 수와 길이 및 차원)

(4) 컬럼의 이론단의 수, 분리효율(시스템의 분해능)

(5) 피크치의 대칭성

(6) 컬럼 온도, 온도 제어

(7) 검지기(측정원리, 형태, 큐벳 부피)

(8) 유량계(제조자, 측정원리)

(9) 데이터(하드웨어, 소프트웨어)의 수집 처리 체계

2.3. 시스템의 검정

(1) 검정선을 만드는데 사용된 기법에 대한 구체적 설명

(2) 그 기법의 품질 기준(상관계수, 오차 제곱합 등)

(3) 모든 외삽치와 가정치 및 근사치(시험, 평가, 데이터 처리 시)

(4) 검정선 작성 시의 모든 측정치

1) 시료의 명칭

2) 시료의 제조자

3) 제조자가 제공하거나 산정 시에 적용한 표준물질의 Mp, Mn, Mw, Mw/Mn값

4) 주입 부피와 주입 농도

5) 검정 시에 사용한 Mp 값

6) 피크 시의 용리 부피 혹은 보정한 유지 시간

7) 피크 시에 산정한 Mp 값

8) 산정한 Mp 값과 검정값의 퍼센트 에러

2.4. 저분자량 폴리머 함량 정보

(1) 분석에서 이용한 방법 및 실험에서 사용한 경로

(2) 전체 시료와 연관되는 저분자량 화학종 함량의 퍼센트(w/w)

(3) 전체 시료와 연관되는 불순물과 첨가물 및 비폴리머 화학종의 무게 퍼센트

2.5. 평가

(1) 시간 기준의 평가 : 필요한 재현성을 보증하는 모든 방법(보정법, 내부 표준법 등)

(2) 용리 부피이나 유지시간의 기준에서 영향을 미치는 사항

(3) 피크가 완전히 해석되지 않는 경우의 평가 한계성

(4) 마무리 기법 설명

(5) 시료의 제조 및 전처리 절차

(6) 비용해성 입자의 존재성

(7) 주입 부피(㎕) 및 주입 농도(㎎/㎖)

(8) 이상적인 GPC로부터의 일탈에 영향을 미치는 사항

(9) 모든 시험절차의 보정 사항에 대한 구체적 설명

(10) 에러 범위에 대한 구체적 설명

(11) 결과치의 해석과 연관 있는 여타의 정보 및 관찰 사항

* 주 1 : DIN 55672, (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

* 주 2 : Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds., (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons.

* 주 3 : ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography - GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

* 주 4 : ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

* 주 5 : 비용해성 폴리머의 존재로 인한 저분자량 폴리머 함량의 보정 지침

비용해성 폴리머가 시료 내에 존재하는 경우에는, GPC 분석 중에 질량 손실이 발생하게 된다. 시료의 용해성 부분이 컬럼을 통과하는 동안에, 비용해성 폴리머가 비가역적으로 컬럼이나 시료 필터에 잔류되는 것이다. 폴리머의 굴절계수 증가치(dn/dc)를 측정하거나 산정하는 경우, 컬럼 상에서 손실되는 시료의 질량을 산정할 수 있다. 이 때의 보정에서는, 기지 농도의 표준물질과 dn/dc로서 시험 외적으로 검정하여 굴절계의 감응치를 산정하는 것이다. 여기서의 예제에서는 폴리 메틸메타크릴레이트, 즉 pMMA을 표준물질로 이용한다.

아크릴 폴리머의 분석을 위한 외부 검정에 있어서는, 테트라하이드로퓨란 내의 기지 농도의 pMMA 표준물질은 GPC로써 분석하고, 그 결과치를 사용하고  다음 식을 적용하여 굴절계의 정수를 찾아낼 수 있다.

[eqn: K`=` {R} over {C TIMES V TIMES {dn} over {dn}}]

여기에서, K : 굴절계 정수(㎷·sec/㎖의 단위)

R : pMMA 표준물질의 응답치(㎷·sec의 단위)

C : pMMA 표준물질의 농도(㎎/㎖의 단위)

V : 주입 부피(㎖의 단위)

dn/dc : 테트라하이드로퓨란 내의 pMMA의 존재로 인한 굴절계수 증가분(㎖/㎎의 단위)

이며, 전형적인 pMMA 표준물질의 데이터는 아래와 같다.

R=2,937,891

C=1.07 ㎎/㎖

V=0.1 ㎖

dn/dc=9.10-5 ㎖/㎎

결과치로서의 K값, 3.05×1011을 사용하여, 검지기 통과 시 주입 폴리머의 100 %가 용리되는 경우의 이론적인 검지기 응답치를 산정하는 것이다.

제 20 항  수중 폴리머의 용해/추출 거동의 산정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법의 목적은 20 ℃에서 pH 2, pH 9, 37℃에서 pH 7인 조건 하의 수중 폴리머가 용해/추출되는 거동을 측정하는 것에 있다. 액상에 존재하는 전체 폴리머 종을 측정하려면 총유기탄소(Total organic carbon content, TOC)를 분석하는 것이 바람직하다. 본 시험법 지침에서는 총유기탄소를 분석하는 방법 외의 다른 방법에 대해서도 논의하고자 한다.

2. 시험의 제한사항

2.1. 에멀션 폴리머와 같은 고분자에 대해서는, 본 시험법 지침에서 제시한 방법을 사용하기 이전에 전처리 작업을 실시할 필요가 있다. 이 방법은 액체 고분자나 시험조건 하에서 물과 반응하는 고분자에 대해 적용해서는 안 된다.

2.2. 이 방법을 사용할 수 없거나 불가능한 경우에는, 여타의 방법을 이용하여 용해/추출의 거동을 조사하여야 한다. 그러한 경우에는, 사용한 방법에 대해 충분하게 기술하고 그 타당성도 제시하여야 한다.

Ⅱ. 시험

1. 시험법 원리

수용성 매개체 내에서의 폴리머의 용해/추출 거동을 측정하는 데에는 다음에 설명할 수정된 플라스크 방법(시험법 제 5 항 참조)을 이용한다.

2. 시험방법

2.1. 장치

시험을 수행하기 위한 장치는 다음과 같이 구성된다.

(1) 알려진 입자크기를 만들 수 있는 그라인더와 같은 분쇄장치(주 1)

(2) 온도제어가 가능한 교반장치

(3) 멤브레인 필터 시스템

(4) 분석장치

(5) 표준 체(sieves)

2.2. 조제

2.2.1. 대표적인 시료 하나를 먼저 적절한 체를 이용하여 0.125~0.25 ㎜의 입자 크기로 걸러 낸다. 시료의 안정성을 유지하기 위해서 또는 분쇄하기 위해 냉각할 수 있다. 고무 성질의 물질은 액체질소온도(주 1)에서 분쇄할 수도 있다.

2.2.2. 필요한 크기의 입자가 얻어지지 않으면, 입자의 크기를 가능한 한 작게 만드는 작업을 시행해야 하고, 그러한 작업의 결과치를 기재해야 한다. 또한 시험하기 이전에 그 분쇄 시료를 저장하는 기법도 제시해야 할 필요가 있다.

3. 시험수행

3.1. 시험물질 10 g을 칭량하여 시료 3 개를 만들고, 3 개의 시험 용기에 넣는다. 시험용기는 유리 마개가 있는 것이어야 한다. 각 시험용기에 물을 1,000 ㎖ 채운다. 10 g의 폴리머를 취급하기가 불가능한 경우에는 그 이하의, 취급할 수 있는 최대량으로 하여 그에 알맞은 부피의 물로 채운다. 시험용기의 마개는 단단히 닫고, 20 ℃에서 교반시킨다. 이 때, 교반장치는 일정한 온도에서 작동하는 것을 사용해야 한다. 24 시간 후에는, 각 시험용기의 내용물을 원심분리하거나 여과하고, 깨끗한 수용상 내의 폴리머 농도를 적절한 분석법을 이용하여 측정한다. 수용상에 대해 적절한 분석방법을 사용할 수 없는 경우에는, 필터 여과물이나 원심분리 침전물의 건조중량으로부터 전체적인 용해성/추출성을 산정할 수도 있다.

3.2. 한편으로는 불순물과 첨가물을 정량적으로 분류하고, 다른 한편으로는 저분자량 화학종을 정량적으로 분류할 필요가 있다. 중량 측정의 경우에는, 공시험의 수행도 중요한 역할을 한다. 공시험은 시험물질을 넣지 않고 수행하는 시험으로서 시험 중에 발생하는 잔류물을 규명하는 역할을 하는 것이다.

3.3. 위의 3.1.항에서 기술한 20 ℃의 시험방법과 같은 방법으로 20 ℃의 pH 2 및 pH 9에서 그리고 37 ℃의 pH 7에서 수중의 폴리머의 용해/추출 거동을 측정하기도 한다. pH값은 적절한 완충액이나 산 및 염기를 가하여 조정한다. 이를 위해 염산, 아세트산, 분석시약급의 NaOH와 KOH, NH3 등을 이용한다.

3.4. 분석방법에 따라서는 1~2 회의 시험을 시행해야 한다. 폴리머 성분을 수용상에서 직접 분석할 수 있는 방법을 이용할 수 있는 경우에는, 위와 같은 시험을 일 회만 수행해도 충분하다. 그러나 그런 방법을 이용할 수 없어서 폴리머의 용해/추출 거동의 측정이 수용상 추출물의 총유기탄소(TOC) 분석에 의한 간접 분석법으로 제한되는 경우에는, 추가적인 시험을 수행해야 한다. 이와 같은 추가 시험은 처음 시험에서 사용한 것과 같은 물의 양 및 10 배로 작은 미분 폴리머 시료를 사용하여 3 번 수행해야 한다.

4. 분석

4.1. 하나의 시료 크기로 행하는 시험

4.1.1. 수용상 내의 폴리머 성분을 직접 분석할 수 있는 방법이다. 이의 대안은 용해된/추출된 폴리머 성분의 간접 분석법으로 용해성 부분의 총 함량을 측정하여 비폴리머 성분에 대해 보정하는 것이다.

4.1.2. 전체 폴리머 화학종의 수용상 분석은 감도가 충분한 방법이나 진공 증발법에 의해 가능하다. 이와 같이 감도가 충분한 방법으로서는 IR, 화학적 분석, 원자흡광분석(AAS), 실리콘·금속함유 폴리머용의 유도결합플라스마(ICP) 분석, 아릴 폴리머용의 UV 흡수·형광분석, 저분자량 시료용의 LC-MS 등이다. 그 진공 증발법으로는 수용성 추출물을 건조시켜 그 잔류물을 분광분석(IR, UV 등) 혹은 AAS/ICP 분석하는 것이다.

4.1.3. 수용상의 분석이 불가능한 경우에는, 수용상의 추출물을 물과 혼합되지 않는 유기용매(염화 탄화수소류 등)로써 추출한다. 그때 용매는 증발시키고, 그 잔류물을 폴리머의 함량에 적합한 IR, UV, AAS/ICP로 분석한다. 불순물이나 첨가물로서 확인되는 잔류물의 성분은 폴리머 자체의 용해/추출의 정도를 측정하는 목적에 비추어 무시한다. 그러한 잔류물 성분이 비교적 다량인 경우에는, 그 잔류물을 HPLC나 GC로 분석하고, 불순물인가 단량체 혹은 단량 유도체 화학종인가를 구분하여, 단량체나 단량 유도체 화학종의 함량을 산정해야 한다. 이러한 경우에도 유기용매의 단순한 증발 건조나 건조 잔류물의 칭량만으로도 충분하다.

4.2. 2가지의 시료 크기로 행하는 시험

4.2.1. 모든 수용성 추출물에 대해서는 TOC를 분석한다.

4.2.2. 중량 분석은 시료의 비용해성/비추출성 부분에 대해 시행한다. 만약, 각 시료용기의 내용물을 원심분리하거나 여과한 후에도 폴리머 잔류물이 시료용기 벽면에 부착되어 있다면 그 시료용기가 육안으로 깨끗해 보일 때까지 여과물로 헹구어야 한다. 그 다음, 여과물을 다시 원심분리하거나 여과한다. 필터 위에나 원심분리기 튜브 내에 남아있는 잔류물은 40 ℃의 진공상태에서 건조시켜 칭량하는데, 일정한 중량에 이를 때까지 건조시켜야 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 하나의 시료 크기로 행하는 시험

3 개의 플라스크에 대한 각각의 결과치와 그 평균치를 제시하고, 용액의 부피당 질량의 단위(㎎/ℓ 등) 혹은 폴리머 시료의 질량당 질량의 단위(㎎/g 등)로 나타낸다. 또한, 용질의 무게를 초기 시료의 무게로 나누어 계산된 시료의 무게 손실치도 제시한다. 상대표준편차(RSD)도 산정해야 한다. 각각의 수치들을 전체 물질(폴리머+필수 첨가제 등)에 대해 제시하고, 폴리머에 대해서도 제시해야 한다.

2. 2가지 시료 크기로 행하는 시험

2.1. 한 실험 당 세 번씩 측정한 두 가지 시료로 수행한 시험에서 얻은 수용성 추출물의 각 TOC 값과 각 실험마다의 평균치는 용액의 부피 당 질량의 단위(㎎C/ℓ) 혹은 초기 시료의 무게 당 질량의 단위(㎎C/g)로 나타내야 한다.

2.2. 다량 및 소량 시료/물의 비율이 차이성을 보여주지 아니하는 경우는 모든 추출가능한 성분이 추출되었음을 의미한다. 이러한 경우에는 통상적으로 직접 분석법을 필요로 하지 않는다.

2.3. 잔류물의 각 중량을 제시하여야 하고, 시료의 초기 무게에 대한 퍼센트로 나타내어야 한다. 시험마다의 평균치도 산정해야 한다. 100 %와 각 퍼센트의 차이성은 원래 시료의 용해성 및 추출성 물질의 퍼센트를 나타내는 것이다.

3. 시험 보고

시험 보고서에는 다음 사항이 기재되어야 한다.

(1) 시험물질 : 시험물질에 관한 정보(성상, 첨가물, 불순물, 저분자량 화학종 등)

(2) 시험조건

1) 시험절차와 시험조건 설명

2) 분석 및 검지방법 설명

(3) 결과치

1) 용해성/추출성(㎎/ℓ), 각 용액의 추출시험에 대한 각각의 결과치와 평균치, 폴리머와 불순물 및 첨가물로 세분하여 제시

2) 폴리머의 용해성/추출성의 결과치(㎎/g)

3) 수용성 추출물의 TOC값, 용질의 무게와 퍼센트 산정치

4) 각 시료의 pH

5) 공시험 값에 대한 정보

6) 시험과정과 분석과정 중의 시험물질이 가지는 화학적 불안정성 자료

7) 결과치의 해석에서 중요한 정보 사항

* 주 1 : DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

제 21 항  HPLC법에 의한 토양 및 하수오니의 흡착계수 산            정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

본 시험법은 HPLC를 이용하여 토양과 하수오니의 흡착계수 Koc를 산정하는 것을 목적으로 하고 있다(주 1). 이와 같은 산정치는 QSAR에 의한 경우보다도 신뢰도가 훨씬 높은 편이다(주 2). 그러나 어떠한 산정기법으로서도, OECD 시험지침 106에서 사용하는 회분평형시험 기법을 완전히 대체하지는 못한다. 또한 Koc 산정치를 이용하여, 시험지침 106에 따라 흡착/탈착 연구에 대한 적절한 시험 파라미터도 선정할 수 있다. 이런 경우, Kd(분배계수)와 Kf(Freundlich 흡착계수)를 계산하여 이용해야 한다.

토양 혹은 하수오니(슬러지)에서 화학물질의 수착 거동은 OECD 시험지침 106으로 실험적으로 산정하는 파라미터로서 기술할 수 있다. 그 중의 가장 중요한 파라미터는 흡착계수이다. 흡착계수를 정의하자면, 흡착평형에서 토양/오니 내에서의 화학물질의 농도와 수용상에서의 화학물질의 농도 사이의 비율이다. 토양의 유기탄소 함량을 기준으로 하는 흡착계수 Koc는 토양과 하수오니의 유기물질에 의한 화학물질의 결합 용량을 특정하는 유용한 지표이므로, 다양한 화학물질들을 비교하는 데도 유용하게 이용할 수 있다. 이 파라미터는 물의 용해도와 옥탄올/물 분배계수를 상관지어 산정할 수 있다(주 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9).

2. 시험의 제한사항

2.1. 본 HPLC법은 표지가 있는 화학물질이나 없는 화학물질 모두에 적용할 수 있지만, 적절한 검지 시스템(분광분석기, 방사능검출기 등)을 이용할 수 있어야 하고, 시험 중에는 충분한 안정성을 유지할 수 있어야 한다. 또한 HPLC법은 일반적인 시험 시스템에서 수행하기 어려운 화학물질(휘발성 화학물질, 분석 수준의 농도에서 물에 용해되지 아니하는 화학물질, 배양 시스템의 표면에 친화성이 아주 큰 화학물질 등)에 대해 특히 유용하다. 더욱이 HPLC법은 비용해성 용리대를 형성하는 혼합물에도 사용할 수 있다. 이와 같은 경우에는, 그러한 화학물질에 대한 log Koc값의 상한치와 하한치를 제시해야 한다.

2.2. 본 HPLC법은 용리액이나 고정상에 반응하는 화학물질에 대해서는 적용할 수 없다. 또한 무기질 성분과 특정적으로 상호작용(진흙 무기질 성분과의 집속 착물체 형성 등) 하는 화학물질에 대해서도 적용할 수 없다. 이 방법은 표면활성물질, 무기성 화합물, 강 유기산 및 염기, 중간 유기산 및 염기에 대해서도 적용할 수 없다. log Koc 값의 산정치는 1.5~5.0의 범위이다. 이온성 화학물질은 완충액으로 처리한 이동상을 이용하여 측정하지만, 완충 성분과 시험물질이 침전하지 않도록 특히 유의해야 한다.

2.3. 유념해야 할 것은 불순물이 HPLC 결과치의 해석에 문제점을 초래하기도 한다는 점이다. 그러나 시험물질의 성상이 분명하고, 불순물을 분리해 낼 수 있는 경우에는 그러하지 아니하다.

2.4. 본 HPLC법은 부록의 표 1에서 제시하는 화학물질에 대해서 실증되어 있으며, 아래에 나열하는 화학물질 류에 대해서도 적용할 수 있다.

- 방향족 아민류(aromatic amines) : 트리플루라린(trifluralin), 4-클로로아닐린(4-chloroaniline), 3,5-디니트로아닐린(3,5-dinitroaniline), 4-메틸아닐린(4-methylaniline), N-메틸아닐린(N-methylaniline), 1-나프틸아민(1-naphthylamine)

- 아로마틱 카보닉 액시드 에스테르(aromatic carbonic acid esters) : 벤조산 메틸에스테르(benzoic acid methylester), 3,5-디니트로벤조산 에틸에스테르(3,5-dinitrobenzoic acid ethylester)

- 아로마틱 하이드로카본(aromatic hydrocarbons) : 톨루엔(toluene), 크실렌(xylene), 에틸벤젠(ethylbenzene), 니트로벤젠(nitrobenzene), 1,2,3-트리클로로벤젠(1,2,3-trichlorobenzene)

- 아릴옥시페녹시프로피오닉 액시드 에스테르(aryloxyphenoxypropio-

nic acid esters) : 디클로폽-메틸(diclofop-methyl), 페녹사프롭-에틸(fenoxaprop-ethyl), 페녹사프롭-P-에틸(fenoxaprop-P-ethyl)

- 벤지미다졸 및 이미다졸 살균제류(benzimidazole and imidazole fungicides) : 카르벤다짐(carbendazim), 퓨베리다졸(fuberidazole), 트리아조사이드(triazoxide)

- 카보닉 액시드 아마이드(carbonic acid amides) : 2-클로로벤즈아마이드(2-chlorobenzamide), N,N-디메틸벤즈아마이드(N,N-dimethylb-

enzamide), 3,5-디니트로벤즈아마이드 N-메틸벤즈아마이드(3,5-dinitrobenzamide N-methylbenzamide), 2-니트로벤즈아마이드(2-nitrobenzamide), 3-니트로벤즈아마이드(3-nitrobenzamide)

- 클로리네이티드 하이드로카본류(chlorinated hydrocarbons) : 엔도설판(endosulfan), DDT, 헥사클로로벤젠(hexachlorobenzene), 퀸도젠(quintozene)

- 유기인 살충제류(organophosphorus insecticides) : 아진포스-메틸(azinphos-methyl), 디술포톤(disulfoton), 페나미포스(fenamiphos), 이소펜포스(isofenphos), 피라조포스(pyrazophos), 설프로포스(sulprofos), 트리아조포스(triazophos)

- 페놀류(phenols) : 페놀(phenol), 2-니트로페놀(2-nitrophenol), 4-니트로페놀(4-nitrophenol), 펜타클로로페놀(pentachlorophenol), 2,4,6-트리클로로페놀(2,4,6-trichlorophenol), 1-나프톨(1-naphtol)

- 페닐유레아 유도체류(phenylurea derivatives) : 이소프로튜론(isoproturon), 모노리뉴론(monolinuron), 펜시큐론(pencycuron)

- 안료 및 염료(pigment dyestuffs) : 액시드 옐로 219(Acid Yellow 219), 베이직 블루 41(Basic Blue 41), 다이렉트 레드 81(Direct Red 81)

- 폴리아로마틱 하이드로카본류(polyaromatic hydrocarbons) : 아세나프텐(acenaphtene), 나프탈렌(naphthalene)

- 1,3,5-트리아자인 제초제류(1,3,5-triazine herbicides) : 프로메트린(prometryn), 프로파진(propazine), 시마진(simazine), 터뷰트린(terbutryn)

- 트리아졸 유도체류(triazole derivatives) : 테뷰코나졸(tebuconazole), 트리아디메폰(triadimefon), 트로디메놀(tradimenol), 트리아펜테놀(triapenthenol)

3. 정의

3.1. Kd

분포계수 또는 분배계수로서, 수착제(토양 또는 하수오니)의 수착상과 수용상의 두 가지 상으로 구성되는 시스템에서 용해된 시험물질의 평형농도 C의 비율이다. 이는 두 가지 상의 농도를 중량/중량의 기준으로 나타내는 무차원의 값이다. 수용상의 농도가 중량/부피의 기준으로 주어지는 경우에 이 계수의 차원은 ㎎/ℓ이 된다. Kd는 수착제의 특성에 따라 달라지고, 그 농도에 따라서도 달라진다.

[eqn: K _{d} ``=` {C _{soil}} over {C _{water}} ````````혹은````K _{d} ```=`` {C _{sludge}} over {C _{water}} `]  (1)

여기에서, Csoil : 평형상태에서 토양에서의 시험물질의 농도(㎍/g)

Csludge : 평형상태에서 오니에서의 시험물질의 농도(㎍/g)

Cwater : 평형상태에서 물에서의 시험물질의 농도(㎍/g, ㎍/㎖)

이다.

3.2. Kf

Freundlich 흡착계수로서, 수용상에서의 평형농도 Cwater가 1인 경우의 토양 또는 하수오니에서의 시험물질의 농도(x/m)이다. 이 흡착계수의 차원은 µg/g의 단위이다. 이 계수의 값은 수착제의 특성에 따라 달라진다.

[eqn: log {x} over {m} ``=``log`K _{f} ```+`` {1} over {n} ` TIMES `log`C _{water}] (2)

여기에서, x/m : 평형상태에서 수착제의 양 m(g)에 흡착되는 시험물질의 양(㎍)

1/n : 등온 수착(흡착·흡수) 직선의 기울기

Cwater : 평형상태에서 수용상에서의 시험물질의 농도(㎍/㎖)

이다. 한편, Cwater=1인 경우

[eqn: log`K _{f} ``=``log` {x} over {m}]

이다.

3.3. Koc

분배계수(Kd) 혹은 Freundlich 흡착계수(Kf)를 수착제의 유기탄소 함량(foc) 기준으로 조정한 계수이다. 특히 비이온화 화학물질에 대한 것으로, 시험물질과 수착제 사이의 흡착작용에 대한 지표이고, 다양한 화학물질 사이에서는 비교·이용할 수도 있다. 계수 Kd와 Kf의 차원에 따라 Koc의 단위는 무차원일 수도 있고, 유기물질 무게 당 ㎖/g 혹은 ㎍/g의 단위일 수도 있다.

[eqn: K _{oc} ``=` {K _{d}} over {f _{oc}} (무차원```혹은```㎖/g)`,`````````K _{oc} `=` {K _{f}} over {f _{oc}} (㎍/g)`] (3)

Koc와 Kd 사이의 상관관계는 항상 직선적이지는 않으므로, Koc값은 토양에 따라 달라지지만, 그 변이성은 Kd값이나  Kf값에 비해 매우 작은 편이다.

3.4. 흡착계수(Koc)는 용량인자(k')를 이용하여 표준물질의 log Koc에 대해 log k'를 도시하여 유도한다.

[eqn: k'``=`` {t _{R} `-`t _{O}} over {t _{O}}] [4]

여기에서, tR : 시험물질과 표준물질의 HPLC 잔류시간(분)

t0 : HPLC의 데드타임(분)

3.5. Pow

옥탄올-물 분배계수로서 옥탄올 및 물에서의 용해 물질의 농도비이다. 이 계수는 무차원의 값으로서 다음 식으로 나타낸다.

[eqn: P _{ow} ``=` {C _{octanol}} over {C _{water}} (=`K _{ow} )]

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

시험물질에 대한 HPLC 잔류시간 측정 데이터와 흡착계수 Koc의 상관관계를 구하려면, log k'에 대한 log Koc의 그래프를 작성하여야 한다. 최소한 6 개의 기준점을 사용하되, 그 중의 두 개는 시험물질의 기대치의 아래와 위에 위치하여야 한다. 표준물질과 시험물질이 구조적으로 연관되어질 때에 본 방법의 정확성도 향상되게 된다. 그러한 데이터를 이용할 수 없는 경우에는, 본 방법의 사용자가 적절하게 검정된 화학물질을 선정하여 이용해야 한다. 이러한 경우에는, 구조적으로 불균질한 일련의 화학물질을 선정하는 편이 좋다. 하수오니에 대한 화학물질과 Koc값은 부록의 표 1에 제시하였고, 토양에 대한 화학물질과 Koc값은 부록의 표 3에 제시하였다. 여타의 검정 물질을 선정하여 사용하고자 하는 경우에는 그 타당성을 제시해야 한다.

2. 시험법 원리

2.1. HPLC는 분석 컬럼 상에서 수행한다. 이 컬럼은 일반적인 친지질성 및 극성 부분을 가진 시아노프로필 고형상으로 충전시켜야 한다. 실리카 모체(매트릭스)에 기반을 두는 보통 극성의 고정상을 사용한다.

―S ┊― CH2 ― CH2 ― CH2 ┋― CN

실리카      비극성 간극     극성 부분

시험방법의 원리는 OECD 시험지침 117(참고문헌 10)과 동일하다. 이동상이 컬럼을 통과하는 동안에 시험물질이 고정상과 반응하게 된다. 이동상과 고정상의 분배작용으로 인해, 시험물질은 지체된다. 극성 부분과 비극성 부분을 가지는 고정상은 어떠한 분자의 극성기 및 비극성기와 상호작용하는 이중 기능을 하므로, 마치 토양 혹은 하수오니 매트릭스 내에서의 유기물질과 같은 기능을 하게 된다.

2.2. pH는 극성 시험물질의 수착 거동에 특히 영향을 미치는 인자이다. 농업용의 토양이나 하수처리장 오니 탱크의 pH는 통상적으로 5.5~7.5이다. 이온성 물질에 대해서는 적절한 완충용액 중에서 이온화 형태 및 비이온화 형태의 두 가지 시험을 해야 한다. 그러나 시험물질의 10 % 이하가 pH 5.5~7.5에서 해리하는 경우에는 반드시 그러하지 아니하다.

2.3. HPLC 컬럼에서의 잔류현상과 흡착계수 사이의 상관관계를 평가용으로 이용하는 경우에는, 정량적인 분석기법은 수행하지 않고, 잔류시간만을 산정한다. 일련의 표준물질을 시중에서 구입할 수 있고 표준적인 시험조건을 맞출 수 있다면, 흡착계수 Koc을 산정하는 기법이 신속하고 효율적인 방안이 된다.

3. 품질 기준

3.1 정확도

통상적으로 시험물질의 흡착계수를 회분평형기법으로 산정하면 +/-0.5 log 단위의 값(주 10의 표 1 참조)이 된다. 보다 정확성을 기하려면 표준물질과 시험물질을 구조적으로 연계시켜야 한다.

3.2. 반복성

최소한 2 회 반복으로 측정하여 산정해야 한다. 각각의 측정치로부터 log Koc의 값을 산정하게 되면, 0.25 log 단위의 범위가 된다.

3.3. 재현성

본 방법의 적용에 따른 경험적 사실이 그 실증성을 보완하고 있다. 토양에 대한 Koc의 데이터가 확보가능한 농약류의 48 종 화학물질을 사용하여, HPLC법으로 산정하게 되면, 상관계수는 R=0.95(주 11, 12)가 된다. 한편, 11 곳의 실험실을 연계시킨 비교시험에서도 본 방법의 실증성을 보증하고 있다(주 13). 그 결과는 주 10의 표 2로 제시한다.

4. 시험 방법

4.1. 흡착계수의 예비 산정

옥탄올-물 분배계수 Pow(=Kow)와 수용해도를 비이온성 화학물질에 대한 흡착도의 지표로 사용할 수 있고, 그 흡착도의 범위 모색에도 사용할 수 있다. 몇 가지 부류의 화학물질에 대한 그 상관성은 주 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9에서 제시하고 있다.

4.2. 장치

진동 없는 펌프와 적절한 검지기가 부착된 액체 크로마토그래프를 준비하여야 한다. 주입 고리가 있는 주입 밸브의 사용을 권장한다. 실리카 기판 위에 시아노프로필을 화학적으로 결합시킨 수지(예. Hypersil, Zorbax CN)를 시중에서 구입하여 이용한다. 동일한 재료의 보호 컬럼을 주입 시스템과 분석 컬럼 사이에 위치시키기도 한다. 각 공급자로부터 제공되는 컬럼은 그 분리효율이 각각 상당히 다를 수 있다. 하나의 지침을 제시하자면, 다음과 같은 용량인자 k'를 확보할 수 있는 것이어야 한다. 즉 55/45 %의 메탄올/물을 이동상으로 이용할 때, log Koc=3.0에서 log k'>0.0 이어야 하고, log Koc=2.0 에서 log k'>-0.4 이어야 한다.

4.3. 이동상

몇 가지의 이동상을 시험한 결과 다음의 두 가지 중 하나를 선택하는 것을 권장한다.

(1) 메탄올/물(55/45 % v/v)

(2) 메탄올/0.01 M 시트레이트-완충액 pH 6.0(55/45 % v/v)

HPLC급의 메탄올과 증류수 혹은 시트레이트-완충액을 사용하여 용리용매를 조제한다. 이 혼합물은 사용하기 전에 탈기하여야 한다. 등 몰(mol) 용액의 용리액을 이용해야 한다. 메탄올/물의 혼합물이 적절하지 않다면, 에탄올/물 혹은 아세토니트릴/물의 혼합물과 같은 여타 유기용매/물의 혼합물을 이용할 수도 있다. 비이온성 화합물에 대해서는, 완충용액을 사용하여 pH를 조정할 필요도 있다. 일부의 유기상/완충액 혼합물에서는 침전이나 컬럼 열화가 발생할 수 있으므로 유의해야 한다.

4.4. 용질

시험물질 및 표준물질은 이동상에 용해되어야 한다.

5. 시험 수순

5.1. 시험 조건

측정 시의 온도를 기재한다. 시험물질의 검정이나 측정 및 산정을 위한 운전 시에는 일정한 조건이 유지되도록 컬럼 부분의 온도를 제어할 수 있어야 한다.

5.2. 데드타임(t0)

데드타임 t0는 I. 개론의 3.4.항에서 나타낸 바와 같이 두 가지의 방법을 사용하여 측정한다.

5.3. 균질 시리즈에 의한 데드타임 측정

신뢰성 있고 표준화된 절차를 채택하여 t0값을 측정한다. 이를 위해서는 OECD 시험지침 117의 분배계수(n-옥탄올/물), HPLC법을 이용할 수 있다(주 14).

5.4. 컬럼 비유지의 비활성 물질에 의한 데드타임의 측정

이 방법은 포름아마이드, 요소 혹은 나트륨 질산염의 주입을 기본으로 한다. 적어도 2 회 반복으로 측정해야 한다.

5.5. 잔류시간 tR의 측정

표준물질은 II. 시험의 1.항에서 기술한 바와 같이 선정해야 한다. 각 표준물질의 잔류시간이 여타 표준물질의 존재에 의해 영향을 받지 않는다면, 그 시간을 측정하기 위해 혼합 표준물질을 주입하기도 한다. 하루에 2 번은 정기적으로 검정하여, 컬럼 성능의 바람직하지 않은 변동을 방지해야 한다. 실제적으로 검정 주입은 잔류시간의 이상을 확인하기 위해 실시하는 시험물질 주입의 전과 후에 해야 한다. 시험물질은 컬럼의 과부하를 방지하기 위해 가능하면 양적으로 분리·주입하여 잔류시간을 측정한다.

5.6. 평가 산정

용량인자 k'는 I. 개론의 3.4.항의 식(4)을 이용하여 표준물질의 데드타임과 잔류시간으로부터 계산한다. 그 후에 표준물질의 log k' 데이터를 부록의 표 1과 표 3에서 제공하는 회분평형실험의 log Koc값들에 대해 도시한다. 이러한 플롯을 이용하면, 시험물질의 log k'값을 사용하여 그에 대한 log Koc값을 산정할 수 있다. 실제적인 결과치로서, 시험물질의 Koc가 검정 범위의 밖에 존재한다면, 그 시험은 보다 적절한 표준물질을 사용하여 다시 실시해야 한다.

III. 시험결과 및 보고

1. 시험 보고서

시험 보고서에는 다음과 같은 정보를 수록해야 한다.

1) 시험물질과 표준물질의 성상, 순도 및 pKa값

2) 장치와 운전조건의 설명, 예로써 분석 및 보호 컬럼의 형태와 크기, 검지의 방법, 이동상(성분비와 pH), 측정시의 온도범위 등

3) 데드타임과 그 측정 방법

4) 컬럼 내의 표준물질과 시험물질의 양

5) 검정에 사용하는 표준물질의 잔류시간

6) 산정한 회귀성(log k':log Koc)과 그 그래프

7) 시험물질에 대한 평균 잔류 데이터와 log Koc 값의 산정치

8) 크로마토그램시험

* 주 1 : W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere , 35(1/2), 121-128.

* 주 2 : M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), 2493-2504.

* 주 3 : W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.

* 주 4 : J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

* 주 5 : G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.

* 주 6 : C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227-231.

* 주 7 : Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 297-312.

* 주 8 : C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, 831-832.

* 주 9 : S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833-846.

* 주 10

표 1 HPLC법에 의한 토양 및 하수오니 Koc값의 비교 산정치

물질명	CAS 번호	log Koc 하수오니	log Koc HPLC	Δ	log Koc 토양	log Koc HPLC	Δ
아트라진 (atrazine)	1912-24-9	1.66	2.14	0.48	1.81	2.20	0.39
리뉴론 (linuron)	330-55-2	2.43	2.96	0.53	2.59	2.89	0.30
펜티온 (fenthion)	55-38-9	3.75	3.58	0.17	3.31	3.40	0.09
모뉴론 (monuron)	150-68-5	1.46	2.21	0.75	1.99	2.26	0.27
페난스렌 (phenanthrene)	85-01-8	4.35	3.72	0.63	4.09	3.52	0.57
벤조산 페닐에스테르 (benzoic acid phenylester)	93-99-2	3.26	3.03	0.23	2.87	2.94	0.07
벤즈아마이드 (benzamide)	55-21-0	1.60	1.00	0.60	1.26	1.25	0.01
4-니트로벤즈아마이드 (4-nitrobenzamide)	619-80-7	1.52	1.49	0.03	1.93	1.66	0.27
아세트아닐라이드 (acetanilide)	103-84-4	1.52	1.53	0.01	1.26	1.69	0.08
아닐린 (aniline)	62-53-3	1.74	1.47	0.27	2.07	1.64	0.43
2,5-디클로로아닐린 (2,5-dichloroaniline)	95-82-9	2.45	2.59	0.14	2.55	2.58	0.03

표 2 HPLC법에 의한 11곳 실험실 상호간 비교·실증시험의 결과치

물질명	CAS 번호	log Koc [OECD 106]	Koc	log Koc
			[HPLC 시험법]
아트라진 (atrazine)	1912-24-9	1.81	78±16	1.89
모뉴론 (monuron)	150-68-5	1.99	100±8	2.00
트리아펜테놀 (triapenthenol)	77608-88-3	2.37	292±58	2.47
리뉴론 (linuron)	330-55-2	2.59	465±62	2.67
펜티온 (fenthion)	55-38-9	3.31	2,062±648	3.31

표 3 토양흡착 데이터에 기반한 HPLC법 권장 표준물질

표준물질	CAS 번호	일괄 평형에서의 log Koc 평균치	Koc 데이터의 수	log S. D.	참고문헌
아세트아닐라이드 (acetanilide)	103-84-4	1.25	4	0.48	a
페놀 (phenol)	108-95-2	1.32	4	0.70	a
2-니트로벤즈아마이드 (2-nitrobenzamide)	610-15-1	1.45	3	0.90	b
N,N-디메틸벤즈아마이드 (N,N-dimethylbenzamide)	611-74-5	1.52	2	0.45	a
4-메틸벤즈아마이드 (4-methylbenzamide)	619-55-6	1.78	3	1.76	a
메틸벤조에이트 (methylbenzoate)	93-58-3	1.80	4	1.08	a
아트라진 (atrazine)	1912-24-9	1.81	3	1.08	c
이소프로튜론 (isoproturon)	34123-59-6	1.86	5	1.53	c
3-니트로벤즈아마이드 (3-nitrobenzamide)	645-09-0	1.95	3	1.31	b
아닐린 (aniline)	62-53-3	2.07	4	1.73	a
3,5-디니트로벤즈아마이드 (3,5-dinitrobenzamide)	121-81-3	2.31	3	1.27	b
카벤다짐 (carbendazim)	10605-21-7	2.35	3	1.37	c
트리아디메놀 (triadimenol)	55219-65-3	2.40	3	1.85	c
트리아조사이드 (triazoxide)	72459-58-6	2.44	3	1.66	c
트리아조포스 (triazophos)	24017-47-8	2.55	3	1.78	c
리뉴론 (linuron)	330-55-2	2.59	3	1.97	c
나프탈렌 (naphthalene)	91-20-3	2.75	4	2.20	a
엔도설판-디올 (endosulfan-diol)	2157-19-9	3.02	5	2.29	c
메티오카브 (methiocarb)	2032-65-7	3.10	4	2.39	c
액시드 옐로 219 (acid yellow 219)	63405-85-6	3.16	4	2.83	a
1,2,3-트리클로로벤젠 (1,2,3-trichlorobenzene)	87-61-6	3.16	4	1.40	a
γ-HCH	58-89-9	3.23	5	2.94	a
펜티온 (fenthion)	55-38-9	3.31	3	2.49	c
다이렉트 레드 81 (direct red 81)	2610-11-9	3.43	4	2.68	a
피라조포스 (pyrazophos)	13457-18-6	3.65	3	2.70	c
α-엔도설판 (α-endosulfan)	959-98-8	4.09	5	3.74	c
디클로폽-메틸 (diclofop-methyl)	51338-27-3	4.20	3	3.77	c
페난스렌 (phenanthrene)	85-01-8	4.09	4	3.83	a
베이직 블루 41 혼합물 (basic blue 41 mix)	26850-47-5 12270-13-2	4.89	4	4.46	a
DDT	50-29-3	5.63	1	-	b

a : W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No. 106 01 044 (1994).

b : B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304.

c : 산업계 제공 데이터

* 주 11 : W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), 2341-2352.

* 주 12 : B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils : Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285-304.

* 주 13 : W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.

* 주 14 : OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Partition coefficient (n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method TG 117: (adopted 1989).

제 22 항  완속교반법 분배계수(1-옥탄올/물) 측정 시험

I. 개론

1. 시험의 개요 및 목적

1-옥탄올/물 분배계수(Pow)는 log Pow값으로서 8.2에 이르는 값으로, 완속교반법(주 1)으로 정확하게 산정할 수 있다. 완속교반법은 소수성이 높은 화학물질의 Pow를 직접 측정할 수 있는 적절한 시험법이다.

1-옥탄올/물 분배계수(Pow)의 산정을 제시하는 여타의 지침으로서는 OECD 시험지침 107과 117(주 2, 3)이다. OECD 시험지침 107은 플라스크 진동법이며, OECD 시험지침 117은 역상의 HPLC 잔류 거동으로부터 Pow를 산정하는 방법이다. 플라스크 진동법은 수용상으로 옥탄올의 미세방울이 전달되기 때문에 인위적인 조작의 영향을 받기 쉽다. 수용상 내에 이러한 미세방울이 존재하게 되면 Pow 값의 증가에 따라 수중의 시험물질 농도를 과다하게 산정하는 경향도 증가한다. 그러므로 이 방법의 적용은 log Pow<4의 시험물질로 제한해야 한다. OECD 시험지침 117의 방법은 직접 측정한 확실한 Pow값으로부터 HPLC 잔류 거동과 Pow의 측정값 사이의 상관성을 구하여 이용하는 기법이다. 또한 OECD 가이드라인은 이온화성 화학물질의 1-옥탄올/물 분배계수를 산정하는데도 이용할 수 있다(주 4).

한편, 완속교반법은 수용상 내의 1-옥탄올 방울로부터 미세방울의 형성을 저하시키는 것으로 추정된다. 따라서 그러한 방울과 회합하는 시험물질 분자로 인해 수용상 내의 농도를 과대 산정하는 일은 일어나지 않게 된다. 그러므로 완속교반법은 log Pow의 기대치가 5 이상인 화학물질의 측정에 아주 적합하고, 진동-플라스크 법은 에러적인 결과를 가져오는 경향이 있다.

비활성의 유기화합물에 대해서는, 1-옥탄올/물 분배계수(Pow)와 그 화학물질의 물고기 체내 축적성 사이에는 상관성이 아주 높다. Pow는 어류 독성과 연관성이 있고, 토양이나 침전물과 같은 고형물로의 화학물질 수착과도 연관성이 있다. 그러한 상관성에 대해서는 주 6을 이용하여 파악한다.

1-옥탄올/물 분배계수와 여타 화학물질의 특성(환경독성, 화학적 특성) 사이의 다양한 상관관계도 제시되어 있다. 결론적으로 1-옥탄올/물 분배계수는 화학물질의 환경위해성 평가와 환경중 화학물질의 동태 예측에 중요한 파라미터로서 발전하게 된 것이다.

2. 시험의 제한사항

2.1. 화학물질은 분석 시약급의 고순도의 것으로 사용한다. 화학물질의 조성을 아는, 순도 99 %의 방사성 비표지 시험물질을 사용하거나, 화학물질의 조성과 방사화학적 순도를 아는 방사성 표지 시험물질을 사용하도록 권장한다. 반감기가 짧은 추적자인 경우에는 붕괴 보정한다. 방사성 표지 시험물질의 경우, 특정한 분석화학적 기법을 적용하여 방사능 측정치가 그 시험물질과 직접 연관되는 것인지를 확인해야 한다.

2.2. 시험물질 외의 화학물질이 존재하게 되면, 시험물질의 활동도 계수에 영향을 미칠 수 있으므로, 시험물질은 순수 화학물질로서 시험되어야 한다. 시판되는 최고 순도의 화학물질을 1-옥탄올/물 분배실험에 이용해야 한다.

2.3. 현재의 방법은 해리하거나 회합하지 않으며 계면활성이 크지 않은 순수 화학물질에 적용해야 한다. 그러한 화학물질과 혼합물의 1-옥탄올/물 분배 비율을 산정하는데 이용할 수 있다. 혼합물에 적용하는 경우에는, 측정한 1-옥탄올/물 분배 비율이 조건적이고, 그 혼합물의 화학적 조성에 따라 달라지고, 수용상으로 채용된 전해질 조성에 따라 달라진다. 추가적인 단계를 거치게 되면, 해리성 및 회합성 화합물에도 적용할 수 있다.

2.4. 유기산, 페놀, 유기염기 및 유기금속물질 등과 같은 해리성 물질의 1-옥탄올/물 분배에서 채용한 물과 1-옥탄올 내에서의 다양한 평형작용으로 인해, 1-옥탄올/물 분배 비율은 전해질 물질에 크게 영향 받는 조건적 상수이다(주 6, 7). 그러므로 1-옥탄올/물 분배 비율의 측정에서는 시험 중에 pH와 전해질 조성을 조절할 필요가 있고, 항상 기재해 두어야 한다. 이러한 분배 비율의 평가에서는 전문가의 조언과 판단도 받아야 한다. 해리 상수의 값을 사용하는 경우, 적절한 pH값을 선정해야 각 이온화 상태에서의 분배 비율을 산정할 수 있다. 유기금속화합물을 시험할 때에는 착물화 완충액을 사용해서는 안 된다(주 7). 기존의 수질 화학적 지식(착물화 상수, 해리상수)에 의하면, 그 시험조건은 수용상 내 시험물질의 화학종을 산정할 수 있는 방법으로 선정해야 한다. 그 이온강도는 기반적(백그라운드)인 전해질을 채택함에 의해 모든 시험에서 일치되게 해야 한다.

2.5. 물에 대한 용해도가 낮거나 높은 Pow를 가진 화학물질을 시험할 경우 시험 수행에 어려움이 있을 수 있다. 그 이유는 수중에서의 농도가 너무 낮아 정확하게 산정하기가 어렵기 때문이다. 본 시험지침에서는 이와 같은 문제점을 해결할 수 있는 지침도 제공한다.

3. 시험물질 정보

완속교반법으로 log Pow 측정 시험을 하기 이전에 다음과 같은 시험물질에 관한 정보를 확보해야 한다.

(a) 화학적 구조식

(b) 물과 1-옥탄올에서의 시험물질의 농도를 측정하는 기법

(c) 이온화 물질의 해리상수(OECD 시험지침 112, 주 8)

(d) 수용해도(OECD 시험지침 105, 주 9)

(e) 비생물적 가수분해성(OECD 시험지침 111, 주 10)

(f) 생물학적 분해성(OECD 시험지침 301, 주 11)

(g) 증기압(OECD 시험지침 104, 주 12)

4. 정의

물과 친유성 용매(1-옥탄올) 사이에서 화학물질의 분배계수는 두 상 사이에서 화학물질의 평형분포를 결정하는 것이다. 물과 1-옥탄올 사이의 분배계수(Pow)는 물로 포화된 1-옥탄올 속에서의 시험물질의 평형농도(Co)와 1-옥탄올로 포화된 물 속에서의 시험물질의 평형농도(Cw) 사이의 비로 정의한다.

[eqn: P _{ow} ``=`` {C _{o}} over {C _{w}}]

이는 농도의 비이므로 무차원이다. 대부분의 경우에는, 밑수 10으로 하는 대수(log Pow)의 값이다. Pow는 온도에 의존적이므로 그 데이터에는 특정온도를 기재하여야 한다.

Ⅱ. 시험

1. 표준물질

표준물질을 사용함에 있어 어떠한 새로운 물질을 조사하는 경우마다 항상 표준물질이 있어야 하는 것은 아니다. 표준물질은 사전에 시험법을 보정하기 위해서 수시 점검을 실시하거나, 본 시험법 외에 다른 시험법을 적용하여 결과를 산출했을 경우 그 시험결과와 본 시험법에 의해 산출된 시험결과를 서로 비교하기 위한 목적으로 사용한다.

2. 시험법 원리

분배계수의 측정에 있어서 물과 1-옥탄올 및 시험물질은 일정한 온도에서 서로 간에 평형을 이루어야 한다. 그 때 두 상에서의 시험물질의 농도를 측정한다.

플라스크 진동법 시험 중에 미세방울이 생성됨에 의해 겪게 되는 실험적인 어려움은 여기서 제시하는 완속교반법에서 저하시킬 수 있다. 완속교반 시험에서는 물과 1-옥탄올 및 시험물질이 온도조정 교반장치 내에서 평형을 이루게 된다. 두 상 사이의 교환작용은 교반에 의해 가속화된다. 교반에 의해 미세방울의 생성 없이 1-옥탄올과 물 사이의 교환을 진척시키는 난류도를 유한하나마 증가시키는 것이다(주 1).

3. 시험 방법

3.1. 장치

본 시험에는 다음과 같은 표준 시험 장치를 필요로 한다.

(1) 전자교반 막대(테플론 코팅제의 전자교반 막대는 수용상의 교반에 이용)

(2) 기대한 농도에서 시험물질의 농도를 측정할 수 있는 분석 장치

(3) 바닥에 꼭지가 있는 교반조. 시험물질의 log Pow 산정치와 검지한계(LOD)에 따라, 1 ℓ 이상의 기하학적 구조가 같은 반응용기 사용. 이는 화학적 추출과 분석에서 충분한 수량을 확보하기 위한 것임. 그러면 반복추출로 인한 추출물의 농도가 높아져 보다 신뢰성 있는 분석이 가능함. 최소한의 물량, 시험물질의 LOD, log Pow값, 물에 대한 용해도 등은 주 13의 표에 제시함. 옥탄올과 물에서의 용해도의 비율 및 log Pow의 관계식에 기초한 이 표는 Pinsuwan 등(주 14)이 다음과 같이 제시한 것임.

[eqn: log`P _{ow} ``=`0.88`log`SR``+`0.41]

여기에서,

[eqn: SR```=``` {S _{oct}} over {S _{w}} ```(in```molarity)]

(4) 물에 대한 용해도를 예측하는 Lyman의 관계식(주 15). 물에 대한 용해도는 주 13에서 제시한 관계식으로 산정한 초기 산정치임. 이로써 사용자는 소수성과 용해도 사이의 상관성을 보다 잘 대변한다고 여겨지는 관계식에 의해 물에 대한 용해도를 산정할 필요가 없어짐. 고형화합물에 대해서는, 용해도의 예측에서 융점을 제시해야 함. 변형관계식을 사용하는 경우에는 옥탄올 내에서의 용해도 산정의 관계식이 타당한 지를 검토해야 함. 약 1 ℓ 정도의 용량을 가진 유리로 감싼 교반조의 개략도는 주 16에서 제시함. 주 16의 교반조의 크기는 타당한 것으로 실증되어 있으므로, 다른 크기의 장치를 이용할 때에도 준수되어야 함.

(5) 완속교반 중에 필수적인 일정온도 유지의 수단.

시험용기는 용기의 표면에 대한 흡착이 무시될 수 있을 정도로 작은 비활성 재료로 제작해야 한다.

3.2. 시험물질의 조제

3.2.1. Pow의 산정은 시판되는 최고 순도(+99 %)의 1-옥탄올로 해야 한다. 1-옥탄올의 정제(정화)는 산과 염기 및 물로 추출하고 건조시켜서 한다. 또한 증류시켜 1-옥탄올을 정제시킬 수도 있다. 정제시킨 1-옥탄올을 사용하여 시험용액의 표준용액을 조제한다. Pow의 산정에서 사용하는 물은 유리 혹은 석영으로 증류시킨 것이거나, 증류장치에서 얻은 것이어야 하고, HPLC급의 물이어야 한다. 증류 시에는 0.22 ㎛의 필터로 여과하여야 한다. 공시험에서는 시험물질을 간섭할 수 있는 불순물이 농축 추출물 속에 존재하지 않은 지를 체크해야 한다. 유리섬유 필터를 사용하는 경우, 400 ℃에서 최소한 3 시간 동안 건조시켜 깨끗이 해야 한다.

3.2.2. 충분히 큰 시험용기 속에서 두 용매를 평형시키는 실험 이전에 두 용매는 서로 포화되어 있어야 한다. 이는 2 일 동안 두 상을 완속교반하여 수행하는 것이다.

3.2.3. 시험물질의 농도를 적절하게 하여, 물로 포화된 1-옥탄올 속에 용해시킨다. 1-옥탄올/물 속의 희박용액 중에서 1-옥탄올/물 분배계수를 측정하도록 한다. 시험물질의 농도는 어느 상 속에서의 최고 농도도 0.7 M이어야 하지만, 그 용해도의 70 %를 초과해서는 아니 된다(주 1). 시험에 사용한 1-옥탄올 용액은 시험물질의 현탁상 고형물이 없는 것이어야 한다.

3.2.4. 시험물질의 적정한 양을 물로 포화된 1-옥탄올 속에 용해시킨다. log Pow의 산정치가 5를 초과하는 경우에는 시험에 사용한 1-옥탄올 용액이 시험물질의 현탁상 고형물이 없는지를 확인한다. 마지막으로, log Pow 산정치가 5 이하인 화학물질에 대해서는 다음의 절차를 준수하도록 한다

(1) 시험물질을 물로 포화된 1-옥탄올에 용해시킨다.

(2) 용해 시에는 현탁상 고형물이 침전되어 없어지도록 충분한 시간을 준다. 침전시간 동안에는 시험물질의 농도를 모니터링 한다.

(3) 1-옥탄올 용액 내의 농도 측정치가 안정된 값을 얻은 후에는, 저장용액을 적절한 부피의 1-옥탄올로 희석한다.

(4) 희석 저장용액의 농도를 측정한다. 농도 측정치가 희석치와 일치하는 때에는 희석 저장용액을 완속교반 시험에 이용하도록 한다.

3.3. 시료의 추출 및 분석

3.3.1. 시험물질의 분석에는 실증된 분석법을 사용한다. 조사자는 그 시험 중에 물로 포화된 1-옥탄올 및 1-옥탄올로 포화된 물에서의 농도가 분석법의 정량적 한계치 이상인 지를 확인해야 한다. 추출법이 필요한 경우의 시험 이전에는 수용상과 1-옥탄올 상으로부터 시험물질을 회수하는 분석법도 채택한다. 공시험에서는 분석 시그널을 보정해야 하고, 하나의 시료에서 다른 시료로 분석물이 이월되는 일이 없도록 특히 유의한다.

3.3.2. 유기용매에 의한 수용상의 추출 및 추출물의 일차농축을 분석 이전에 실시하는 것이 좋을 경우도 있다. 이런 경우는 수용상에서의 소수성 시험물질이 농도가 낮아진 경우가 그러하다. 이와 같은 이유로, 공시험의 농도를 저하시킬 필요가 생긴다. 따라서 잔류물의 분석에 적절한 고순도의 용매를 채택한다. 미리 깨끗이 세척한 유리제 기구(예로써 용액세척, 고온건조)를 사용하면 총괄적인 오염을 방지하는데 도움이 된다.

3.3.3. log Pow의 산정치는 산정 프로그램이나 전문가의 도움으로 구할 수 있다. 그 값이 6 이상인 경우, 공시험을 보정하거나 분석물의 이월(이동)을 모니터링 해야 한다. 마찬가지로, log Pow의 산정치가 6을 초과하는 경우에는 회수 보정에 대한 대안적 표준방법도 모색하여, 일차농축 인자를 높게 한다. 시판되는 log Pow 산정 소프트웨어 프로그램을 들어보자면, Clog P(주 17), KOWWIN(주 18), ProLogP(주 19), ACD log P(주 20) 등이다. 산정법 모색의 접근기법은 주 21~23에 있다.

3.3.4. 1-옥탄올 및 물에서의 시험물질에 대한 정량한계(LOQ)도 적절한 방법으로 수립해 놓는다. 대개는, 정량의 방법적 한계는 10의 소음율로 표시하는 물 혹은 1-옥탄올에서의 농도로 결정한다. 적절한 추출 및 일차농축 기법도 선정해야 하고, 분석적 회수기법도 특정해야 한다. 일차농축 인자를 선정하게 되면, 분석 측정에서 필요한 시그널의 크기도 알 수 있다.

3.3.5. 분석기법의 파라미터 및 기대 농도치에 의거하여, 화학물질 농도의 정확한 측정에 필요한 시료 크기를 구할 수 있다. 너무 소량이어서 충분한 분석 시그널을 얻을 수 없는 시료수의 사용은 피해야 한다. 또한 너무 많은 물의 사용도 피하여야 한다. 그러하지 아니한다면, 최소한의 분석횟수(n=5)에 필요한 수량을 확보할 수 없기 때문이다. 주 13에서는, 최소한의 시료부피를 시험용기의 부피와 시험물질의 LOD 및 시험용액의 용해도의 함수로서 나타내어 둔다.

3.3.6. 시험물질의 정량화는 각 화학물질의 검정 곡선을 비교하여 구할 수 있다. 분석 시료의 농도와 표준물질 농도는 괄호로서 구별지어야 한다.

3.3.7. log Pow의 산정치가 6 이상인 시험물질에 대해서는, 추출 이전에 대안적 기법을 물 시료에 도입하여, 물 시료의 추출이나 알치농축 이전에 발생되는 손실치를 기재한다. 정확한 회수 보정을 위해, 대안 물질은 시험물질과 비슷하거나 일치하는 특성을 가져야 한다. 안정된 방사성 동위원소(예. 13C-표지)의 표지가 된 대안물질을 사용한다. 13C나 2H 표지의 안정된 방사성 동위원소의 사용이 불가능하다면, 대안물질의 물리화학적 특성이 시험물질의 물리화학적 특성과 아주 유사하다는 사실을 제시 문헌의 신뢰성 있는 데이터로부터 찾아서 이용한다. 수용상의 액-액 추출 동안에는 에멀션이 생성될 수 있다. 이러한 현상의 발생은 염을 추가하거나 에멀션을 밤새 침전시켜 저하시킬 수 있다. 시료의 추출 및 일차농축에 적용한 방법은 보고서에 기재한다.

3.3.8. 1-옥탄올 상으로부터 회수한 시료는 분석 이전에 적절한 용매로써 희석한다. 회수 시험에서 상대표준편차 10 % 이상의 높은 편차를 나타내는 시험물질에 대해서는 회수 보정에 대한 대안 물질의 사용을 권장한다.

3.3.9. 분석방법에 대한 상세한 사항도 보고·기재해야 할 필요가 있다. 이에는 추출방법, 일차농축, 희석인자, 측정기 파라미터, 검정기법, 산정범위, 물로부터의 시험물질의 분석 회수, 회수 보정을 위한 대안 표준물질의 첨가, 공시험치, 검지한계 및 정량한계 등이다.

4. 시험 수순

4.1. 1-옥탄올/물의 최적 부피비

4.1.1. 물과 1-옥탄올의 부피를 선정할 때는, 1-옥탄올과 물에서의 LOQ, 물 시료에 적용하는 일차농축 인자, 1-옥탄올과 물에서 시료채취한 부피, 기대 농도 등을 고려한다. 실험적인 이유로, 완속교반 시스템 내의 1-옥탄올의 부피는 1-옥탄올 층이 0.5 ㎝ 이상이 되어 교란없이 1-옥탄올 상의 시료채취가 가능하도록 한다.

4.1.2. log Pow 산정치가 4.5 이상인 화학물질의 측정에 사용되는 전형적인 상의 비율은 1 ℓ 용기 속에서 1-옥탄올이 20~50 ㎖이고, 물은 950~980 ㎖이다.

4.2. 시험 조건

4.2.1. 시험 중의 반응 용기는 온도변화가 1 ℃ 이하로 되도록 제어되어야 한다. 분석은 25 ℃에서 시행한다.

4.2.2. 시험 시스템이 햇빛을 받지 않도록 어두운 방안에서 시험하거나 알루미늄 호일로 반응 용기를 감싸고 시험해야 한다.

4.2.3. 시험은 가능하면 먼지가 없는 환경에서 시행한다.

4.2.4. 평형에 도달할 때까지 1-옥탄올-물 시스템을 교반한다. 예비 시험으로, 완속교반 시험을 하면서 그리고 물과 1-옥탄올을 주기적으로 시료채취하면서, 평형도달 시간을 산정한다. 시료채취시간 포인트는 최소 5 시간이 되도록 산재시켜야 한다.

4.2.5. 적어도 3 가지의 독립적인 완속교반 시험을 수행하면서 각 Pow값을 산정한다.

4.3. 평형시간의 산정

네 개의 시간 지점의 한 시간 간격에 걸쳐서 1-옥탄올/물 농도의 회귀성(회귀식)이 p 레벨 0.05에서 0과 크게 다르지 않는 기울기를 만들 때 평형상태에 도달한다고 가정한다. 평형 시간은 최소한 시료채취 전 1 일이 되어야 한다. 대개는 log Pow 산정치가 5 이하인 시험물질의 시료채취는 2 일 동안 실시한다. 소수성 화합물이 증가하게 되면, 평형시간을 연장시키기도 한다. log Pow 산정치가 8.23인 디카클로로비페닐과 같은 화합물의 경우, 144시간으로 평형에 도달할 수 있다. 평형은 단일의 시험용기에 대해 반복적으로 시료채취함으로써 평가한다.

4.4. 시험 시작

4.4.1. 시험을 시작할 때에는 반응용기는 1-옥탄올로 포화된 물로써 채운다. 제어온도에 도달할 때가지 충분한 시간을 할당한다.

4.4.2. 물로 포화된 1-옥탄올의 적절한 부피에 용해된 시험용액의 합당한 양을 반응용기에 조심스레 첨가한다. 이는 두 상 사이의 난류 혼합을 방지해야 하기 때문에 시험에서 중요한 단계이다. 따라서 1-옥탄올 상을 천천히 피펫으로 물 표면에 인접하는 시험용기의 벽면 부근에서 채취한다. 이를 유리벽면을 따라 흐르게 하여, 수용상 위에 박막을 형성시킨다. 여기서 1-옥탄올을 직접 플라스크 속으로 따라 넣는 일은 피해야 한다. 1-옥탄올의 방울들이 물 속으로 직접 떨어지지 않도록 주의한다.

4.4.3. 교반 시작 후에는 교반속도를 서서히 증가시킨다. 교반 모터의 조정이 불가능한 때에는 속도변환기의 사용도 고려해 볼만하다. 교반속도의 조정은 0.5~2.5 ㎝ 깊이의 물과 1-옥탄올 사이의 계면에서 와류가 생성되게 하는 것이다. 2.5 ㎝의 와류 깊이가 초과되는 경우에는 교반속도를 저하시켜야 한다. 그러하지 아니한다면, 수용상의 1-옥탄올 방울로부터 미세방울들이 생성되어, 물 내의 시험물질 농도를 과대 산정되게 하는 것이다. 순환-시험 실증연구(주 24)의 결과에 의하면, 최대 교반속도는 2.5 ㎝이다. 평형속도가 빨라질 때에는 1-옥탄올 미세방울의 생성을 제한토록 하고 있다.

4.5. 시료채취 및 시료처리

4.5.1. 시료채취 이전에 교반기는 중지해야 하고, 액체의 이동은 멈추게 해야 한다. 시료채취가 완료된 후에는 교반기는 다시 서서히 가동시키고, 교반속도를 서서히 증가시킨다.

4.5.2. 수용상은 반응용기의 바닥에 있는 꼭지로부터 시료채취 한다. 그 꼭지 속에 있는 데드볼륨의 물은 항상 버려야 한다(주 16의 용기에서는 5 ㎖ 정도). 꼭지 속의 물은 교반되어 있지 아니하므로, 전체 액체와 평형이 되어 있지 못하기 때문이다. 시료를 채취한 수량을 기재하여, 질량 균형을 맞출 때에 버려진 물속의 시험물질량을 고려할 수 있게 한다. 물은 분액 깔때기 속에서 흐르게 하여 물/1-옥탄올 층의 교란을  방지하고, 증발손실을 최소화시킨다.

4.5.3. 100 ㎕ 용량의 유리금속 시린지로써 1-옥탄올 층으로부터 미소량(100 ㎕ 정도)을 빼어내어 1-옥탄올 시료로 한다. 경계층이 교란되지 않도록 주의해야 한다. 시료채취한 양도 기재하여 둔다. 1-옥탄올의 시료는 희석해야 하므로 그러한 미소량의 시료로서도 충분하다.

4.5.4. 불필요한 시료 이동 단계는 피한다. 시료부피는 중량적으로 결정한다. 물 시료의 경우에는 이미 용매의 부피로 들어있는 분액 깔때기 속의 물을 시료채취함으로써 그러한 목적을 이룰 수 있다.

III. 시험결과 및 보고

1. 결과의 해석

1.1. 현재의 지침에 따르자면, Pow는 동일한 조건 속에서 시험화학물질에 대해 3번의 완속실험(3 실험단위)으로 산정한다. 평형도달에 적용한 회귀식은 연속적인 타임 포인트에서 Co/Cw의 비를 최소한 4 번 측정하여 산정하는 것이다. 그리하여, 각 실험 단위에서 구한 평균치의 불확도에 대한 척도로서 분산값을 계산한다.

1.2. Pow는 각 실험 단위에서 얻어지는 데이터의 분산치로부터 산정할 수도 있다. 이러한 정보를 이용하여 각 실험 단위 결과치의 가중평균으로서 Pow를 산정하기도 한다. 그러기 위해서는, 실험단위 결과치의 분산치의 역수를 가중치로서 이용하는 것이다. 따라서 편차(분산치로 표현)가 큰 데이터는 신뢰성이 낮으므로, 분산치가 낮은 데이터보다도 결과치에 대한 영향이 적다.

1.3. 마찬가지로 가중표준편차도 산정할 수 있다. 이는 Pow 산정치의 재현성을 특징짓게 된다. 가중표준편차가 낮은 값이라는 것은 그 실험실 내에서 Pow 산정치의 재현성이 상당하다는 것이다. 각종 데이터의 공식적 통계처리에 대해서는 아래에서 기술한다.

2. 결과 처리

2.1. 평형도달 증명

1-옥탄올과 물에서의 시험물질의 농도비(Co/Cw)에 대한 대수값은 각 시험시간 중에 산정한다. 화학적 평형도달은 이러한 농도비를 시간에 대해 도시하여 나타낸다. 이와 같은 플롯의 최고 평탄영역은 적어도 4 개의 시간 포인트에 기준하므로 평형에 도달했음을 의미하는 것이고, 그 화학물질이 완전히 1-옥탄올에 용해되었음을 의미하는 것이다. 만약 그러하지 않다면, 시험을 중지하지 않고, 4 개의 시간 포인트가 p 레벨 0.05에서 0과 크게 다르지 않은 기울기를 만들 때까지 지속한다. 그러므로 log Co/Cw는 시간에 독립적이다.

2.2. log Pow의 계산

시험 단위의 log Pow값은 평형을 나타내는 시간 : log Co/Cw의 곡선부분에 대해 log Co/Cw의 가중평균치로 산정하는 것이다. 그 최종 결과치에 대한 데이터의 영향이 데이터의 불확도에 역비례하게 되는 분산치를 초래하므로, 그 가중평균치는 분산치의 역수를 가중치로 하여 계산하는 것이다.

2.3. log Pow 평균치의 산정

2.3.1. 각 실험 단위의 log Pow의 평균치는 각 분산치에 가중치가 부가된 각 실험 단위의 결과치 평균으로서 계산한다. 그 계산의 과정은 다음과 같다.

[eqn: log`P _{OW,Av} `````=```( sum _{} ^{} w _{i} ``` TIMES ```log`P _{OW,i} `)`` TIMES `( sum _{} ^{} w _{i} `) ^{-1}]

여기에서, log POW,i : 각 실험 단위 i의 log Pow값

log Pow,Av : 각 log Pow 산정치의 가중평균치

wi : 각 실험 단위 i의 log Pow 산정치에 할당된 통계적 가중치

이다. log Pow 분산치의 역수는 [eqn: w _{i} ``=``var(log`P _{OW,i} ) ^{-1}]로서 산정한다.

2.3.2. log Pow의 평균치에 대한 오차는 각 실험 단위의 평형기간 중에 구한 log Co/Cw의 재현성으로 산정한다. 또한 이는 log POW,Av 와 연관되는 오차의 척도인 [eqn: log`P _{OW,Av} ``( sigma _{logP _{OW,Av}} )]의 가중표준편차로 나타내기도 한다. 이 가중표준편차는 다음과 같이 가중분산치([eqn: var _{log`P _{OW,Av}}])로 계산할 수도 있다.

[eqn: var _{log`P _{OW,Av}} ``=``( sum _{} ^{} w _{i} `` TIMES ``(log`P _{OW,i} ``-``log`P _{OW,Av} ) ^{2} ``` TIMES ``( sum _{} ^{} w _{i} ` TIMES `(n-1)) ^{-1}]

[eqn: sigma _{logP _{OW,Av}} ```=``(var _{logP _{OW,Av}} ) ^{0.5}]

여기서 n의 표지는 시험단위의 수이다.

3. 시험보고서

시험보고서는 다음 사항을 내포한다.

3.1. 시험물질

(1) 관용명, 화학명, CAS번호, 화학적 구조(방사성 표지물질에서는 표지의 위치지정) 및 관련되는 물리화학적 특성

(2) 시험물질의 순도와 불순물

(3) 방사성 표지 화학물질의 표지 순도와 몰 활성도

(4) log Pow의 일차 산정치와 그 계산방법

3.2. 시험조건

(1) 시험 수행의 일자

(2) 시험 중의 온도

(3) 시험 시작 시의 1-옥탄올과 물의 부피

(4) 1-옥탄올과 물의 시료채취량(부피)

(5) 시험용기에 남아있는 1-옥탄올과 물의 부피

(6) 시험용기 설명서 및 시험조건(교반막대와 시험용기의 기하학적 형태, 와류높이(㎜), 교반속도 등)

(7) 시험물질의 측정 및 분석방법, 정량한계

(8) 시료를 채취한 시간

(9) 수용상의 pH와 완충액(이온화 분자의 pH조정).

(10) 시험을 반복한 횟수

3.3. 시험결과

(1) 분석방법의 재현성과 감도

(2) 시간의 함수로서 1-옥탄올과 물에서의 시험물질의 농도 산정치

(3) 질량 균형 제시

(4) 시험 중의 온도와 온도의 표준편차 혹은 온도의 범위

(5) 시간에 대한 농도비의 회귀식(회귀성)

(6) log Pow 의 평균치와 그 표준오차

(7) 결과치의 검토와 해석

(8) 대표적인 분석의 본래 데이터 수치(모든 본래 데이터는 가공하지 않은 상태로 GLP 기준에 따라 보관되어야 한다). 여기에는 대안 물질의 회수, 검정에 사용된 농도의 수(검정곡선의 상관계수에 대한 기준에 의거), OA/OC의 결과 등을 포함해야 한다.

(9) 분석절차의 실증화 보고서(참고문헌으로 제시가능)

* 주 1 : De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the 'slow-stirring' method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.

* 주 2 : OECD (1995) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 107 Partition Coefficients. Paris.

* 주 3 : OECD (2004) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 117 Partition Coefficients by Reversed Phase Chromatography. Paris.

* 주 4 : OECD (2000) OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.

* 주 5 : Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.

* 주 6 : Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.

* 주 7 : Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.

* 주 8 : OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.

* 주 9 : OECD (1995) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 105 Water Solubility. Paris.

* 주 10 : OECD (2004) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 111 Hydrolysis as a function of pH. Paris.

* 주 11 : OECD (1992) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 301 Ready Biodegradability. Paris.

* 주 12 : OECD (1995) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 104 Vapour Pressure. Paris.

* 주 13 : 수용상에서 다양한 log Pow값을 갖는 시험물질의 검지에 필요한 물의 최소 부피를 산정하는 절차

* 가정:

1) 각 시험액의 최소 부피=총 부피의 10 % ;  5 시험액=총 부피의 50 %

2) 시험물질의 농도=0.7×각 상에서의 용해도;  농도가 낮을수록 부피를 증가시킨다.

3) LOD의 산정에 이용한 부피 = 100 ㎖

4) log Pow : log Sw 및 log Pow : SR(Soct/Sw)는 시험물질의 상관성 제시에 유용.

Sw 평가
log Pow	계산식	log Sw	Sw(㎎/ℓ)
4	(-)0.922*log Pow+4.184	0.496	3.133E+00
4.5		0.035	1.084E+00
5		-0.426	3.750E-01
5.5		-0.887	1.297E-01
6		-1.348	4.487E-02
6.5		-1.809	1.552E-02
7		-2.270	5.370E-03
7.5		-2.731	1.858E-03
8		-3.192	6.427E-04

Soct 평가
log Pow	계산식	Soct(㎎/ℓ)
4	log Pow=0.88log SR+0.41	3.763E+04
4.5	log Pow=0.88log SR+0.42	4.816E+04
5	log Pow=0.88log SR+0.43	6.165E+04
5.5	log Pow=0.88log SR+0.44	7.890E+04
6	log Pow=0.88log SR+0.45	1.010E+05
6.5	log Pow=0.88log SR+0.46	1.293E+05
7	log Pow=0.88log SR+0.47	1.654E+05
7.5	log Pow=0.88log SR+0.48	2.117E+05
8	log Pow=0.88log SR+0.49	2.710E+05

시험물질 총 질량 (㎎)	질량oct/질량w	질량H2O (㎎)	ConcH2O (㎎/ℓ)	Massoct (㎎)	Concoct (㎎/ℓ)
1,319	526	2.5017	2.6333	1,317	26,333
1,686	1,664	1.0127	1.0660	1,685	33,709
2,158	5,263	0.4099	0.4315	2,157	43,149
2,762	16,644	0.1659	0.1747	2,762	55,230
3,535	52,632	0.0672	0.0707	3,535	70,691
4,524	166,436	0.0272	0.0286	4,524	90,480
5,790	526,316	0.0110	0.0116	5,790	115,807
7,411	1,664,357	0.0045	0.0047	7,411	148,223
9,486	5,263,158	0.0018	0.0019	9,486	189,713

부피 계산
	각 LOD 농도에서 H2O 상에 필요한 최소 부피
log Kow	LOD(㎍/ℓ)→	0.001	0.01	0.10	1.00	10
4		0.04	0.38	3.80	38	380
4.5		0.09	0.94	9.38	94	938
5		0.23	2.32	23.18	232	2,318
5.5		0.57	5.73	57.26	573	5,726
6		1.41	14.15	141	1,415	14,146
6.5		3.50	34.95	350	3,495	34,950
7		8.64	86.35	864	8,635	86,351
7.5		21.33	213	2,133	21,335	213,346
8		52.71	527	5,271	52,711	527,111
LOD에 사용된 부피(ℓ)	0.1

계산의 핵심
1 ℓ 평형 용기, 수용상 총 부피의 10 % 이하 표시
2 ℓ 평형 용기, 수용상 총 부피의 10 % 이하 표시
5 ℓ 평형 용기, 수용상 총 부피의 10 % 이하 표시
10 ℓ 평형 용기, 수용상 총 부피의 10 % 이하 표시
10 ℓ 평형용기, 10 % 초과

◈ 물에 대한 용해도와 log Pow의 함수로서 나타내는 산정 부피의 값

		각 LOD 농도에서 H2O 상에 필요한 최소 부피(㎖)
log Pow	Sw(㎎/ℓ)	LOD(㎍/ℓ)→	0.001	0.01	0.10	1.00	10
4	10		0.01	0.12	1.19	11.90	118.99
	5		0.02	0.24	2.38	23.80	237.97
	3		0.04	0.40	3.97	39.66	396.62
	1		0.12	1.19	11.90	118.99	1189.86
4.5	5		0.02	0.20	2.03	20.34	203.37
	2		0.05	0.51	5.08	50.84	508.42
	1		0.10	1.02	10.17	101.68	1016.83
	0.5		0.20	2.03	20.34	203.37	2033.67
5	1		0.09	0.87	8.69	86.90	869.01
	0.5		0.17	1.74	17.38	173.80	1738.02
	0.375		0.23	2.32	23.18	231.75	2317.53
	0.2		0.43	4.35	43.45	434.51	4345.05
5.5	0.4		0.19	1.86	18.57	185.68	1856.79
	0.2		0.37	3.71	37.14	371.36	3713.59
	0.1		0.74	7.43	74.27	742.72	7427.17
	0.05		1.49	14.85	148.54	1485.43	14854.35
6	0.1		0.63	6.35	63.48	634.80	6347.95
	0.05		1.27	12.70	126.96	1269.59	12695.91
	0.025		2.54	25.39	253.92	2539.18	25391.82
	0.0125		5.08	50.78	507.84	5078.36	50783.64
6.5	0.025		2.17	21.70	217.02	2170.25	21702.46
	0.0125		4.34	43.40	434.05	4340.49	43404.93
	0.006		9.04	90.43	904.27	9042.69	90426.93
	0.003		18.09	180.85	1808.54	18085.39	180853.86
7	0.006		7.73	77.29	772.89	7728.85	77288.50
	0.003		15.46	154.58	1545.77	15457.70	154577.01
	0.0015		23.19	231.87	2318.66	23186.55	231865.51
	0.001		46.37	463.73	4637.31	46373.10	463731.03
7.5	0.002		19.82	198.18	1981.77	19817.73	198177.33
	0.001		39.64	396.35	3963.55	39635.47	396354.66
	0.0005		79.27	792.71	7927.09	79270.93	792709.32
	0.00025		158.54	1585.42	15854.19	158541.86	1585418.63
8	0.001		33.88	338.77	3387.68	33876.77	338767.72
	0.0005		67.75	677.54	6775.35	67753.54	677535.44
	0.00025		135.51	1355.07	13550.71	135507.09	1355070.89
	0.000125		271.01	2710.14	27101.42	271014.18	2710141.77
LOD에 사용된 부피(ℓ)		0.1

* 주 14 : Pinsuwan, S., Li, A. and Yalkowsky, S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data., 40: 623-626.

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