방류수산생물전염병 검사 실시 요령

제정 2010. 6.  7 국립수산과학원 예규 제71호

개정 2013. 3. 24 국립수산과학원 예규 제82호

개정 2013. 4. 24 국립수산과학원 예규 제84호

제1조 (목적) 이 요령은 「수산동물질병관리법」제20조제1항 및 「방류수산생물의검사등에관한고시」(이하 “고시” 라 한다) 제5조에 따라 국립수산과학원 및 방류수산생물전염병검사기관이 방류수산생물의 수산동물전염병 검사를 실시함에 있어 필요한 세부사항을 규정함을 목적으로 한다.<개정 2013.3.24>

제2조 (정의) 이 규정에서 사용하는 용어의 뜻은 다음 각 호와 같다.

1. ‘수산동물전염병’이란 고시 제3조의 검사항목으로 규정된 질병을 말한다.

2. ‘방류수산생물전염병검사기관(이하 “검사기관”이라 한다)’이란 국립수산과학원(소속기관을 포함한다) 및 국립수산과학원과 방류수산생물의 검사협력에 관한 양해각서(MOU)를 체결한 수산동물병성감정실시기관을 말한다.<개정 2013.3.24>

3. ‘임상검사’란 수산동물의 기형, 유영․행동, 외부소견 및 해부학적 이상 유무 등을 종합하여 검사하는 것을 말한다.

4. ‘PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소연쇄반응) 검사’란 수산동물전염병에 감염된 조직 및 분리된 병원체에서 추출한 유전자를 DNA 중합효소를 이용하여 다량으로 증폭시켜 검출하고자 하는 병원체의 유전자 크기와 비교하여 진단하는 검사방법을 말한다.

5. ‘확정진단’이란 임상검사 및 정밀검사 등을 통해 수산동물전염병에 감염된 것으로 최종적으로 확정하는 과정을 말한다.

제3조 (검사신청서의 접수 등) ① 검사기관의 장은 고시 제4조의 ‘방류수산생물전염병검사신청서’의 접수 및 검사 등을 위하여 검사 전담 담당자(이하 ‘검사담당자’라 한다)를 둘 수 있다.<개정 2013.3.24>

② 검사담당자는 검사대상 양식장에서 보유중인 물량의 일부만 방류하는 경우 방류물량이 포함되는 모든 양식장 단위시설에서 검사신청용 시료가 채취되었는지의 여부를 확인하여야 하며, 이 경우 반드시 시료가 채취된 수조 및 노지 등의 사육 단위별로 보유물량이 기재된 양식장 도면을 검사신청서와 함께 징구하여 보관하여야 한다.

③ 제1항에 따른 검사 신청용 시료가 검사대상 양식장에서 보유하고 있는 전체 물량에서 일정량씩 채취된 경우 제2항의 양식장 도면 징구를 생략할 수 있다.

제4조 (검사의 실시) ① 검사담당자는 방류수산생물전염병검사 신청자(또는 기관)로부터 제출받은 검사용 시료에 대하여 임상검사 등을 통하여 외관상 질병의 증상이 없는 건강한 개체임을 확인하여야 한다.<개정 2013.3.24>

② 제1항의 임상검사 결과 기형, 유영․행동, 외부소견 및 해부학적 이상이 없는 경우 정밀검사를 실시하여야 한다.

③ 수산동물전염병의 정밀검사는 고시(별표1)에 따라 품종별로 지정된 검사 항목을 PCR 검사로 실시하여야 하며, PCR 검사의 세부적인 사항은 본 요령(별표 1부터 10까지)에 따라 실시한다.

④ 검사기관의 장은 제3항에 따른 수산동물전염병에 대한 정밀검사 결과 수산동물전염병에 감염된 것으로 추정될 경우 국립수산과학원장에게 확정진단을 의뢰하고 관련 시료를 송부하여야 한다.

⑤ 검사기관의 장은 제4항에 따른 확정진단의 대상이 되는 양식장의 동일 품종에 대해서는 새로운 방류수산생물전염병검사신청서를 접수할 수 없다.<개정 2013.3.24>

⑥ 검사기관의 장은 제4항에 따른 확정진단 요청에 의해 방류수산생물의 전염병 검사의 처리기간을 연장한 때에는 검사신청자(또는 기관)에게 처리기간의 연장사유와 연장기간 등을 지체 없이 알려주어야 한다.<개정 2013.3.24>

⑦ 검사기관의 장은 제4항에 따른 확정진단을 요청할 경우 해당 양식장의 소유주가 확정진단 결과 통보 이전에 방류계획 물량을 임으로 폐기하거나 이동하지 않도록 필요한 조치를 하여야 하며, 관할 시장(특별자치도의 경우 특별자치도지사를 말한다. 이하 같다)․군수ㆍ구청장(자치구의 구청장을 말한다. 이하 같다)에게 통보하여 필요한 경우 방역에 필요한 조치를 할 수 있도록 하여야 한다.

제5조 (확정진단 등) ① 제4조제4항에 따른 확정진단 요청이 있을 경우 국립수산과학원장은 수산생물방역과장으로 하여금 수산동물전염병에 대한 확정진단을 실시하도록 하여야 한다.

② 제1항에 따른 확정진단에 필요한 처리기간은 검사시료가 도착한 날로부터 18일로 한다.

③ 수산생물방역과장은 제1항에 따른 확정진단 실시로 인해 다른 업무 수행에 지장을 초래할 우려가 있다고 판단되는 경우 처리기한을 조정할 수 있다.

④ 국립수산과학원장은 제1항에 따른 확정진단의 대상이 되는 양식장에서 사육중인 동일 품종에 대하여 다른 검사기관에서 요청한 검사증명서 발급을 확정진단 결과 이후까지 보류할 수 있으며, 이 경우 증명서 발급을 요청한 검사기관에게 보류사유 등을 지체 없이 알려주어야 한다.

⑤ 제1항에 따른 확정진단 결과 수산동물전염병에 감염된 것으로 판정될 경우 국립수산과학원장은 검사의뢰인 또는 해당 수산동물의 소유자 또는 관리자, 소재지를 관할하는 시장․군수ㆍ구청장에게 문서나 전산망을 통하여 즉시 통보하여야 한다.

제6조 (검사증명서의 발급 등) ① 검사기관의 장은 검사 의뢰를 접수한 날로부터 13일(갑각류의 경우에는 10일) 이내에 수산동물전염병의 검사 결과에 따라 국립수산과학원장에게 방류수산생물 전염병 검사 증명서의 발급을 요청하여야 한다.<개정 2013.3.24>

② 검사결과의 유효기간은 검사증명서 발급일로부터 15일로 하며, 15일이 경과하면 같은 양식장의 검사완료 물량이라도 전염병검사를 다시 실시하여야 한다.

③ 국립수산과학원장은 유효기간 내에 검사증명서 재발급 신청서가 접수될 경우 검사완료 물량 중 미방류 물량에 한하여 방류수산생물 전염병 검사 증명서를 재발급할 수 있다.<개정 2013.3.24>

제7조 (재검토기한) 「훈령‧예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」(대통령훈령 제248호)에 따라 이 예규는 발령 후의 법령이나 현실여건의 변화 등을 검토하여 이 예규를 폐지하거나 재검토기한을 재설정하여 개정하는 조치를 하여야 하는 기한은 2016년 4월 23일까지로 한다.<신설 2013.4.24>

부   칙(2010.6.7)

이 규정은 발령한 날부터 시행한다.

부   칙(2013.3.24)

이 규정은 발령한 날부터 시행한다.

부   칙(제84호, 2013.4.24)

이 규정은 발령한 날부터 시행한다.

(별표 1) 검사용 시료 처리방법

1. 시료 처리 방법

검사용 시료는 살아있는 상태로 운반되어야 하며, 시료의 채취 장소, 시료수, 채취 당시의 상태(사망/빈사) 등을 자세히 기술하여 시료에 부착하여야 한다.

2. 정밀검사 시료의 처리 방법

PCR 검사를 위한 시료는 검사용과 보관용으로 구분하여 확보한다. 검사용 시료는 항목별 검사 방법에서 권장하는 대로 pooling하고, 보관용 시료는 확정진단을 위하여 가능한 한 주요 장기별로 최대한 확보해 두는 것이 좋다. PCR 검사를 위하여 pooling한 시료(50마리의 경우 3〜5개의 E-tube)는 균질화 한 후 각각 4등분(1차검사용, 재검사용, 확정진단요청용, 검증용)하여 아래의 모식도에 따라 분석한다.

방 법	모식도
시료가 50마리일 경우 PCR 분석을 위해 3〜5개의 E-tube에 10〜15마리씩 pooling한다 (A, B, C, D, E).	A B C D E
각각의 E-tube에 들어있는 조직을 균질화한후 4등분한다. 즉 총 15〜20개의 E-tube를 만든다 (A-1～4/ B-1～4/ C-1～4/ D-1～4/ E-1～4).	A-1～4 B-1～4 C-1～4 D-1～4 E-1～4
A-1, B-1, C-1, D-1, E-1 tube의 시료에서 template를 추출한다 (TA-1, TB-1, TC-1, TD-1, TE-1).	A-1 B-1 C-1 D-1 E-1
각각의 template에 대해 PCR을 3반복으로 실시한다 (TA-1-1～ 3/ TB-1-1～3/ TC-1-1～3, TD-1-1～3/ TE-1-1～3).	TA-1-1～3 TB-1-1～3 TC-1-1～3 TD-1-1～3 TE-1-1～3

3. 정밀검사 결과에 따른 조치 사항

PCR 검사 결과 수산동물전염병의 감염이 의심될 경우, 재검사용 조직에서 한번 더 template를 추출해 동일한 방법으로 PCR (재검사)을 실시한다. 재검사에서도 동일한 결과가 나올 경우, 국립수산과학원 수산생물방역과로 확정진단을 요청하고 이때 1차검사와 재검사에서 확보한 DNA 시료와 확정진단용 조직을 함께 송부한다.

(별표 2) 잉어허피스바이러스병 (Koi herpesvirus disease, KHVD) 정밀검사법

가) 병원체 : Koi herpesvirus (KHV)

나) 임상증상

(1) 외부증상

- 평형상실, 피부퇴색, 발적, 피부지느러미 기저부 출혈, 지느러미 부식

(2) 해부학적 증상

- 아가미 1차 새변의 부식, 2차 새변의 융합, 1/2차 새변의 곤봉화

- 신장 또는 간 비대 및 점상 또는 국소출혈

(3) 병리조직학적 증상

- 아가미 조직의 염증 및 괴사, 아가미 상피세포 및 백혈구의 현저한 핵 비대화, 반지모양의 크로마틴, 옅은 호산성의 핵 내 봉입체

- 신장․비장․췌장․간․뇌․장․구강 상피의 염증 및 괴사, 핵내 봉입체

다) 정밀검사

(1) 시료 : 감염 조직 (아가미, 신장, 비장)

(2) PCR primer sets : protocol 1 & 2 모두 실시

- Protocol 1 : Bercovier TK primers 사용

- Protocol 2 : Gray Sph primers (Yuasa modification) 사용

		PCR primers	Product size
Protocol 1	TK Forward	5'-GGGTTACCTGTACGAG-3'	409bp
	TK Reverse	5'-CACCCAGTAGATTATGC-3'
Protocol 2	Forward	5'-GACACCACATCTGCAAGGAG-3'	292bp
	Reverse	5'-GACACATGTTACAATGGTCGC-3'

(3) PCR conditions

	PCR condition	Cycles
Protocol 1	94°C for 5min 94°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 1min 72°C for 10min	1 40 1
Protocol 2	94°C for 30s 94°C for 30s, 63°C for 30s, 72°C for 30s 72°C for 10min	1 40 1

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 KHV 임을 확인

(2) 결과판정 : KHV 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 3) 참돔이리도바이러스병 (Red sea bream iridoviral disease, RSIVD) 정밀검사법

가) 병원체 : Red sea bream iridovirus (RSIV), Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)

나) 임상증상

(1) 외부증상

- 심한 빈혈, 아가미 점상출혈

(2) 해부학적 증상

- 아가미 빈혈, 비장 비대

(3) 병리조직학적 변화

- 신장, 비장, 심장, 장에서 비정상적으로 비대된 세포 관찰

다) 정밀검사

(1) 시료 : 감염어의 비장을 포함한 조직 (신장, 비장)

(2) PCR primer sets : protocol 1 & 2 모두 실시

- Protocol 1 : amplify both RSIV and ISKNV DNA

- Protocol 2 : amplify only RSIV DNA

		PCR primers	Product size
Protocol 1	1-Forward	5'-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3'	570bp
	1-Reverse	5'-GCACCAACACATCTCCTATC-3'
Protocol 2	4-Forward	5'-CGGGGGCAATGACGACTACA-3'	568bp
	4-Reverse	5'-CCGCCTGTGCCTTTTCTGGA-3'

(3) PCR conditions

- [30 cycles]  94°C for 30s, 58°C for 1min, 72°C for 1min

- [1 cycle]    72°C for 5min

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 실시하여 RSIV임을 확인

(2) 결과판정 : RSIV 및 ISKNV 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 4) 잉어봄바이러스병 (Spring viraemia of carp, SVC) 정밀검사법

가) 병원체 : Spring viraemia of carp virus (SVCV)

나) 임상증상

(1) 외부증상

- 체색흑화, 평형감각 상실, 안구돌출, 아가미창백, 체표출혈, 지느러미 기저부 출혈, 복부팽만, 돌출된 항문에 배설물을 달고 다님

(2) 해부학적 증상

- 복수, 새판 변성, 장의 염증 및 출혈, 근육․지방조직․부레의 국소적 출혈

(3) 병리조직학적 증상

- 간의 부종성 염증 및 괴사, 심막염, 심막근의 국소변성 및 괴사, 비장 세망내피계의 증생 및 울혈, 췌장의 염증

다) 정밀검사

(1) 시료 : 세포배양 상층액 또는 감염조직 (신장, 비장, 뇌)

(2) PCR primer sets : Nested PCR 실시

		PCR primers	Product size
First	Forward 1	5'-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3'	714bp
	Reverse 2※	5'-AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY-3'
Nested	Forward 1	5'-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3'	606bp
	Reverse 4	5'-CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY-3'

※ Reverse transcription (RT) : Reverse 2 primer 사용

※ Mixed base codes : R(AG), Y(CT), M(AC), K(GT), S(GC), W(AT), H(ACT), B(GCT), V(AGC), D(AGT), N(AGCT)

(3) PCR conditions

- RT : 37°C for 1hr

- [35 cycles]  95°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 1min

- [1 cycle]    72°C for 10min

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 하여 SVCV 임을 확인

(2) 결과판정 : SVCV 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 5) 바이러스성출혈성패혈증 (Viral haemorrhagic septicaemia, VHS) 정밀검사법

가) 병원체 : Viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV)

나) 임상증상

(1) 외부증상

- 체색흑화, 안구돌출, 빈혈, 지느러미 기저부․아가미․눈․피부 및 복부 출혈

(2) 해부학적 증상

- 신장 변색, 간 빈혈, 체표․근육조직․내부장기의 점상출혈

(3) 병리조직학적 증상

- 세포질 내에 공포형성, 핵농축, 핵융해, 임파구 침윤

다) 정밀검사

(1) 시료 : 세포배양 상층액 또는 감염조직 (비장, 두신, 심장, 뇌)

(2) PCR primer sets

	PCR primers	Product size
VN Forward※	5'-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3'	505bp
VN Reverse	5'-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3'

※ Reverse transcription : VN Forward primer 사용

(3) PCR conditions

- Two step RT-PCR (reverse transcription → PCR amplication) 실시

	PCR condition	Cycles
Two-step RT-PCR	42°C for 30min, 94°C for 5min, 4°C for 3min (RT)	1
	94°C for 2min 94°C for 30s, 55°C for 30s, 68°C for 60s 68°C for 7min	1 35 1

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 통해 VHSV 임을 확인

(2) 결과판정 : VHSV 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 6) 유행성궤양증후군 (Epizootic ulcerative syndrome, EUS)

정밀검사법

가) 병원체 :  Aphanomyces invadans, Aphanomyces piscicida

나) 임상증상

(1) 외부증상

- 식욕저하, 체색 흑화, 체표에 붉은 반점이나 큰 궤양성 병변 발생

(2) 해부학적 증상

- 체표, 두부, 아가미 덮개, 미부에 붉은 점이 관찰되며 발병 후기에는   크고 붉거나 회색, 갈색의 궤양이 관찰

다) 정밀검사

(1) 시료 : 궤양병소 또는 붉은 반점 증상의 체표 근육

(2) GP Agar 배양 : 무증상 또는 붉은 반점 증상의 체표 근육 절취 및 접종

(3) PCR법 : 궤양병소의 균사 채취

a) PCR primer sets

		PCR primers	Product size
Protocol 1	Ainvad-2F	5'-TCATTGTGAGTGAAACGGTG-3'	234 bp
	Ainvad-ITSR1	5'-GGCTAAGGTTTCAGTATGTAG-3'
Protocol 2	ITS11	5'-GCCGAAGTTTCGCAAGAAAC-3'	550 bp
	ITS23	5'-CGTATAGACACAAGCACACCA-3'

b) PCR conditions

	PCR condition	Cycles
Protocol 1	95°C for 2 min 95°C for 30 s, 56°C for 45 s, 72°C for 2.5 min 72°C for 5 min	1 35 1
Protocol 2	94°C for 5 min 94°C for 30 s, 65°C for 30 s, 72°C for 1 min 72°C for 5 min	1 35 1

라) 확정진단

(1) 균사 형성 : GP Agar에 균사 형성시 PCR법으로 2차 확인

(1) 염기서열분석 : 염기서열분석을 통해 A.invadans 또는 A.piscicida임을 확인

(2) 결과판정 :  A.invadans 또는 A.piscicida 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 7) 타우라증후군 (Taura syndrome, TS) 정밀검사법

가) 병원체 : Taura syndrome virus (TSV)

나) 임상증상

(1) 급성기 (Acute phase)

- 빈사상태의 P. vannamei : 체색이 옅은 붉은색으로 변함

- 큐티클 상피 괴사 (×10 확대경)

- 일반적인 증상 : 껍질이 물러짐, 장관이 비어있고, 탈피동안 폐사

(2) 전이기 [Transition (recovery) phase]

- 큐티클에 불규칙적으로 다수의 멜라닌 침착 (haemocyte 축적된 것)

- 큐티클 상피에 haemocyte가 축적되어 melanised spots 형성

(3) 만성기 (Chronic phase)

- 전이기의 새우가 성공적으로 탈피하면 만성기로 이행

다) 정밀검사

(1) 시료

- Postlarvae, 치하, 성하 시료를 포함 (egg 및 larvae 단계는 부적합)

- 급성기 : 체표의 다소성 괴사 부위, 부속지, 아가미, 전장과 후장

(2) PCR primer sets

	PCR primers	Product size
9992Forward	5'-AAGTAGACAGCCGCGCTT-3'	231 bp
9195Reverse	5'-TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'

(3) PCR conditions

- Two step RT-PCR (reverse transcription → PCR amplication) 실시

	PCR condition	Cycles
Two-step RT-PCR	60°C for 30min, 94°C for 2min (RT)	1
	94°C for 1min 94°C for 45s, 60°C for 45s, 60°C for 45s 60°C for 7min	1 40 1

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 통해 TSV 임을 확인

(2) 결과판정 : TSV 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 8) 퍼킨수스감염증 (Infection with Perkinsus marinus) 정밀검사법

가) 병원체 : Perkinsus marinus

나) 임상증상

(1) 해부학적 증상

- 소화선이 창백해지고 조직이 얇고 엷어짐

(2) 병리조직학적 증상

- 장 상피 및 여러 기관의 결합조직에서 P. marinus cell이 관찰됨

- haemocyte 침윤과 식작용 관찰, 중감염시 장 상피가 완전히 파괴되기도 함

다) 정밀검사

(1) 시료 : 살아있거나 신선한 (freshly dead) 조직 (아가미, 맨틀)

(2) PCR primer sets : protocol 1 & 2 모두 실시

		PCR primers	Product size
Protocol 1	PerkITS-85	5`-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3`	703bp
	PerkITS-750	5`-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3`
Protocol 2	PmarITS-70F	5`-CCTTTGYTWGAGWGTTGCCAGATG-3`	509bp
	PmarITS600R	5`-CGAGTTTGCGAGTACCTGKAGAG-3`

(3) PCR conditions

	PCR condition	Cycles
Protocol 1	95°C for 4min 95°C for 1min, 55°C for 1min, 65°C for 3min 65°C for 5min	1 40 1
Protocol 2	95°C for 4min 94°C for 1min, 57°C for 1min, 65°C for 3min 65°C for 10min	1 40 1

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 통해 P. marinus 임을 확인

(2) 결과판정 : P. marinus 염기서열과 일치하면 양성으로 판정

(별표 9) 흰반점병 (White spot disease, WSD) 정밀검사법

가) 병원체 : White spot syndrome virus (WSSV)

나) 임상증상

- 외골격의 흰 점 (직경 3㎜, 가장 일반적인 임상증상)

- 체색의 변색 정도가 매우 심하며 붉거나 분홍색의 새우가 관찰

- 섭이 부진, 무기력, 양식장 가장자리의 물표면 유영

다) 정밀검사

(1) 시료 : pleopod (live juvenile 및 subadult), 두부를 제거한 postlarvae (PL11 up), whole (PL10), haemolymph

※ subadults & Juvenile (5마리씩 pooling) / PL 이하 (10마리씩 pooling)

(2) PCR primer sets : Nested PCR 실시

		PCR primers	Product size
First	146F1	5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3'	1447bp
	146R1	5'-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3'
Nested	146F2	5'-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3'	941bp
	146R2	5'-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3'

(3) Decopod-spectific primer : 추출한 DNA의 quality 확인을 위해 권장

		PCR primers	Product size
Decapod- specific	143F	5'-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3'	848bp
	145R	5'-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3'

(4) PCR conditions

- [1 cycle]    94°C for 4min, 55°C for 1min, 72°C for 2min

- [39 cycles]  94°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 2min

- [1 cycle]    72°C for 5min

라) 확정진단

(1) 염기서열분석 : PCR 산물의 염기서열분석을 통해 WSSV 임을 확인

(2) 결과판정 : WSSV 염기서열과 일하면 양성으로 판정

(별표 10) 방류수산생물 검사대상 전염병의 PCR 진단 조건

병명	구분		PCR primers (5‘→3’)	PCR condition	Cycles	Product size(bp)
KHV	Protocol 1	TKF	GGGTTACCTGTACGAG	94°C for 5min 94°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 1min 72°C for 10min	1 40 1	409
		TKR	CACCCAGTAGATTATGC
	Protocol 2	F	GACACCACATCTGCAAGGAG	94°C for 30s 94°C for 30s, 63°C for 30s, 72°C for 30s 72°C for 10min	1 40 1	292
		R	GACACATGTTACAATGGTCGC
RSIV	Protocol 1	1F	CTCAAACACTCTGGCTCATC	94°C for 30s, 58°C for 1min, 72°C for 1min 72°C for 5min	1 30	570
		1R	GCACCAACACATCTCCTATC
	Protocol 2	4F	CGGGGGCAATGACGACTACA	동일		568
		4R	CCGCCTGTGCCTTTTCTGGA
SVC	RT	R2	AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY	37°C for 1hr	1	714
	First	F1	TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC	95°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 1min 72°C for 10min	35 1
		R2	AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY
	Nested	F1	TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC	동일		606
		R4	CTGGGGTTTCCNCCTCAAAGYTGY
VHS	RT(VNF)		ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG	42°C for 30min, 94°C for 5min, 4°C for 3min	1	505
	VNF		ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG	94°C for 2min 94°C for 30s, 55°C for 30s, 68°C for 60s 68°C for 7min	1 35 1
	VNR		GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC
EUS	Protocol 1	Ainvad-2F	TCATTGTGAGTGAAACGGTG	95°C for 2 min 95°C for 30 s, 56°C for 45 s, 72°C for 2.5 min 72°C for 5 min	1 35 1	234
		Ainvad-ITSR1
	Protocol 2	ITS11	GGCTAAGGTTTCAGTATGTAG
		ITS23
TS	9992Forward		GCCGAAGTTTCGCAAGAAAC-	94°C for 5 min 94°C for 30 s, 65°C for 30 s, 72°C for 1 min 72°C for 5 min	1 35 1	550
	9195Reverse		CGTATAGACACAAGCACACCA
PM	Protocol 1	85	AAGTAGACAGCCGCGCTT	94°C for 1 min 94°C for 45 s, 60°C for 45 s, 60°C for 45 s 60°C for 7 min	1 40 1	231
		750	TCAATGAGAGCTTGGTCC
	Protocol 2	70F	CCTTTGYTWGAGWGTTGCCAGATG	95°C for 4min 94°C for 1min, 57°C for 1min, 65°C for 3min 65°C for 10min	1 40 1	509
		600R	CGAGTTTGCGAGTACCTGKAGAG
WSD	First	146F1	ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG	94°C for 4min, 55°C for 1min, 72°C for 2min 94°C for 1min, 55°C for 1min, 72°C for 2min 72°C for 5min	1 39 1	1447
		146R1	TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
	Nested	146F2	GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA	동일		941
		146R2	TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
	Decapod specific	143F	TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG	동일		848
		143R	TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC