〔별표 3〕

먹는물 수질감시항목 시험방법(제6조제3항 관련)

1. 우라늄-유도결합플라즈마-질량분석법

(Uranium-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 상수원수, 샘물 및 먹는물 중에 우라늄을 측정하는 방법으로, 시료를 플라즈마에 분사시켜 탈용매, 원자화 그리고 이온화하여 사중극자형으로 주입한 후 질량분석을 수행하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 상수원수, 샘물 및 먹는물 중 우라늄의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  유도결합플라즈마-질량분석기(ICP-MS)

3.1.1  검출기

이차전자증폭기(secondary electron multiplier)를 사용하며, 전자검출기를 사용할 경우 반드시 과량의 이온을 제거하기 위한 장치가 필요하다. 이로 인하여 증폭기의 감도 저하 내지 증폭기 손상이 발생할 수 있다.

3.1.2  라디오고주파발생기(RF generator)

라디오고주파(RF, radio frequency) 발생기는 출력범위 750 W ∼ 1,200 W 이상의 것을 사용하며, 이 때 사용하는 주파수는 27.12 MHz 또는 40.68 MHz를 사용한다.

3.1.3  시료 주입장치

3.1.3.1  분무기

일반적인 시료의 경우 동심축 분무기(concentric nebulizer) 또는 교차흐름 분무기(cross-flow nebulizer)를 사용하며, 점성이 있는 시료나 입자상 물질이 존재할 경우 바빙톤 분무기(barbington nebulizer)를 사용한다. 이외에도, 분석 목적에 따라 초음파 분무기(ultrasonic nebulizer) 등 다양한 형태의 분무기 사용이 가능하다.

3.1.3.2  아르곤 가스 공급장치

기체 또는 액체 아르곤으로서 99.99 % 이상의 순도를 갖는 것이어야 한다.

3.1.3.3  유량조절기

속도 조절이 가능한 연동펌프 및 아르곤 가스의 유량 조절기를 사용해야 한다.

3.1.4  인터페이스

3.1.4.1  샘플링 콘

0.8 mm ∼ 2.0 mm 범위의 구경을 가진 니켈 또는 백금 재질의 것을 사용한다.

3.1.4.2  스키머 콘

0.4 mm ∼ 1.2 mm 범위의 구경을 가진 니켈 또는 백금 재질의 것을 사용한다.

3.1.4.3  진공펌프

샘플링 콘 과 스키머 콘 사이 구간 내 진공상태를 1 torr ∼ 2 torr 이하로 유지할 수 있는 기계식 회전 펌프(rotary pump)와 질량분석기 내부 진공상태를 5 torr ∼ 7 torr 이하로 유지할 수 있는 터보분자 펌프(turbo molecular pump)를 사용한다.

3.1.5  질량분석기

3.1.5.1  일반적으로 사중극자(quadrapole)질량분석기를 사용하며, 이 외에도 비행시간(time- of-flight)분석기, 자기섹터(magnetic sector)분석기 등이 사용가능하다.

3.1.5.2  질량분석기의 질량측정 범위는 5 amu ∼ 250 amu이며, 최소 분해능은 5 % 피크 높이에서 1 amu이어야 한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  질산

진한 질산(nitric acid, HNO3, 65 % ∼ 70 %)으로서 Ultrapure급 이상이며, 바탕실험시 기기검출한계 이하이어야 한다.

4.2  표준용액

4.2.1  우라늄 표준원액(100 mg/L)

시판하는 우라늄 표준용액을 사용하여 표준원액으로 한다.

4.2.2  우라늄 표준용액(1.0 mg/L)

우라늄 표준원액 및 질산을 각각 1 mL씩 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 표선까지 정제수로 묽혀 사용한다.

5.0  시료채취 및 관리

미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병을 사용하여, 취수펌프를 10분 이상 가동시키거나 취수정에 고여 있는 물을 배수하여 새로 유입된 물을 채취하여 신속히 시험한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내에서 바탕시료를 포함하여 4개 이상의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 20 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0001 mg/L ∼ 0.0300 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 20 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계의 1배 ～ 2배 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 80 % ～ 120 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편자(RSD)로 계산하며 측정값이 20 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 20 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소 및 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료의 탁도가 1 NTU 이상일 경우 미세입자 및 부유물을 제거한다.

7.1.2  시료를 부피플라스크에 넣고 질산을 1 % 되게 가한 후 표선까지 채운다.

7.2  검정곡선의 작성

우라늄 표준용액(1 mg/L)을 100 mL 부피플라스크 각각에 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 mL를 단계적으로 정확히 취하여 넣고, 질산을 포함한 정제수로 묽혀 표선을 채운 다음 7.3과 같은 방법으로 측정하여 우라늄의 농도와 강도와의 관계를 구하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

시험용액을 ICP-MS에 주입하여 분석하고 7.2에서 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 우라늄의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 200.8, 1994, Determination of Trace Elements in Waters and Wastes by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

9.2  Standard Method 3125, 2005, Metals inductively coupled plasma/mass spectrometry

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.0001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 20 % 상대표준편차가 ± 20 % 이내 80 % ～ 120 % 상대편차백분율이 ± 20 % 이내

표 2.  유도결합플라즈마-질량분석법의 실험조건(예)

항 목	조 건
플라즈마유속(plasma flow) 플라즈마전력(plasma forward power) 보조기체유속(auxiliary flow) 분사유속(nebulizer flow) 용액 흡수유속(solution uptake rate) 분사방온도(spray chamber temperature) 검출기모드(detector mode) 반복적분수(replicate integrations) 질량범위(mass range) 체류시간(dwell time) 스캔수(number of scan sweeps)	18.5 L/min 1.20 kW 0.6 L/min 0.98 L/min 0.6 mL/min 15 ℃ Pulse 3 8 amu ∼ 240 amu 320 us 85

표 3.  유도결합플라즈마-질량분석법에 의한 측정질량

금속종류	화학식	측정질량(m/z)
우라늄	U	2381, 235

1 우선선택이온

2. 안티몬-유도결합플라즈마-원자발광분광법

(Antimony-Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 안티몬을 측정하는 방법으로, 시료를 고주파 유도코일에 의하여 형성된 아르곤 플라즈마에 주입하여 6,000 ℃ ∼ 8,000 ℃에서 들뜬 원자가 바닥상태로 이동할 때 방출하는 발광선 및 발광광도를 측정하여 원소의 정성 및 정량분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 안티몬 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  유도결합플라즈마-원자발광광도계

3.1.1  분광계

검출 및 측정 방법에 따라 다색화분광기 또는 단색화 장치 모두 사용가능해야 하며 스펙트럼의 띠 통과(band pass)는 0.05 nm 미만이어야 한다.

3.1.2  시료 주입 장치

3.1.2.1  분무기

일반적인 시료의 경우 동심축 분무기(concentric nebulizer) 또는 교차흐름 분무기(cross-flow nebulizer)를 사용하며, 점성이 있는 시료나 입자상 물질이 존재할 경우 바빙톤 분무기(barbington nebulizer)를 사용한다. 이외에도, 분석 목적에 따라 초음파 분무기(ultrasonic nebulizer) 등 다양한 형태의 분무기 사용이 가능하다.

3.1.2.2  아르곤 가스 공급장치

기체 또는 액체 아르곤으로서 99.99 % 이상의 순도를 갖는 것이어야 한다.

3.1.2.3  유량조절기

속도 조절이 가능한 연동펌프 및 아르곤 및 플라스마 기체의 유량 조절기를 사용해야 한다.

3.1.3  유도결합플라즈마 발생기

3.1.3.1  라디오 고주파 발생기(RF generator)

라디오고주파(RF, radio frequency) 발생기는 출력범위 750 W ∼ 1,200 W 이상의 것을 사용하며, 이 때 사용하는 주파수는 27.12 MHz 또는 40.68 MHz를 사용한다.

3.1.3.2  토치

내부직경 18 mm, 12 mm, 1.5 mm인 3개의 동심원 또는 동등한 규격의 석영관을 사용한다. 가장 바깥쪽관의 냉각기체, 중심관과 중간관의 운반기체와 보조기체로는 아르곤을 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  질산

진한 질산(nitric acid, HNO3, 분자량 : 63.01, 65 % ∼ 70 %)으로서 Ultrapure급 이상이며, 바탕실험시 기기검출한계 이하이어야 한다.

4.1.3  염산

진한 염산(hydrochloric acid, HCl, 분자량 : 36.46, 36.5 % ∼ 38 %)으로서 Ultrapure급 이상이며, 바탕실험시 기기검출한계 이하이어야 한다.

4.2  표준용액

4.2.1  안티몬 표준원액(1,000 mg/L)

안티몬 분말 1.000 g을 정확하게 달아 질산(1 + 1) 20.0 mL와 염산 10.0 mL를 넣어 녹이고, 정제수 100 mL와 주석산(tartaric acid, C4H6O6, 분자량 : 150.09) 1.50 g을 가하여 서서히 녹인 후 정제수를 넣어 1 L로 한다. 또는 시판용 안티몬 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  안티몬 표준용액(10 mg/L)

안티몬 표준원액(1,000 mg/L) 1.0 mL를 100 mL 부피플라스크에 넣고 표준원액과 같은 양의 산을 넣어 정제수로 표선까지 채운다.

5.0  시료채취 및 관리

미리 질산 및 증류수로 씻은 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리테트라플루오르에틸렌 용기에 시료를 채취하여 신속히 시험한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내에서 바탕시료를 포함하여 4개 이상의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 20 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.012 mg/L ∼ 0.020 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 20 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계의 1배 ～ 2배 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 80 % ～ 120 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편자(RSD)로 계산하며 측정값이 20 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 20 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소 및 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 500 mL를 600 mL 비커에 취하고 시계접시로 덮는다.

7.1.2  질산 2 mL를 넣은 다음 액량이 약 50 mL가 될 때까지 가열농축한다.

7.1.3  식힌 후 100 mL 부피플라스크에 옮기고 정제수로 표선까지 채운다.

7.2  검정곡선의 작성

안티몬 표준용액을 단계적으로 부피플라스크에 넣고 각각에 정제수를 넣어 100 mL로 한다. 측정한 안티몬 농도와 측정값으로부터 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

7.3.1  시료를 플라즈마에 주입하여 각각의 스펙트럼선 강도를 측정한다.

7.3.2  시험용액을 ICP-AES에 주입하여 분석하고 7.2에서 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 안티몬의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  환경부, 수질오염공정시험기준(2011,6), ES 04400.3 금속류-유도결합플라스마-원자발광분광법

9.2  US EPA Method 200.7, 1994, Determination of Trace Elements in Waters and Wastes by Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry

9.3  Standard Method 3120, 2005, Metals by plasma emission spectroscopy

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.002 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 20 % 상대표준편차가 ± 20 % 이내 80 % ～ 120 % 상대편차백분율이 ± 20 % 이내

표 2.  유도결합플라즈마-원자발광분광법에 의한 측정파장

금속종류	화학식	측정파장(nm)
안티몬	Sb	206.831, 217.58

1 우선선택파장

3. 안티몬-유도결합플라즈마-질량분석법

(Antimony-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 안티몬을 측정하는 방법으로, 시료를 플라즈마에 분사시켜 탈용매, 원자화 그리고 이온화하여 사중극자형으로 주입한 후 질량분석을 수행하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 안티몬 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  유도결합플라즈마-질량분석기(ICP-MS)

3.1.1  검출기

이차전자증폭기(secondary electron multiplier)를 사용하며, 전자검출기를 사용할 경우 반드시 과량의 이온을 제거하기 위한 장치가 필요하다. 이로 인하여 증폭기의 감도 저하 내지 증폭기 손상이 발생할 수 있다.

3.1.2  라디오고주파발생기(RF generator)

라디오고주파(RF, radio frequency) 발생기는 출력범위 750 W ∼ 1,200 W 이상의 것을 사용하며, 이 때 사용하는 주파수는 27.12 MHz 또는 40.68 MHz를 사용한다.

3.1.3  시료 주입장치

3.1.3.1  분무기

일반적인 시료의 경우 동심축 분무기(concentric nebulizer) 또는 교차흐름 분무기(cross-flow nebulizer)를 사용하며, 점성이 있는 시료나 입자상 물질이 존재할 경우 바빙톤 분무기(barbington nebulizer)를 사용한다. 이외에도, 분석 목적에 따라 초음파 분무기(ultrasonic nebulizer) 등 다양한 형태의 분무기 사용이 가능하다.

3.1.3.2  아르곤 가스 공급장치

기체 또는 액체 아르곤으로서 99.99 % 이상의 순도를 갖는 것이어야 한다.

3.1.3.3  유량조절기

속도 조절이 가능한 연동펌프 및 아르곤 가스의 유량 조절기를 사용해야 한다.

3.1.4  인터페이스

3.1.4.1  샘플링 콘

0.8 mm ∼ 2.0 mm 범위의 구경을 가진 니켈 또는 백금 재질의 것을 사용한다.

3.1.4.2  스키머 콘

0.4 mm ∼ 1.2 mm 범위의 구경을 가진 니켈 또는 백금 재질의 것을 사용한다.

3.1.4.3  진공펌프

샘플링 콘 과 스키머 콘 사이 구간 내 진공상태를 1 torr ∼ 2 torr 이하로 유지할 수 있는 기계식 회전 펌프(rotary pump)와 질량분석기 내부 진공상태를 5 torr ∼ 7 torr 이하로 유지할 수 있는 터보분자 펌프(turbo molecular pump)를 사용한다.

3.1.5  질량분석기

3.1.5.1  일반적으로 사중극자(quadrapole)질량분석기를 사용하며, 이 외에도 비행시간(time- of-flight)분석기, 자기섹터(magnetic sector)분석기 등이 사용가능하다.

3.1.5.2  질량분석기의 질량측정 범위는 5 amu ∼ 250 amu이며, 최소 분해능은 5 % 피크 높이에서 1 amu이어야 한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  질산

진한 질산(nitric acid, HNO3, 분자량 : 63.01, 65 % ∼ 70 %)으로서 Ultrapure급 이상이며, 바탕실험시 기기검출한계 이하이어야 한다.

4.1.3  염산

진한 염산(hydrochloric acid, HCl, 분자량 : 36.46, 36.5 % ∼ 38 %)으로서 Ultrapure급 이상이며, 바탕실험시 기기검출한계 이하이어야 한다.

4.2  표준용액

4.2.1  안티몬 표준원액(1,000 mg/L)

안티몬 분말 1.000 g을 정확하게 달아 질산(1 + 1) 20.0 mL와 염산 10.0 mL를 넣어 녹이고, 정제수 100 mL와 주석산(tartaric acid, C4H6O6, 분자량 : 150.09) 1.50 g을 가하여 서서히 녹인 후 정제수를 넣어 1 L로 한다. 또는 시판용 안티몬 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  안티몬 표준용액(1.0 mg/L)

안티몬 표준원액(1,000 mg/L) 0.1 mL를 100 mL 부피플라스크에 넣고 표준원액과 같은 양의 산을 넣어 정제수로 표선까지 채운다.

5.0  시료채취 및 관리

미리 질산 및 증류수로 씻은 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 폴리테트라플루오르에틸렌 용기에 시료를 채취하여 신속히 시험한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내에서 바탕시료를 포함하여 4개 이상의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 20 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0005 mg/L ∼ 0.020 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 20 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계의 1배 ～ 2배 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 80 % ～ 120 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편자(RSD)로 계산하며 측정값이 20 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 20 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소 및 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

시료를 부피플라스크에 넣고 질산을 1 % 되게 가한 후 표선까지 채운다.

7.2  검정곡선의 작성

안티몬 표준용액(1.0 mg/L)을 100 mL 부피플라스크 각각에 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mL를 단계적으로 정확히 취하여 넣고, 질산을 포함한 정제수로 묽혀 표선을 채운 다음 7.3과 같은 방법으로 시험하여 안티몬의 농도와 강도와의 관계를 구하여 검정곡선을 작성한다. 다만, 이때 산 농도는 1 % HNO3로 한다.

7.3  측정법

시험용액을 ICP-MS에 주입하여 측정질량 123에서 분석하고 7.2에서 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 안티몬의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  환경부, 수질오염공정시험기준(2011,6), ES 04400.4 금속류-유도결합플라스마-질량분석법

9.2  US EPA Method 200.8, 1994, Determination of Trace Elements in Waters and Wastes by Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

9.3  Standard Method 3125, 2005, Metals inductively coupled plasma/mass spectrometry

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.00005 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 20 % 상대표준편차가 ± 20 % 이내 80 ～ 120 % 상대편차백분율이 ± 20 % 이내

표 2.  유도결합플라즈마-질량분석법의 실험조건(예)

항 목	조 건
플라즈마유속(plasma flow) 플라즈마전력(plasma forward power) 보조기체유속(auxiliary flow) 분사유속(nebulizer flow) 용액 흡수유속(solution uptake rate) 분사방온도(spray chamber temperature) 검출기모드(detector mode) 반복적분수(replicate integrations) 질량범위(mass range) 체류시간(dwell time) 스캔수(number of scan sweeps)	18.5 L/min 1.20 kW 0.6 L/min 0.98 L/min 0.6 mL/min 15 ℃ Pulse 3 8 amu ∼ 240 amu 320 us 85

표 3.  유도결합플라즈마-질량분석법에 의한 측정질량

금속종류	화학식	측정질량(m/z)
안티몬	Sb	1231, 121

1 우선선택이온

4. 퍼클로레이트-이온크로마토그래피

(Perchlorate-Ion Chromatography)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 미량유해물질인 퍼클로레이트를 전도도 검출기(conductivity detector)가 장착된 이온크로마토그래프(ion chromatograph, IC)를 이용하여 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 퍼클로레이트 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  이온크로마토그래프

3.1.1  이온크로마토그래프 컬럼은 alkanol quaternary ammonium 작용기를 포함한 다공성 비드로 채워진 것으로 직경이 2 mm ～ 4 mm, 길이가 250 mm인 음이온 교환 컬럼 또는 동등한 분리성능을 가진 컬럼으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 사용한다.

3.1.2  이온크로마토그래프 컬럼에서 용리된 각 성분이 검출기에 들어가기 전에 용리액 자체의 전도도를 감소시키고 목적성분의 전도도를 증가시켜 높은 감도로 음이온을 분석하기 위해 제거장치(서프레서)를 사용한다. 고용량의 양이온 교환수지를 충전시킨 컬럼형과 양이온 교환막으로 구성된 격막형의 서프레서를 사용할 수 있다.

3.1.3  음이온 분석에 주로 사용되는 전기전도도 검출기 또는 질량분석기를 사용한다.

3.1.4  용리액은 50 mM의 수산화나트륨 수용액을 사용하며 유량은 1 mL/min ～ 2 mL/min로 조작하여 사용한다.

3.1.5  농축 컬럼을 사용하는 경우, 크립탠드(cryptand) 구조의 다공성 비드로 채워진 직경 4 mm, 길이 35 mm인 컬럼 또는 동등한 농축 성능을 가진 컬럼으로 시료 중 미량으로 존재하는 퍼클로레이트의 농축 능력이 양호한 것을 택하여 사용한다. 이때 용리액은 용리액 발생기(eluent generator)를 이용하여 0.5, 65, 100 mM 수산화나트륨 수용액을 발생시켜 사용하며 유량은 0.25 mL/min로 조작하여 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  용리액

진한 수산화나트륨용액을 정제수로 희석하여 50 mM 수산화나트륨 용리액을 조제한다. 수산화나트륨으로 조제할 경우 탄산이온이 용존되어 방해 작용을 일으키므로 가급적 진한 수산화나트륨용액을 사용하는 것이 바람직하다. 50 mM 수산화나트륨 용리액은 50 % 수산화나트륨용액 8.0 g을 정제수에 녹여 2 L로 한다. 농축 컬럼을 사용하는 경우에는 용리액 발생기에 나트륨 카트리지를 설치하여 0.5, 65, 100 mM 수산화나트륨 수용액을 발생시켜 용리액으로 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  퍼클로레이트 표준원액(1,000 mg/L)

100 mL 부피플라스크에 과염소산나트륨(sodium perchlorate, NaClO4, 분자량 : 122.44) 0.1231 g을 정확히 취하여 넣고 정제수를 넣어 100 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 퍼클로레이트 1 mg을 함유하고 있으며 12개월 이내에 사용하도록 한다. 또는 시판용 퍼클로레이트 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  퍼클로레이트 표준용액(1 mg/L)

퍼클로레이트 표준원액(1,000 mg/L) 0.1 mL를 정확히 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 정제수를 넣어 전량 100 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 퍼클로레이트 0.001 mg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

시료는 미리 정제수로 씻은 유리병이나 플라스틱병을 이용해 채취하고, 6 ℃ 이하에서 보관한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.002 mg/L ∼ 0.015 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계의 1배 ～ 2배 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편자(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료와 표준용액을 냉장고에서 꺼내어 상온에서 방치한다.

7.1.2  시료의 간섭영향을 전기전도도로 측정하여 간섭이온(염소이온, 황산이온, 탄산이온)의 영향을 확인한다.

7.1.3  시료는 공극이 0.45 μm인 여지를 사용하여 여과한다.

7.1.4  전기전도도를 측정하여 간섭이온의 농도가 높을 경우, -Ba → -Ag → -H 순으로 카트리지를 사용하여 간섭이온(황산이온, 염소이온, 탄산이온)을 제거한다. 카트리지로 여과할 때에는 미리 정제수 약 10 mL로 카트리지를 여과 후 시료를 여과한다. 이때 처음의 약 6 mL는 버린 후 여과액을 시료로 사용한다.

7.1.5  농축 컬럼을 이용하는 경우, 매질에 포함된 황산, 염소, 탄산이온 등의 간섭 물질은 시료 주입 루프에 장착된 농축 컬럼을 통해 제거된다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  퍼클로레이트 표준용액(1 mg/L) 0.2 mL ～ 1.5 mL를 단계적으로 수 개의 100 mL 부피플라스크에 넣고 정제수로 전량 100 mL로 한다.

7.2.2  퍼클로레이트의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 퍼클로레이트의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

[주 1]  피크의 면적 대신 피크의 높이를 사용할 수 있으나 피크 면적을 사용하는 것이 바람직하다.

7.3  측정법

7.3.1  여과된 시료 1.0 mL ～ 2.0 mL를 이온크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  이온크로마토그래프로부터 얻은 크로마토그램에서 퍼클로레이트의 머무름 시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크의 면적을 구하여 검정곡선에 따라 시료의 농도를 계산한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA, Method 314.0, 1999, Determination of perchlorate in drinking water using ion chromatography

9.2  US EPA, Method 314.1, 2005, Determination of perchlorate in drinking water using inline column concentration/matrix elimination ion chromatography with suppressed conductivity detection

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.002 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  퍼클로레이트의 이온크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
Column	가드컬럼 (2 mm x 50 mm), 분석컬럼 (2 mm x 250 mm)
Sample loop	Cryptand C1 농축 컬럼 시료 2.0 mL를 농축 컬럼에 주입 후, 10 mM NaOH 1 mL를 이용해 용출
Eluent	0 - 12 min: 0.50 mM NaOH 12 - 25 min: 65 mM NaOH 25 - 30 min: 100 mM NaOH
Flow rate	0.25 mL/min
Back pressure	2350 psi
Suppressor	ASRS UltraII, 2 mm 외부시료 주입모드, 100 mA
Detector	Suppressed conductivity detector Background conductivity: 1.0 μS

그림 1. 퍼클로레이트의 IC 크로마토그램(예)

5. 휘발성유기화합물-퍼지․트랩-기체크로마토그래피

(Volatile Organic Compounds-PurgeㆍTrap-Gas Chromatography)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 휘발성유기화합물을 측정하는 방법으로, 시료 중에 휘발성유기화합물을 불활성기체로 퍼지시켜 기상으로 추출한 다음 트랩관으로 흡착․농축하고, 가열․탈착시켜 기체크로마토그래프로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 염화비닐, 스티렌, 클로로에탄, 브로모포름의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  퍼지․트랩 장치

3.1.1  퍼지장치는 5 mL 또는 25 mL 용량의 것을 사용한다.

3.1.2  트랩은 길이 25 cm 정도, 직경 2.5 mm 이상의 것으로 트랩의 처음에 메틸실리콘을 1 cm 정도 채운다. 이어서 2,6-디페닐옥사이드폴리머, 실리카겔 및 야자활성탄을 각각 ⅓씩 충전한다. 다만, 디클로로디플루오르메탄을 검사하지 아니할 경우에는 야자활성탄을 제외하고, 2,6-디페닐옥사이드폴리머를 ⅔로 증량한다. 이 트랩은 처음 사용하기 전에 180 ℃에서 불활성가스로 20 mL/분 이상의 유속으로 역세정한다. 이 때 트랩에서 배출되는 가스는 분석분리관에 들어가지 아니하도록 장치 밖으로 배출시킨다. 또한 매일 사용하기 전에 180 ℃에서 10분간 불활성가스로 역세정한다.

3.1.3  탈착장치에서 트랩은 탈착가스가 흐르기 전후에 신속히 180 ℃까지 가열할 수 있어야 하며, 트랩의 폴리머 부분이 200 ℃ 이상 가열되어서는 안 된다.

3.2  기체크로마토그래프(검출기 : FID, ECD, ELCD, PID)

3.2.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.2 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.2.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 120 ℃ ～ 250 ℃, 컬럼온도는 30 ℃ ～ 250 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.2.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 증류수를 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  묽은염산(1 + 1)

염산(hydrochloric acid, HCl, 분자량 : 36.46)과 정제수를 같은 양으로 혼합한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  인산(1 + 10)

정제수 100 mL에 인산(phosphoric acid, H3PO4, 분자량 : 98.00) 10 mL를 넣어 혼합한다.

4.1.4  황산(1 + 5)

정제수 50 mL에 황산(sulfuric acid, H2SO4, 분자량 : 98.08) 10 mL를 넣어 혼합한다.

4.1.5  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.6  아비산나트륨용액

아비산나트륨(sodium arsenite, NaAsO2, 분자량 : 129.91) 0.5 g을 정제수에 녹여 100 mL로 한다.

4.1.7  티오황산나트륨

티오황산나트륨․5수화물(sodium thiosulfate pentahydrate, Na2S2O3․5H2O, 분자량 : 248.18)은 순도 98 % 이상의 분석용 시약을 사용한다.

4.1.8  아스코르빈산

아스코르빈산(ascorbic acid, C6H8O6, 분자량 : 176.12)은 순도 98 % 이상의 분석용 시약을 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  휘발성유기화합물 표준원액

염화비닐, 스티렌, 클로로에탄 및 브로모포름은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다. 미리 희석하여 판매되는 표준원액(0.1 mg/mL ～ 1 mg/mL)을 사용하거나 각 물질별 표준원액을 다음과 같이 조제한다.

4.2.1.1  10 mL 부피플라스크에 메탄올 9.8 mL를 넣고 마개를 연 상태에서 부피플라스크의 표면에 묻은 알코올이 마를 때까지 약 10분간 방치한 다음 0.1 mg 단위까지 무게를 잰다.

4.2.1.2  각각의 부피플라스크에 위의 표준물질을 취하여 플라스크의 내벽에 닿지 아니하도록 조심하면서 직접 2 방울 ～ 3 방울을 넣는다.

4.2.1.3  다시 무게를 잰다. 이어서 메탄올로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다.

4.2.1.4  각각의 표준물질의 첨가량을 구하여 표준원액의 농도(μg/mL)를 구한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 ℃ 이하)에서 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.2.2  휘발성유기화합물 표준용액

25 mL 부피플라스크에 염화비닐, 스티렌, 클로로에탄 및 브로모포름이 각각 25 μg에 상당하는 표준원액을 넣고 메탄올로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다. 이 용액은 될 수 있는대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고에 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.3  내부표준용액

플루오르벤젠과 1,2-디클로로벤젠-d4를 표준원액 및 표준용액의 조제방법과 동일하게 조제한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  잔류염소를 제거하기 위해 유리병에 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 25 mg 정도를 넣고 시료를 공간이 없도록 약 40 mL를 채취하고 공기가 들어가지 않도록 주의하여 밀봉한다. 모든 시료를 중복으로 채취한다.

5.2  염산(1 + 1) 또는 인산(1 + 10) 또는 황산(1 + 5)을 1 방울/10 mL로 가하여 약 pH 2로 조절하고 4 ℃ 냉암소에서 보관한다. 특히 시료 중 방향족 탄화수소(예로서 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 등)는 쉽게 미생물에 의해 분해되므로 일주일 이상 보관할 경우는 산 처리한다.

5.3  모든 시료는 채취 후 14일 이내에 분석해야 한다.

5.4  시료에 염산을 가하였을 때에 거품이 생기면 그 시료는 버리고 산을 가하지 않은 채로 두 개의 시료를 채취한다. 산을 가하지 않은 시료는 24시간 이내에 분석해야 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 mg/L ∼ 0.1 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  분석

7.1.1  시료주입 및 퍼지

퍼지가스를 40 mL/분의 유속으로 조정한다. 퍼지장치에 트랩을 부착하고 퍼지장치의 시린지밸브를 연다. 시료의 온도를 실온과 같게 한다. 시료 25 mL를 부피플라스크에 취하고, 이어서 내부표준용액 25 μL를 넣은 다음 마개를 하고 잘 흔들어 섞는다(이 용액은 1시간 이내에 사용한다). 이 용액 5 mL를 취하여 퍼지용기에 주입하고 퍼지장치의 시린지밸브를 닫는다. 실온에서 11분 동안 퍼지한다.

7.1.2  탈착

크리오제닉이 부착되지 아니한 경우, 퍼지․트랩장치를 탈착모드로 놓고 탈착가스를 통과시키지 아니하면서 트랩을 180 ℃로 예열한다. 이어서 탈착가스를 15 mL/분의 유속으로 4분 동안 통과시킨다. 이때 기체크로마토그래프의 승온조작을 작동시킨다.

크리오제닉이 부착된 경우, 퍼지․트랩시스템을 탈착모드로 놓고 크리오제닉이 -150 ℃ 이하인지 확인한다. 불활성가스를 4 mL/분의 유속으로 약 5분 동안 역세정하는 동안 트랩을 180 ℃로 급속히 가열한다. 이어서 크리오제닉트랩을 250 ℃로 급속히 가열한다. 동시에 기체크로마토그래프의 승온조작을 작동시킨다.

7.1.3  퍼지용기의 세척

퍼지용기 중의 시료를 제거하고 정제수로 2회 씻는다. 퍼지용기를 비우고 시린지밸브를 연 상태로 불활성가스를 통과시켜 환기시킨다.

7.1.4  트랩재조정

탈착한 후 퍼지․트랩장치를 퍼지모드로 놓는다. 15초 동안 기다린 다음 퍼지용기의 시린지밸브를 닫아 불활성가스가 트랩을 통과하도록 하고 트랩을 180 ℃로 가열한다. 약 7분후 트랩의 가열기를 끄고 퍼지용기의 시린지 밸브를 열어 불활성가스가 트랩을 통과하지 아니하도록 한다.

7.1.5  확인 및 정량

시료의 크로마토그램 피크와 표준물질 피크의 검출시간을 비교하거나 질량분석에서 얻어진 각 물질의 질량스펙트럼을 비교하여 동일물질로 확인되면 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 각 성분의 양을 구하여 시료 중의 휘발성유기화합물의 농도를 측정한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  휘발성유기화합물 표준용액 50 μL ～ 500 μL를 단계적으로 물 25 mL에 넣고, 각각의 내부표준용액 25 μL를 넣고 3회 세게 흔들어 섞는다(이 용액은 1시간 이내에 사용한다). 이 용액 5 mL를 취하여 7.1과 같은 방법으로 시험한다.

7.2.2  휘발성유기화합물 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 501.1, 1979, The analysis of trihalomethanes in drinking water by the purge and trap method

9.2  US EPA Method 502.1, 1989, Volatile halogenated organic compounds in water by purge and trap gas chromatography

9.3  US EPA Method 503.1, 1989, Volatile aromatic and unsaturated organic compounds in water by purge and trap gas chromatography

9.4  환경부, 먹는물수질공정시험기준(2011, 1), ES 05601.2a 휘발성유기화합물-퍼지․트랩-기체크로마토그래피

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.001 mg/L ∼ 0.002 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  휘발성유기화합물의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 검출기 온도 검출기 오븐 온도	Ultra-2, VOCOL, DB-624, DB-5 (모세관의 길이가 25 m 이상의 것) 헬륨 또는 질소 1/10 200 ℃ 250 ℃ FID, ECD, ELCD, PID 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 35 7 5.0 50 0 10.0 150 0

6. 휘발성유기화합물-퍼지․트랩-기체크로마토그래프-질량분석법

(Volatile Organic Compounds-PurgeㆍTrap-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 휘발성유기화합물을 측정하는 방법으로, 시료 중에 휘발성유기화합물을 불활성기체로 퍼지시켜 기상으로 추출한 다음 트랩관으로 흡착․농축하고, 가열․탈착시켜 기체크로마토그래프-질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 염화비닐, 스티렌, 클로로에탄, 브로모포름의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  퍼지․트랩 장치

3.1.1  퍼지장치는 5 mL 또는 25 mL 용량의 것을 사용한다.

3.1.2  트랩은 길이 25 cm 정도, 직경 2.5 mm 이상의 것으로 트랩의 처음에 메틸실리콘을 1 cm 정도 채운다. 이어서 2,6-디페닐옥사이드폴리머, 실리카겔 및 야자활성탄을 각각 ⅓씩 충전한다. 다만, 디클로로디플루오르메탄을 검사하지 아니할 경우에는 야자활성탄을 제외하고, 2,6-디페닐옥사이드폴리머를 ⅔로 증량한다. 이 트랩은 처음 사용하기 전에 180 ℃에서 불활성가스로 20 mL/분 이상의 유속으로 역세정한다. 이 때 트랩에서 배출되는 가스는 분석분리관에 들어가지 아니하도록 장치 밖으로 배출시킨다. 또한 매일 사용하기 전에 180 ℃에서 10분간 불활성가스로 역세정한다.

3.1.3  탈착장치에서 트랩은 탈착가스가 흐르기 전후에 신속히 180 ℃까지 가열할 수 있어야 하며, 트랩의 폴리머 부분이 200 ℃ 이상 가열되어서는 안 된다.

3.2  기체크로마토그래프

3.2.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.2 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.2.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 120 ℃ ～ 250 ℃, 컬럼온도는 30 ℃ ～ 250 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.2.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.3  질량분석기(mass spectrometer)

3.3.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며, 이온화에너지는 35 eV ∼ 70 eV를 사용한다.

3.3.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등을 사용한다.

3.3.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 증류수를 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  염산(1 + 1)

염산(hydrochloric acid, HCl, 분자량 : 36.46)과 정제수를 같은 양으로 혼합한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  인산(1 + 10)

정제수 100 mL에 인산(phosphoric acid, H3PO4, 분자량 : 98.00) 10 mL를 넣어 혼합한다.

4.1.4  황산(1 + 5)

정제수 50 mL에 황산(sulfuric acid, H2SO4, 분자량 : 98.08) 10 mL를 넣어 혼합한다.

4.1.5  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.6  아비산나트륨용액

아비산나트륨(sodium arsenite, NaAsO2, 분자량 : 129.91) 0.5 g을 정제수에 녹여 100 mL로 한다.

4.1.7  티오황산나트륨

티오황산나트륨․5수화물(sodium thiosulfate pentahydrate, Na2S2O3․5H2O, 분자량 : 248.18)은 순도 98 % 이상의 분석용 시약을 사용한다.

4.1.8  아스코르빈산

아스코르빈산(ascorbic acid, C6H8O6, 분자량 : 176.12)은 순도 98 % 이상의 분석용 시약을 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  휘발성유기화합물 표준원액

염화비닐, 스티렌, 클로로에탄 및 브로모포름은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다. 미리 희석하여 판매되는 표준원액(0.1 mg/mL ～ 1 mg/mL)을 사용하거나 각 물질별 표준원액을 다음과 같이 조제한다.

4.2.1.1  10 mL 부피플라스크에 메탄올 9.8 mL를 넣고 마개를 연 상태에서 부피플라스크의 표면에 묻은 알코올이 마를 때까지 약 10분간 방치한 다음 0.1 mg 단위까지 무게를 잰다.

4.2.1.2  각각의 부피플라스크에 위의 표준물질을 취하여 플라스크의 내벽에 닿지 아니하도록 조심하면서 직접 2 방울 ～ 3 방울을 넣는다.

4.2.1.3  다시 무게를 잰다. 이어서 메탄올로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다.

4.2.1.4  각각의 표준물질의 첨가량을 구하여 표준원액의 농도(μg/mL)를 구한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 ℃ 이하)에서 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.2.2  휘발성유기화합물 표준용액

25 mL 부피플라스크에 염화비닐, 스티렌, 클로로에탄 및 브로모포름이 각각 25 μg에 상당하는 표준원액을 넣고 메탄올로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다. 이 용액은 될 수 있는대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고에 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.3  내부표준용액

플루오르벤젠과 1,2-디클로로벤젠-d4를 표준원액 및 표준용액의 조제방법과 동일하게 조제한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  잔류염소를 제거하기 위해 유리병에 아스코르빈산(ascorbic acid) 또는 티오황산나트륨(sodium thiosulfate) 25 mg 정도를 넣고 시료를 공간이 없도록 약 40 mL를 채취하고 공기가 들어가지 않도록 주의하여 밀봉한다. 모든 시료를 중복으로 채취한다.

5.2  염산(1 + 1) 또는 인산(1 + 10) 또는 황산(1 + 5)을 1 방울/10 mL로 가하여 약 pH 2로 조절하고 4 ℃ 냉암소에서 보관한다. 특히 시료 중 방향족 탄화수소(예로서 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠 등)는 쉽게 미생물에 의해 분해되므로 일주일 이상 보관할 경우는 산 처리한다.

5.3  모든 시료는 채취 후 14일 이내에 분석해야 한다.

5.4  시료에 염산을 가하였을 때에 거품이 생기면 그 시료는 버리고 산을 가하지 않은 채로 두 개의 시료를 채취한다. 산을 가하지 않은 시료는 24시간 이내에 분석해야 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 mg/L ∼ 0.1 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  분석

7.1.1  시료주입 및 퍼지

퍼지가스를 40 mL/분의 유속으로 조정한다. 퍼지장치에 트랩을 부착하고 퍼지장치의 시린지밸브를 연다. 시료의 온도를 실온과 같게 한다. 시료 25 mL를 부피플라스크에 취하고, 이어서 내부표준용액 25 μL를 넣은 다음 마개를 하고 잘 흔들어 섞는다(이 용액은 1시간 이내에 사용한다). 이 용액 5 mL를 취하여 퍼지용기에 주입하고 퍼지장치의 시린지밸브를 닫는다. 실온에서 11분 동안 퍼지한다.

7.1.2  탈착

크리오제닉이 부착되지 아니한 경우, 퍼지․트랩장치를 탈착모드로 놓고 탈착가스를 통과시키지 아니하면서 트랩을 180 ℃로 예열한다. 이어서 탈착가스를 15 mL/분의 유속으로 4분 동안 통과시킨다. 이때 기체크로마토그래프의 승온조작을 작동시킨다.

크리오제닉이 부착된 경우, 퍼지․트랩시스템을 탈착모드로 놓고 크리오제닉이 -150 ℃ 이하인지 확인한다. 불활성가스를 4 mL/분의 유속으로 약 5분 동안 역세정하는 동안 트랩을 180 ℃로 급속히 가열한다. 이어서 크리오제닉트랩을 250 ℃로 급속히 가열한다. 동시에 기체크로마토그래프의 승온조작을 작동시킨다.

7.1.3  퍼지용기의 세척

퍼지용기 중의 시료를 제거하고 정제수로 2회 씻는다. 퍼지용기를 비우고 시린지밸브를 연 상태로 불활성가스를 통과시켜 환기시킨다.

7.1.4  트랩재조정

탈착한 후 퍼지․트랩장치를 퍼지모드로 놓는다. 15초 동안 기다린 다음 퍼지용기의 시린지밸브를 닫아 불활성가스가 트랩을 통과하도록 하고 트랩을 180 ℃로 가열한다. 약 7분후 트랩의 가열기를 끄고 퍼지용기의 시린지 밸브를 열어 불활성가스가 트랩을 통과하지 아니하도록 한다.

7.1.5  확인 및 정량

시료의 크로마토그램 피크와 표준물질 피크의 검출시간을 비교하거나 질량분석에서 얻어진 각 물질의 질량스펙트럼을 비교하여 동일물질로 확인되면 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 각 성분의 양을 구하여 시료 중의 휘발성유기화합물의 농도를 측정한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  휘발성유기화합물 표준용액 25 μL ～ 500 μL를 단계적으로 물 25 mL에 넣고, 각각의 내부표준용액 25 μL를 넣고 3회 세게 흔들어 섞는다(이 용액은 1시간 이내에 사용한다). 이 용액 5 mL를 취하여 7.1과 같은 방법으로 시험한다.

7.2.2  휘발성유기화합물 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 501.1, 1979, The analysis of trihalomethanes in drinking water by the purge and trap method

9.2  US EPA Method 502.1, 1989, Volatile halogenated organic compounds in water by purge and trap gas chromatography

9.3  US EPA Method 503.1, 1989, Volatile aromatic and unsaturated organic compounds in water by purge and trap gas chromatography

9.4  환경부, 먹는물수질공정시험기준(2012, 7), ES 05601.1b 휘발성유기화합물-퍼지․트랩-기체크로마토그래프-질량분석법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  휘발성유기화합물의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2, VOCOL, DB-624, DB-5 (모세관의 길이가 25 m 이상의 것) 헬륨 1/10 200 ℃ 250 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 35 7 5.0 50 0 10.0 150 0

표 3.  휘발성유기화합물의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
플루오르벤젠 1,2-디클로로벤젠-d4 염화비닐 스티렌 클로로에탄 브로모포름	96 150 62 104 64 250	96 152 62 104 64 173	77 115, 150 64 51, 78, 103 66 171, 175

7. 페놀류-기체크로마토그래프-전자포획검출법

(Phenols-Gas Chromatograph-Electron Capture Detector)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 페놀류의 측정방법으로서, 시료의 pH를 조정한 후 디클로로메탄으로 추출하고 펜타플루오르벤질브로마이드로 유도체화하고 실리카겔을 이용하여 정제과정을 거친 후 기체크로마토그래프로 분리한 다음 전자포획검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 클로로페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 및 펜타클로로페놀의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  전자포획검출기

3.3  구테루나 다니쉬 농축기

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 증류수를 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  헥산

헥산(hexane, C6H14, 분자량 : 86.17)은 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.5  톨루엔/헥산(75/25)

톨루엔(toluene, C7H8, 분자량 : 92.14) 75 mL와 헥산 25 mL를 합한다.

4.1.6  2-프로판올/톨루엔(15/85)

2-프로판올(2-propanol, C3H8O, 분자량 : 60.10) 15 mL와 톨루엔 85 mL를 합한다.

4.1.7  무수황산나트륨

무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)은 순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하룻밤 건조시키거나 400 ℃에서 4시간 건조시켜서 사용한다.

4.1.8  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.45)

4.1.9  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.1.10  탄산칼륨(potassium carbonate, K2CO3, 분자량 : 138.21)

4.1.11  유도체시약

50 mL 부피플라스크에 펜타플루오르벤질브로마이드(Pentafluorobenzyl bromide, C7H2BrF5, 분자량 : 260.99) 1 mL와 18-크라운-6-에테르(18-crown-6-ether, C12H24O6, 분자량 : 264.32) 1 g을 넣고 2-프로판올로 표선까지 채운다. 갈색병에 넣고 냉장고에 보존한다. 1주일 이내에 사용한다.

4.2  표준용액

클로로페놀(o, m, p), 2,4-디클로로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 및 펜타클로로페놀은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다.

4.2.1  페놀류 표준원액(1,000 mg/L)

각 표준물질 10 mg을 메탄올에 녹여 10 mL로 한다. 갈색병에 넣고 냉장고에 보존한다.

4.2.2  페놀류 표준용액(10 mg/L)

페놀류 표준원액(1,000 mg/L) 250 μL를 취하여 25 mL 갈색의 부피플라스크에 넣고 메탄올로 채운 다음 냉장고에 보존한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 시료를 채취하며 채취 전에 시료로서 세척하지 말아야 한다.

5.2  유리병에 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거하고 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다. 다만, 4시간 이내에 시험하지 못할 때에는 시료 1 L에 대하여 황산동(5수염) 1 g과 인산을 넣어 pH를 약 4로 하고, 냉암소에 보존하여 24시간 이내에 시험한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성 한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0001 mg/L ∼ 0.2 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  추출

7.1.1.1  시료 200 mL를 250 mL 분액깔때기에 취하고 인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5(혹은 pH 2.0)로 조정한 다음 염화나트륨 10 g을 넣은 후 디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 세게 흔들어 추출한다.

7.1.1.2  디클로로메탄층을 시험관에 옮기고 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 2500 rpm으로 5분간 원심분리하여 추출액을 다른 시험관에 옮긴다.

7.1.1.3  추출액을 구테루나 다니쉬 농축기로 1 mL까지 농축한다.

7.1.2  유도체화 및 정제

7.1.2.1  7.1.1.3의 농축액 1 mL에 유도체시약 1 mL와 탄산칼륨 3 mg을 넣어 80 ℃ 가열기에서 4시간 동안 반응시킨 다음 상온으로 식힌 후 10 mL의 헥산을 넣어 흔들어 주고 여기에 물 3 mL를 넣어 다시 흔든다.

7.1.2.2  용매층을 취하여 다음과 같이 정제한다.

7.1.2.3  내경 10 mm의 분리관에 실리카겔 4 g을 채우고 그 위에 무수황산나트륨 약 2 g을 채운 다음 6 mL의 헥산을 흘려주고 잠시 공기 중에 방치하여 실리카겔을 활성화시킨다. 유도체화된 시료 2 mL를 먼저 통과시킨 후 헥산 10 mL를 통과시키고 유출액은 버린다. 이어서 톨루엔/헥산 (75/25) 10 mL와 2-프로판올/톨루엔(15/85) 10 mL를 통과시켜 페놀류를 용출한다.

7.1.2.4  위의 모든 용출액을 합하여 구테루나 다니쉬 농축기로 1 mL까지 농축하여 시험용액으로 한다. 시험용액 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프-전자포획검출기로 분석한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  페놀류 표준용액(10 mg/L) 0.2 mL ～ 5.0 mL를 단계적으로 100 mL 부피플라스크에 넣고 각각에 메탄올을 넣어 100 mL로 한 다음 시린지로 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입한다.

7.2.2  페놀류 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 604, 1991, Phenols.

9.2  US EPA Method 625, 1991, Bases/neutrals and acids

9.3  Standard Methods 6420C, 2005, Liquid-Liquid Extraction Gas Chromatographic/Mass Spectrometric Method

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.0001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  페놀류의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 또는 질소 250 ℃ 300 ℃ 각각의 표준물질이 최적조건으로 분리되도록 승온조작

8. 페놀류-기체크로마토그래프-질량분석법

(Phenols-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 페놀류의 측정방법으로서, 시료의 pH를 조정한 후 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 기체크로마토그래프로 분리한 다음 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 클로로페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 및 펜타클로로페놀의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 µm ～ 0.50 µm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  구테루나 다니쉬 농축기

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 증류수를 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨

무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)은 순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하룻밤 건조시키거나 400 ℃에서 4시간 건조시켜서 사용한다.

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.45)

4.1.6  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.2  표준용액

클로로페놀(o, m, p), 2,4-디클로로페놀, 2,4,6-트리클로로페놀 및 펜타클로로페놀은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다.

4.2.1  페놀류 표준원액(1,000 mg/L)

각 표준물질 10 mg을 메탄올에 녹여 10 mL로 한다. 갈색병에 넣고 냉장고에 보존한다.

4.2.2  페놀류 표준용액(10 mg/L)

페놀류 표준원액(1,000 mg/L) 250 μL를 취하여 25 mL 갈색의 부피플라스크에 넣고 메탄올로 채운 다음 냉장고에 보존한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 시료를 채취하며 채취 전에 시료로서 세척하지 말아야 한다.

5.2  유리병에 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거하고 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다. 다만, 4시간 이내에 시험하지 못할 때에는 시료 1 L에 대하여 황산동(5수염) 1 g과 인산을 넣어 pH를 약 4로 하고, 냉암소에 보존하여 24시간 이내에 시험한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0001 mg/L ∼ 0.2 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 200 mL를 250 mL 분액깔때기에 취하고 인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5(혹은 pH 2.0)로 조정한 다음 염화나트륨 10 g을 넣은 후 디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 세게 흔들어 추출한다.

7.1.2  디클로로메탄층을 시험관에 옮기고 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 흔들어 섞은 다음 2500 rpm으로 5분간 원심분리하여 추출액을 다른 시험관에 옮긴다.

7.1.3  추출액을 구테루나 다니쉬 농축기로 200 μL까지 농축하여 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  페놀류 표준용액(10 mg/L) 0.2 mL ～ 5.0 mL를 단계적으로 100 mL 부피플라스크에 넣고 각각에 메탄올을 넣어 100 mL로 한 다음 시린지로 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입한다.

7.2.2  페놀류 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 604, 1991, Phenols.

9.2  US EPA Method 625, 1991, Bases/neutrals and acids

9.3  Standard Methods 6420C, 2005, Liquid-Liquid Extraction Gas Chromatographic/Mass Spectrometric Method

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.0001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  페놀류의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/20 250 ℃ 300 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 0 15.0 230 0 5.0 260 3.0 10.0 310 3.0

표 3.  페놀류의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온, m/z	제2선택이온, m/z
클로로페놀 2,4-디클로로페놀 2,4,6-트리클로로페놀 펜타클로로페놀	128 162 196 264	128 162 196 266	130, 64 164, 63 198, 97 165, 268

9. 프탈레이트와 아디페이트-기체크로마토그래프-질량분석법

(Phthalate & Adipate-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 프탈레이트와 아디페이트의 측정방법으로서, 시료 중 비스에틸헥실프탈레이트, 비스에틸헥실아디페이트를 n-헥산으로 추출하여 농축한 후 기체크로마토그래프로 분리한 다음 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 비스에틸헥실프탈레이트와 비스에틸헥실아디페이트의 검사에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  구테루나 다니쉬 농축기

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  n-헥산

n-헥산(hexane, C6H14, 분자량 : 86.17)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨

무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 142.04)은 순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하룻밤 건조시키거나 400 ℃에서 4시간 건조시켜서 사용한다.

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.45)

4.2  표준용액

비스에틸헥실프탈레이트 및 비스에틸헥실아디페이트는 표준시약 또는 특급이상의 것을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다.

4.2.1  프탈레이트와 아디페이트 표준원액(1,000 mg/L)

각 표준물질 10 mg을 메탄올에 녹여 10 mL로 한다. 냉장고에 보존한다.

4.2.2  프탈레이트와 아디페이트 표준용액(10 mg/L)

프탈레이트와 아디페이트 표준원액(1,000 mg/L) 250 μL를 취하여 25 mL 갈색의 부피플라스크에 넣고 잘 혼합한 다음 메탄올로 채운 후 냉장고에 보존한다.

4.3  내부표준용액(100 mg/L)

훌루오란센-d10 10 mg을 취하여 메탄올 10 mL에 녹인다. 이 용액을 메탄올로 10배 희석한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병과 TFE 재질의 마개를 사용하여 시료를 채취하고, 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거한 후 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다.

5.2  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 채취 후 7일 이내에 추출하고 40일 이내에 분석해야한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 mg/L ∼ 0.4 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  프탈레이트와 아디페이트 전처리에 사용하는 모든 초자류는 400 ℃에서 3시간 이상 구워서 사용한다.

7.1.2  시료 200 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣은 다음 내부표준용액 20 μL를 넣고 잘 혼합한다.

7.1.3  염화나트륨 10 g을 넣은 후 잘 녹인다.

7.1.4  n-헥산 10 mL를 넣고 10분간 세게 흔들어 추출한다.

7.1.5  n-헥산층을 시험관에 옮기고 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 흔들어 수분을 제거한 다음 2500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 추출용액만을 다른 시험관에 옮긴다.

7.1.6  추출액을 구테루나 다니쉬 농축기로 1 mL까지 농축시킨 다음 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  프탈레이트와 아디페이트 표준용액(10 mg/L)을 단계적으로 20 μL ～ 400 μL 취하여 200 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 채운 다음 7.3과 같은 방법으로 시험한다.

7.2.2  프탈레이트와 아디페이트의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

시험용액 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프-질량분석기에 주입한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 506, 1990, Determination of phthalate and adipate esters in drinking water by liquid-liquid extraction or liquid-solid extraction and gas chromatography with photoionization detection

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  프탈레이트와 아디페이트의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/20 250 ℃ 300 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 0 15.0 230 0 5.0 260 3.0 10.0 310 3.0

표 3.  프탈레이트와 아디페이트의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
비스에틸헥실프탈레이트 비스에틸헥실아디페이트	390.54 370.58	149 129	167, 57 149, 57

10. 벤조(a)피렌-고성능액체크로마토그래프-형광광도법

(Benzo(a)pyrene-High Performance Liquid Chromatograph-Fluorometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 다환방향족 탄화수소류의 측정방법으로서, 시료 중 벤조(a)피렌을 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 액체크로마토그래프로 분리하여 형광검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 벤조(a)피렌의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  고성능액체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 2.1 mm ∼ 4.6 mm, 길이 10 cm ∼ 25 cm의 스테인레스관에 옥타데실실릴기(ODS)를 화학결합시킨 실리카겔(입경 5 μm)을 충전한 것 또는 이와 동등의 분리능을 갖는 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  고성능액체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  원심분리기

2500 rpm 이상 가능한 것을 사용한다.

3.3  구테루나 다니쉬 농축기

3.4  혼합기

Vortex mix 또는 이와 동등한 기구를 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨

무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 142.04)은 순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하룻밤 건조시키거나 400 ℃에서 4시간 건조시켜서 사용한다.

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)

4.1.6  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.2  표준용액

4.2.1  벤조(a)피렌 표준원액(1,000 mg/L)

미리 희석하여 판매되는 표준원액(1 mg/mL)을 사용하거나 벤조(a)피렌 10 mg을 메탄올 10 mL에 녹인다.

4.2.2  벤조(a)피렌 표준용액(1 mg/L)

벤조(a)피렌 표준원액(1,000 mg/L) 100 μL를 100 mL 부피플라스크에 취하고 메탄올로 표선까지 채운다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 시료를 채취하며 채취 전에 시료로서 세척하지 말아야 한다.

5.2  유리병에 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거하고 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다.

5.3  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 채취 후 7일 이내에 추출하고 40일 이내에 분석해야한다.

5.4  벤조(a)피렌은 빛에 약하므로 모든 표준물질이나 추출물질은 황갈색이나 호일로서 싼 후에 보관한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.01 μg/L ∼ 0.7 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료를 200 mL 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣는다.

7.1.2  인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5 정도로 맞춘다.

7.1.3  염화나트륨 10 g을 넣은 후 잘 녹인다.

7.1.4  디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 격렬히 흔든다.

7.1.5  층분리가 완전히 될 때까지 기다린 후 아래층의 디클로로메탄 용액을 시험관에 옮긴다.

7.1.6  이 추출용액에 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 섞어 수분을 제거한다.

7.1.7  2500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 추출액을 구테루나 다니쉬 농축기에 옮기고 1 mL까지 농축시켜 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  벤조(a)피렌 표준용액(1 mg/L) 200 μL ～ 5 mL 씩을 단계적으로 수개의 100 mL 부피플라스크에 넣고 각각에 메탄올로 전량 100 mL로 하여 7.3과 같은 방법으로 시험한다.

7.2.2  벤조(a)피렌의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

시험용액 1 μL ～ 10 μL를 액체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 실시하고 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 벤조(a)피렌의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 550, 1990, Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in drinking water by liquid-liquid extraction and HPLC With coupled ultraviolet and fluorescence detection

9.2  Standard Method 6410, 2005, Extractable base/neutrals and acids

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.00001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  벤조(a)피렌의 액체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 이동상 파장	ODS C18 (길이가 10 cm 이상의 것으로 옥타데실실란과 같이 비극성물질로 이루어진 것 또는 유사한 종류의 것) 아세토나이트릴 : 물 = 8 : 2 들뜸파장(Exitation Wavelength) : 280 nm 방출파장(Emission Wavelength) : >389 nm

11. 벤조(a)피렌-기체크로마토그래프-질량분석법

(Benzo(a)pyrene-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 다환방향족 탄화수소류의 측정방법으로서, 시료 중 벤조(a)피렌을 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 기체크로마토그래프로 분리하여 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 벤조(a)피렌의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  원심분리기

2500 rpm 이상 가능한 것을 사용한다.

3.4  구테루나 다니쉬 농축기

3.5  혼합기

Vortex mix 또는 이와 동등한 기구를 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨

무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 142.04)은 순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하룻밤 건조시키거나 400 ℃에서 4시간 건조시켜서 사용한다.

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)

4.1.6  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.2  표준용액

4.2.1  벤조(a)피렌 표준원액(1,000 mg/L)

미리 희석하여 판매되는 표준원액(1 mg/mL)을 사용하거나 벤조(a)피렌 10 mg을 메탄올 10 mL에 녹인다.

4.2.2  벤조(a)피렌 표준용액(1 mg/L)

벤조(a)피렌 표준원액(1,000 mg/L) 100 μL를 100 mL 부피플라스크에 취하고 메탄올로 표선까지 채운다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 시료를 채취하며 채취 전에 시료로서 세척하지 말아야 한다.

5.2  유리병에 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거하고 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다.

5.3  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 채취 후 7일 이내에 추출하고 40일 이내에 분석해야한다.

5.4  벤조(a)피렌은 빛에 약하므로 모든 표준물질이나 추출물질은 황갈색이나 호일로서 싼 후에 보관한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.01 μg/L ∼ 0.7 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료를 200 mL 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣는다.

7.1.2  인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5 정도로 맞춘다.

7.1.3  염화나트륨 10 g을 넣은 후 잘 녹인다.

7.1.4  디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 격렬히 흔든다.

7.1.5  층분리가 완전히 될 때까지 기다린 후 아래층의 디클로로메탄 용액을 시험관에 옮긴다.

7.1.6  이 추출용액에 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 섞어 수분을 제거한다.

7.1.7  2500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 추출액을 구테루나 다니쉬 농축기에 옮기고 1 mL까지 농축시켜 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  벤조(a)피렌 표준용액(1 mg/L) 200 μL ～ 5 mL 씩을 단계적으로 수개의 100 mL 부피플라스크에 넣고 각각에 메탄올로 전량 100 mL로 하여 7.3과 같은 방법으로 시험한다.

7.2.2  벤조(a)피렌의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

시험용액 1 μL ～ 10 μL를 기체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 실시하고 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 벤조(a)피렌의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 550, 1990, Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in drinking water by liquid-liquid extraction and HPLC With coupled ultraviolet and fluorescence detection

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도 현장이중시료	0.00001 mg/L 결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 25 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 % ～ 125 % 상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  벤조(a)피렌의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/20 250 ℃ 300 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 0 15.0 230 0 5.0 260 3.0 10.0 310 3.0

표 3.  벤조(a)피렌의 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
벤조(a)피렌	252	252	126, 251

12. 마이크로시스틴-액체크로마토그래프-텐덤질량분석법

(Microcystins-High Performance Liquid Chromatograph-tandem Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 마이크로시스틴의 측정방법으로서, 먹는물 중에 마이크로시스틴을 고상추출하여 고성능액체크로마토그래프로 분리한 다음 텐덤 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 마이크로시스틴-LR, -YR, -RR, -LA 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  고성능액체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 2.1 mm ∼ 4.6 mm, 길이 10 cm ∼ 15 cm의 스테인레스관에 옥타데실실릴기(ODS)를 화학결합시킨 실리카겔(입경 5 μm)을 충전한 것 또는 이와 동등의 분리능을 갖는 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  이동상은 10 mM 아세트산암모늄과 0.1 % 개미산을 혼합한 용액과 아세토나이트릴을 사용하고 유속은 0.3 mL/min ∼ 0.8 mL/min으로 사용한다.

3.1.3  고성능액체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기

3.2.1  이온화 방식은 전자분무이온화법(ESI, electrospray ionization)을 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 tandem quadrupole 형태의 MS/MS 또는 동등 성능 이상의 시스템을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 MRM (multiple reaction monitoring)을 이용하는 것이 바람직하며, 선택하는 이온들은 표 4의 이온을 사용할 수 있다.

3.2.4  질량분석기의 조건은 표 3과 같이 수행할 수 있다.

3.3  초음파분쇄기

남조류 군체와 세포를 파쇄하여 조체로부터 마이크로시스틴을 추출할 수 있는 성능을 가진 것을 사용한다.

3.4  현미경

3.5  여과지

GF/C(직경 47 mm, 공극 1.2 μm)를 사용한다.

3.6  고상 카트리지

옥타데실기를 화학결합시킨 실리카겔(C18) 또는 동등이상의 성능을 갖고 있는 것으로 500 mg ∼ 10 g 채운 것을 사용한다.

3.7  건조기

일정한 온도를 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.8  원심분리기

3.9  진공농축기

3.10  SPE 추출장치

일반적으로 SPE 추출에 사용하는 매뉴얼 타입의 매니폴드(manifold)를 사용하거나, 자동화된 SPE 추출기 또는 LC/MS/MS에 on-line SPE 시스템을 장착하여 사용 할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

액체크로마토그래프용 정제수를 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

액체크로마토그래프용 시약을 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올 20 %

정제수 80 mL와 메탄올 20 mL를 섞는다.

4.1.4  아세트산용액 5 %

정제수 950 mL와 아세트산(acetic acid, C2H4O2, 분자량 : 60.05) 50 mL를 섞는다.

4.1.5  TFA/메탄올용액 0.1 %

트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA, C2HF3O2, 분자량 : 114.02) 100 μL를 정확히 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올을 넣어 전량 100 mL로 한다.

4.1.6  아세트산암모늄 10 mM + 개미산 0.1 %

아세트산암모늄(ammonium acetate, C2H7NO2, 분자량 : 77.08) 0.3854 g을 정제수에 녹이고, 개미산(formic acid, CH2O2, 분자량 : 46.02) 500 μL를 넣어 전량 500 mL로 한다. 사용할 때 만든다. 이동상으로 사용하기 전 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 1]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.1.7  아세토나이트릴(acetonitrile, C2H3N, 분자량 : 41.05)

액체크로마토그래프용 시약을 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다. 이동상으로 사용하기 전 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 2]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L)

마이크로시스틴-LR (microcystin-LR, C49H74N10O12, 분자량 : 995.17), 마이크로시스틴-YR (microcystin-YR, C52H72N10O13, 분자량 : 1045.29), 마이크로시스틴-RR (microcystin-RR, C49H75N13O12, 분자량 : 1038.20), 마이크로시스틴-LA (microcystin-LA, C46H67N7O12, 분자량 : 910.07) 각각 200 μg을 정확히 취하여 메탄올 1000 μL에 용해시킨다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 200 μg 함유한다.

4.2.2  마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L)

200 mL 부피플라스크에 마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L) 1 mL를 넣고 메탄올을 넣어 200 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 1 μg 함유한다.

4.3  내부표준용액

4.3.1  내부표준물질원액(200 mg/L)

그라미시딘-S (gramicidin-S, C60H92N12O10, 분자량 : 1141.45) 200 μg을 정확히 취하여 메탄올 1000 μL에 용해시킨다. 이 용액 1 mL는 그라미시딘-S 200 μg을 함유한다.

4.3.2  내부표준물질용액(1 mg/L)

200 mL 부피플라스크에 내부표준물질원액(200 mg/L) 1 mL를 넣고 메탄올을 넣어 200 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 그라미시딘-S 1 μg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  모든 시료는 시료채취 즉시 차갑고 어두운 상태로 보관되어 운반한다.

5.2  24시간 이내에 분석하지 못하는 경우 0 ℃ ∼ 4 ℃에서 냉장보관 한다.

5.3  농축된 시료를 즉시 분석할 수 없는 경우, -5 ℃ 이하에서 냉동보관 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리·측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.1 μg/L ∼ 1.0 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성 한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ∼ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  상수원수

7.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구하고자 할 경우

7.1.1.1.1  40 ℃의 건조기에서 GF/C 여지를 건조시키고 데시케이터에 식힌 후 일정한 양(c)의 시료를 여과한다.

7.1.1.1.2  여과한 여지는 7.1.1.1.3에 따라, 여과한 여과액은 7.1.1.2.5에 따른다.

7.1.1.1.3  여과한 여지는 건조기를 이용하여 건조시킨다. 이 때, 건조기는 50 ℃ 이하로 유지하도록 한다.

7.1.1.1.4  건조시킨 여지를 데시케이터에서 식힌 후 작은 조각으로 자른다. 그리고 5 % 아세트산용액 20 mL 넣고 초음파분쇄기로 파쇄한다. 파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

[주 3]  여지를 자를 때 가위나 장갑에 의해 오염되지 않도록 주의한다.

7.1.1.1.5  파쇄가 끝난 시료는 원심분리기(2000 rpm, 10분)를 이용하여 분리한 후 상등액을 취한다.

7.1.1.1.6  다시 5 % 아세트산용액 20 mL를 넣고 원심분리 후 상등액을 취하고 이와 같은 과정을 반복하여 최종 100 mL가 되도록 한다.

7.1.1.1.7  최종액 100 mL에 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 시료에 첨가한다.

7.1.1.1.8  이하 추출은 7.1.1.2.6에 따른다.

7.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구하고자 할 경우

7.1.1.2.1  시료 일정량을 바이알에 분취하여 초음파분쇄기에 넣고 얼음 또는 차가운 물로 중탕하면서 조체를 파쇄 시킨다.

7.1.1.2.2  파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

7.1.1.2.3  파쇄가 끝난 후 현미경으로 세포의 완전 파쇄를 확인한다. 완전 파쇄가 이루어지지 않은 경우 파쇄 과정을 반복한다.

7.1.1.2.4  조체가 모두 파쇄된 시료를 GF/C 여지를 사용하여 여과한다.

7.1.1.2.5  여과한 시료 100 mL를 취하고, 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 시료에 첨가한다.

7.1.1.2.6  고상 카트리지를 활성화시키기 위해 메탄올 10 mL를 흘려준다. 활성화된 카트리지에 정제수 10 mL를 통과시켜 메탄올이 완전히 제거되도록 한다.

7.1.1.2.7  활성화된 고상 카트리지가 건조되기 전에 7.1.1.2.5의 시료를 카트리지에 10 mL/min 이하의 속도로 흘려준다.

7.1.1.2.8  20 % 메탄올 5 mL를 통과시켜 고상 카트리지의 불순물을 제거한다.

7.1.1.2.9  0.1 % TFA/메탄올용액 5 mL를 천천히 통과시켜 고상 카트리지 내에 흡착되어 있는 마이크로시스틴을 용출시켜 작은 유리수기에 받는다.

7.1.1.2.10  최종 용출용매 5 mL를 진공농축기 또는 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨다.

7.1.1.2.11  최종액이 200 μL ∼ 1,000 μL가 되도록 메탄올로 건조된 마이크로시스틴을 용해시킨다. 이 때 메탄올을 3번에 나누어 분주하면서 벽에 묻은 마이크로시스틴이 모두 녹을 수 있도록 한다.

7.1.1.2.12  마이크로시스틴을 용해시킨 최종액을 시험용액으로 한다.

7.1.2  정수

7.1.2.1  시료 1 L ∼ 5 L에 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 첨가한다.

7.1.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 90 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L) 0, 10, 20, 40, 80, 100 μL를 단계적으로 취하여 정제수로 표선까지 채운다. 이후 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 첨가한다. 제조한 검정곡선용 표준용액의 농도는 마이크로시스틴 각각 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 μg/L이다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 양과 농도는 달리 할 수 있다.

[주 4]  시료분석결과 이 검정곡선 농도범위를 벗어나면 시료를 묽혀서 재분석하여야 한다.

7.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2.3  마이크로시스틴 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

7.3.1  추출액 100 μL를 취하여 액체크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  크로마토그램으로부터 얻은 각 분석성분 및 내부표준물질의 피크면적을 측정하여 분석성분의 피크면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 구한다.

8.0  결과보고

8.1  계산

8.1.1  내부표준물질법

8.1.1.1  상수원수

8.1.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 2)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 1)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 3)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 2)

여기서, Cc : (식 1)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 3)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a}]                               (식 3)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 4)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2  절대검정곡선법

8.1.2.1  상수원수

8.1.2.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 6)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 5)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 7)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 6)

여기서, Cc : (식 5)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 7)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a}]                               (식 7)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 8)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.2  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  WHO, 1999, Toxic Cyanobacteria in Water : A guide to their public health consequences, monitoring and management, Chapter 13. Laboratory analysis of cyanotoxins

9.2  환경부, 조류예보제 운영 매뉴얼(2008), 제3장 마이크로시스틴 분석방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.1 μg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  마이크로시스틴의 고성능액체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목

조 건

컬럼

ODS C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 μm)

컬럼 온도

40 ℃

이동상

A : 10 mM Ammonium acetate + 0.1 % Formic acid

B : Acetonitrile

Time	이동상 A	이동상 B
1	95	5
2	70	30
6	10	90
8	10	90
8.1	95	5
14	95	5

유속

0.8 mL/min

주입량

100 μL

표 3.  마이크로시스틴의 텐덤 질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
Source	ESI (electrospray ionization)
Ion mode	Positive
Capillary voltage (V)	4000
Nebulizer (psi)	50
Drying gas temp. (℃)	200
Drying gas flowrate (L/min)	6
Sheath gas temp. (℃)	360
Sheath gas flowrate (L/min)	11
Collision energy (V)	10 ～ 80
Fragmentor voltage (V)	100 ～ 250

표 4.  마이크로시스틴의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	모분자 이온	자분자 이온
마이크로시스틴-LR	995.17	995.6	135.1
마이크로시스틴-YR	1045.29	1045.5	135.1
마이크로시스틴-RR	1038.20	519.8	135.1
마이크로시스틴-LA	910.07	910.5	135.1

13. 마이크로시스틴-액체크로마토그래프-질량분석법

(Microcystins-High Performance Liquid Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 마이크로시스틴의 측정방법으로서, 먹는물 중에 마이크로시스틴을 고상추출하여 고성능액체크로마토그래프로 분리한 다음 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 마이크로시스틴-LR, -YR, -RR, -LA 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  고성능액체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 2.1 mm ∼ 4.6 mm, 길이 10 cm ∼ 15 cm의 스테인레스관에 옥타데실실릴기(ODS)를 화학결합시킨 실리카겔(입경 5 μm)을 충전한 것 또는 이와 동등의 분리능을 갖는 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  이동상은 10 mM 아세트산암모늄과 0.1 % 개미산을 혼합한 용액과 아세토나이트릴을 사용하고 유속은 0.3 mL/min ∼ 0.8 mL/min으로 사용한다.

3.1.3  고성능액체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기

3.2.1  이온화 방식은 전자분무이온화법(ESI, electrospray ionization)을 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 quadrupole 형태의 MS 또는 동등 성능 이상의 시스템을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 SIM (single ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하며, 선택하는 이온들은 표 4의 이온을 사용할 수 있다.

3.2.4  질량분석기의 조건은 표 3와 같이 수행할 수 있다.

3.3  초음파분쇄기

남조류 군체와 세포를 파쇄하여 조체로부터 마이크로시스틴을 추출할 수 있는 성능을 가진 것을 사용한다.

3.4  현미경

3.5  여과지

GF/C(직경 47 mm, 공극 1.2 μm)를 사용한다.

3.6  고상 카트리지

옥타데실기를 화학결합시킨 실리카겔(C18) 또는 동등이상의 성능을 갖고 있는 것으로 500 mg ∼ 10 g 채운 것을 사용한다.

3.7  건조기

일정한 온도를 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.8  원심분리기

3.9  진공농축기

3.10  SPE 추출장치

일반적으로 SPE 추출에 사용하는 매뉴얼 타입의 매니폴드(manifold)를 사용하거나, 자동화된 SPE 추출기 또는 LC/MS에 on-line SPE 시스템을 장착하여 사용 할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

액체크로마토그래프용 정제수를 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

액체크로마토그래프용 시약을 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올 20 %

정제수 80 mL와 메탄올 20 mL를 섞는다.

4.1.4  아세트산용액 5 %

정제수 950 mL와 아세트산(acetic acid, C2H4O2, 분자량 : 60.05) 50 mL를 섞는다.

4.1.5  TFA/메탄올용액 0.1 %

트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA, C2HF3O2, 분자량 : 114.02) 100 μL를 정확히 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올을 넣어 전량 100 mL로 한다.

4.1.6  아세트산암모늄 10 mM + 개미산 0.1 %

아세트산암모늄(ammonium acetate, C2H7NO2, 분자량 : 77.08) 0.3854 g을 정제수에 녹이고, 개미산(formic acid, CH2O2, 분자량 : 46.02) 500 μL를 넣어 전량 500 mL로 한다. 사용할 때 만든다. 이동상으로 사용하기 전 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 1]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.1.7  아세토나이트릴(acetonitrile, C2H3N, 분자량 : 41.05)

액체크로마토그래프용 시약을 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다. 이동상으로 사용하기 전 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 2]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L)

마이크로시스틴-LR (microcystin-LR, C49H74N10O12, 분자량 : 995.17), 마이크로시스틴-YR (microcystin-YR, C52H72N10O13, 분자량 : 1045.29), 마이크로시스틴-RR (microcystin-RR, C49H75N13O12, 분자량 : 1038.20), 마이크로시스틴-LA (microcystin-LA, C46H67N7O12, 분자량 : 910.07) 각각 200 μg을 정확히 취하여 메탄올 1000 μL에 용해시킨다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 200 μg 함유한다.

4.2.2  마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L)

200 mL 부피플라스크에 마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L) 1 mL를 넣고 메탄올을 넣어 200 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 1 μg 함유한다.

4.3  내부표준용액

4.3.1  내부표준물질원액(200 mg/L)

그라미시딘-S (gramicidin-S, C60H92N12O10, 분자량 : 1141.45) 200 μg을 정확히 취하여 메탄올 1000 μL에 용해시킨다. 이 용액 1 mL는 그라미시딘-S 200 μg을 함유한다.

4.3.2  내부표준물질용액(1 mg/L)

200 mL 부피플라스크에 내부표준물질원액(200 mg/L) 1 mL를 넣고 메탄올을 넣어 200 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 그라미시딘-S 1 μg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  모든 시료는 시료채취 즉시 차갑고 어두운 상태로 보관되어 운반한다.

5.2  24시간 이내에 분석하지 못하는 경우 0 ℃ ∼ 4 ℃에서 냉장보관 한다.

5.3  농축된 시료를 즉시 분석할 수 없는 경우, -5 ℃ 이하에서 냉동보관 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리·측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.1 μg/L ∼ 1.0 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성 한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ∼ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  상수원수

7.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구하고자 할 경우

7.1.1.1.1  40 ℃의 건조기에서 GF/C 여지를 건조시키고 데시케이터에 식힌 후 일정한 양(c)의 시료를 여과한다.

7.1.1.1.2  여과한 여지는 7.1.1.1.3에 따라, 여과한 여과액은 7.1.1.2.5에 따른다.

7.1.1.1.3  여과한 여지는 건조기를 이용하여 건조시킨다. 이 때, 건조기는 50 ℃ 이하로 유지하도록 한다.

7.1.1.1.4  건조시킨 여지를 데시케이터에서 식힌 후 작은 조각으로 자른다. 그리고 5 % 아세트산용액 20 mL 넣고 초음파분쇄기로 파쇄한다. 파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

[주 3]  여지를 자를 때 가위나 장갑에 의해 오염되지 않도록 주의한다.

7.1.1.1.5  파쇄가 끝난 시료는 원심분리기(2000 rpm, 10분)를 이용하여 분리한 후 상등액을 취한다.

7.1.1.1.6  다시 5 % 아세트산용액 20 mL를 넣고 원심분리 후 상등액을 취하고 이와 같은 과정을 반복하여 최종 100 mL가 되도록 한다.

7.1.1.1.7  최종액 100 mL에 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 시료에 첨가한다.

7.1.1.1.8  이하 추출은 7.1.1.2.6에 따른다.

7.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구하고자 할 경우

7.1.1.2.1  시료 일정량을 바이알에 분취하여 초음파분쇄기에 넣고 얼음 또는 차가운 물로 중탕하면서 조체를 파쇄 시킨다.

7.1.1.2.2  파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

7.1.1.2.3  파쇄가 끝난 후 현미경으로 세포의 완전 파쇄를 확인한다. 완전 파쇄가 이루어지지 않은 경우 파쇄 과정을 반복한다.

7.1.1.2.4  조체가 모두 파쇄된 시료를 GF/C 여지를 사용하여 여과한다.

7.1.1.2.5  여과한 시료 100 mL를 취하고, 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 시료에 첨가한다.

7.1.1.2.6  고상 카트리지를 활성화시키기 위해 메탄올 10 mL를 흘려준다. 활성화된 카트리지에 정제수 10 mL를 통과시켜 메탄올이 완전히 제거되도록 한다.

7.1.1.2.7  활성화된 고상 카트리지가 건조되기 전에 7.1.1.2.5의 시료를 카트리지에 10 mL/min 이하의 속도로 흘려준다.

7.1.1.2.8  20 % 메탄올 5 mL를 통과시켜 고상 카트리지의 불순물을 제거한다.

7.1.1.2.9  0.1 % TFA/메탄올용액 5 mL를 천천히 통과시켜 고상 카트리지 내에 흡착되어 있는 마이크로시스틴을 용출시켜 작은 유리수기에 받는다.

7.1.1.2.10  최종 용출용매 5 mL를 진공농축기 또는 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨다.

7.1.1.2.11  최종액이 200 μL ∼ 1,000 μL가 되도록 메탄올로 건조된 마이크로시스틴을 용해시킨다. 이 때 메탄올을 3번에 나누어 분주하면서 벽에 묻은 마이크로시스틴이 모두 녹을 수 있도록 한다.

7.1.1.2.12  마이크로시스틴을 용해시킨 최종액을 시험용액으로 한다.

7.1.2  정수

7.1.2.1  시료 1 L ∼ 5 L에 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 첨가한다.

7.1.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 90 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L) 0, 10, 20, 40, 80, 100 μL를 단계적으로 취하여 정제수로 표선까지 채운다. 이후 내부표준물질용액(1 mg/L)을 정확히 40 μL 취하여 첨가한다. 제조한 검정곡선용 표준용액의 농도는 마이크로시스틴 각각 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 μg/L이다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 양과 농도는 달리 할 수 있다.

[주 4]  시료분석결과 검정곡선 농도범위를 벗어나면 시료를 묽혀서 재분석하여야 한다.

7.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2.3  마이크로시스틴 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

7.3.1  추출액 100 μL를 취하여 액체크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  크로마토그램으로부터 얻은 각 분석성분 및 내부표준물질의 피크면적을 측정하여 분석성분의 피크면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 구한다.

8.0  결과보고

8.1  계산

8.1.1  내부표준물질법

8.1.1.1  상수원수

8.1.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 2)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 1)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 3)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 2)

여기서, Cc : (식 1)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 3)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a}]                               (식 3)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 4)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2  절대검정곡선법

8.1.2.1  상수원수

8.1.2.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 6)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 5)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 7)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 6)

여기서, Cc : (식 5)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 7)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a}]                               (식 7)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 8)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.2  결과보고

8.2.1  행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

8.2.2  6.0에서 구한 방법검출한계 및 정량한계를 결과와 함께 반드시 표시한다.

9.0  참고자료

9.1  WHO, 1999, Toxic Cyanobacteria in Water : A guide to their public health consequences, monitoring and management, Chapter 13. Laboratory analysis of cyanotoxins

9.2  환경부, 조류예보제 운영 매뉴얼(2008), 제3장 마이크로시스틴 분석방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  마이크로시스틴의 고성능액체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목

조 건

컬럼

ODS C18 (4.6 mm × 150 mm, 5 μm)

컬럼 온도

40 ℃

이동상

A : 10 mM Ammonium acetate + 0.1 % Formic acid

B : Acetonitrile

Time	이동상 A	이동상 B
1	95	5
2	70	30
6	10	90
8	10	90
8.1	95	5
14	95	5

유속

0.8 mL/min

주입량

100 μL

표 3.  마이크로시스틴의 질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
Source	ESI (electrospray ionization)
Ion mode	Positive
Capillary voltage (V)	4000
Nebulizer (psi)	50
Drying gas temp. (℃)	200
Drying gas flowrate (L/min)	6
Sheath gas temp. (℃)	360
Sheath gas flowrate (L/min)	11
Fragmentor voltage (V)	100 ~ 250

표 4.  마이크로시스틴의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
마이크로시스틴-LR	995.17	995.6	135.1
마이크로시스틴-YR	1045.29	1045.5	135.1
마이크로시스틴-RR	1038.20	519.8	135.1
마이크로시스틴-LA	910.07	910.5	135.1

14. 마이크로시스틴-고성능액체크로마토그래피

(Microcystins-High Performance Liquid Chromatography)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 마이크로시스틴의 측정방법으로서, 먹는물 중에 마이크로시스틴을 고상추출하여 고성능액체크로마토그래프로 분리한 다음 자외선검출기 또는 광다이오드어레이검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 마이크로시스틴-LR, -YR, -RR, -LA 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  고성능액체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 2.1 mm ∼ 4.6 mm, 길이 10 cm ∼ 25 cm의 스테인레스관에 옥타데실실릴기(ODS)를 화학결합시킨 실리카겔(입경 5 μm)을 충전한 것 또는 이와 동등의 분리능을 갖는 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  이동상은 50 mM 인산염완충용액과 메탄올을 사용하고 유속은 1.0 mL/min으로 사용한다.

3.1.3  고성능액체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  자외선검출기

자외선검출기(UV detector, ultraviolet detector)는 238 nm에서 검출 할 수 있는 것으로 사용한다.

3.3  광다이오드어레이검출기

광다이오드어레이검출기(PDA detector, photodiode array detector)는 210 nm ∼ 400 nm로 조절 할 수 있는 것으로 사용한다.

3.4  초음파분쇄기

남조류 군체와 세포를 파쇄하여 조체로부터 마이크로시스틴을 추출할 수 있는 성능을 가진 것을 사용한다.

3.5  현미경

3.6  여과지

GF/C(직경 47 mm, 공극 1.2 μm)를 사용한다.

3.7  고상 카트리지

옥타데실기를 화학결합시킨 실리카겔(C18) 또는 동등이상의 성능을 갖고 있는 것으로 500 mg ∼ 10 g 채운 것을 사용한다.

3.8  건조기

일정한 온도를 유지할 수 있는 것을 사용한다.

3.9  원심분리기

3.10  진공농축기

3.11  SPE 추출장치

일반적으로 SPE 추출에 사용하는 매뉴얼 타입의 매니폴드(manifold)를 사용하거나, 자동화된 SPE 추출기를 사용 할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

액체크로마토그래프용 정제수를 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

액체크로마토그래프용 시약을 사용하며, 바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다. 이동상으로 사용할 때에는 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 1]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올 20 %

정제수 80 mL와 메탄올 20 mL를 섞는다.

4.1.4  아세트산용액 5 %

정제수 950 mL와 아세트산(acetic acid, C2H4O2, 분자량 : 60.05) 50 mL를 섞는다.

4.1.5  TFA/메탄올용액 0.1 %

트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid, TFA, C2HF3O2, 분자량 : 114.02) 100 μL를 정확히 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올을 넣어 전량 100 mL로 한다.

4.1.6  인산염완충용액 50 mM

인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09) 6.8045 g을 정제수에 녹여 전량 1 L로 한다.  사용할 때 만든다. 이동상으로 사용하기 전 여과지를 이용하여 여과한 후 사용한다.

[주 2]  여과지는 polytetrafluoroethylene (PTFE)이나 polycarbonate (PC) 또는 이와 동등한 재질로 공극 크기 0.1 μm 이하의 것을 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L)

마이크로시스틴-LR (microcystin-LR, C49H74N10O12, 분자량 : 995.17), 마이크로시스틴-YR (microcystin-YR, C52H72N10O13, 분자량 : 1045.29), 마이크로시스틴-RR (microcystin-RR, C49H75N13O12, 분자량 : 1038.20), 마이크로시스틴-LA (microcystin-LA, C46H67N7O12, 분자량 : 910.07) 각각 200 μg을 정확히 취하여 메탄올 1000 μL에 용해시킨다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 200 μg 함유한다.

4.2.2  마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L)

200 mL 부피플라스크에 마이크로시스틴 혼합표준원액(200 mg/L) 1 mL를 넣고 메탄올을 넣어 200 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 마이크로시스틴을 각각 1 μg 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  모든 시료는 시료채취 즉시 차갑고 어두운 상태로 보관되어 운반한다.

5.2  24시간 이내에 분석하지 못하는 경우 0 ℃ ∼ 4 ℃에서 냉장보관 한다.

5.3  농축된 시료를 즉시 분석할 수 없는 경우, -5 ℃ 이하에서 냉동보관 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리·측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.1 μg/L ∼ 1.0 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ∼ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  상수원수

7.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구하고자 할 경우

7.1.1.1.1  40 ℃의 건조기에서 GF/C 여지를 건조시키고 데시케이터에 식힌 후 일정한 양(c)의 시료를 여과한다.

7.1.1.1.2  여과한 여지는 7.1.1.1.3에 따라, 여과한 여과액은 7.1.1.2.5에 따른다.

7.1.1.1.3  여과한 여지는 건조기를 이용하여 건조시킨다. 이 때, 건조기는 50 ℃ 이하로 유지하도록 한다.

7.1.1.1.4  건조시킨 여지를 데시케이터에서 식힌 후 작은 조각으로 자른다. 그리고 5 % 아세트산용액 20 mL 넣고 초음파분쇄기로 파쇄한다. 파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

[주 3]  여지를 자를 때 가위나 장갑에 의해 오염되지 않도록 주의한다.

7.1.1.1.5  파쇄가 끝난 시료는 원심분리기(2000 rpm, 10분)를 이용하여 분리한 후 상등액을 취한다.

7.1.1.1.6  다시 5 % 아세트산용액 20 mL를 넣고 원심분리 후 상등액을 취하고 이와 같은 과정을 반복하여 최종 100 mL가 되도록 한다.

7.1.1.1.7  이하 추출은 7.1.1.2.6에 따른다.

7.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구하고자 할 경우

7.1.1.2.1  시료 일정량을 바이알에 분취하여 초음파분쇄기에 넣고 얼음 또는 차가운 물로 중탕하면서 조체를 파쇄 시킨다.

7.1.1.2.2  파쇄 시간은 총 30분으로 하되, 연속 파쇄 시 시료의 급격한 온도 상승이 발생되므로 4분 30초 파쇄 후 30초 방치를 반복한다.

7.1.1.2.3  파쇄가 끝난 후 현미경으로 세포의 완전 파쇄를 확인한다. 완전 파쇄가 이루어지지 않은 경우 파쇄 과정을 반복한다.

7.1.1.2.4  조체가 모두 파쇄된 시료를 GF/C 여지를 사용하여 여과한다.

7.1.1.2.5  여과한 시료 100 mL를 취한다.

7.1.1.2.6  고상 카트리지를 활성화시키기 위해 메탄올 10 mL를 흘려준다. 활성화된 카트리지에 정제수 10 mL를 통과시켜 메탄올이 완전히 제거되도록 한다.

7.1.1.2.7  활성화된 고상 카트리지가 건조되기 전에 7.1.1.2.5의 시료를 카트리지에 10 mL/min 이하의 속도로 흘려준다.

7.1.1.2.8  20 % 메탄올 5 mL를 통과시켜 고상 카트리지의 불순물을 제거한다.

7.1.1.2.9  0.1 % TFA/메탄올용액 5 mL를 천천히 통과시켜 고상 카트리지 내에 흡착되어 있는 마이크로시스틴을 용출시켜 작은 유리수기에 받는다.

7.1.1.2.10  최종 용출용매 5 mL를 진공농축기 또는 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨다.

7.1.1.2.11  최종액이 200 μL ∼ 1,000 μL가 되도록 메탄올로 건조된 마이크로시스틴을 용해시킨다. 이 때 메탄올을 3번에 나누어 분주하면서 벽에 묻은 마이크로시스틴이 모두 녹을 수 있도록 한다.

7.1.1.2.12  마이크로시스틴을 용해시킨 최종액을 시험용액으로 한다.

7.1.2  정수

7.1.2.1  시료 1 L ∼ 5 L를 취한다.

7.1.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 90 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 마이크로시스틴 혼합표준용액(1 mg/L) 0, 10, 20, 40, 80, 100 μL를 단계적으로 취하여 정제수로 표선까지 채운다. 제조한 검정곡선용 표준용액의 농도는 마이크로시스틴 각각 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 μg/L이다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 양과 농도는 달리 할 수 있다.

[주 4]  시료분석결과 검정곡선 농도범위를 벗어나면 시료를 묽혀서 재분석하여야 한다.

7.2.2  이하 추출은 7.1.1.2.6 ∼ 7.1.1.2.12에 따른다.

7.2.3  마이크로시스틴 각 분석화합물의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

7.3  측정법

7.3.1  추출액 100 μL를 취하여 액체크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  크로마토그램으로부터 얻은 각 분석성분의 피크면적을 측정한다.

8.0  결과보고

8.1  계산

8.1.1  내부표준물질법

8.1.1.1  상수원수

8.1.1.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 2)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 1)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 3)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 2)

여기서, Cc : (식 1)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 3)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a}]                               (식 3)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.1.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 내부표준물질에 대한 면적 비(Ax/Ai)를 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {{Ax} over {Ai} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 4)

여기서, Ax/Ai : 분석물질과 내부표준물질의 피크 면적 비

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2  절대검정곡선법

8.1.2.1  상수원수

8.1.2.1.1  조체 내의 농도를 별도로 구한 경우

조체 내 마이크로시스틴 각 분석물질별 농도(Cc, μg/L)를 구하고 (식 6)에 따라 물 속의 용존 농도를 구하여 각각 합한 것을 최종 농도로 한다.

[eqn: Cc`(ug/L)`=` {100} over {c} TIMES Cx]                            (식 5)

여기서, c : 여과한 시료양 (mL)

Cx : (식 7)과 같이 계산하여 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cc : 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

[eqn: Ct(ug/L)=Cc`+`Cs]                              (식 6)

여기서, Cc : (식 5)에 의해 계산된 조체 내 분석물질의 농도 (μg/L)

Cs : (식 7)에 의해 계산된 용존 상태의 분석물질 농도 (μg/L)

Ct : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.1.2  조체와 물 속 용존 농도를 구분하지 않고 구한 경우

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a}]                               (식 7)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.1.2.2  정수

마이크로시스틴 각 분석물질별로 피크 면적(Ax)을 구한 다음 검정곡선식의 y(i)값에 대입하여 x(i)값을 계산하면 분석물질의 농도(Cs, μg/L)를 구할 수 있다.

[eqn: Cs`(ug/L)`=` {A _{X} -b} over {a} TIMES {1} over {D}]                            (식 8)

여기서, Ax : 분석물질의 피크 면적

a : 검정곡선의 기울기

b : 검정곡선의 절편 값

D : 농축배수

Cs : 분석물질의 총 농도 (μg/L)

8.2  결과보고

8.2.1  행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

8.2.2  6.0에서 구한 방법검출한계 및 정량한계를 결과와 함께 반드시 표시한다.

9.0  참고자료

9.1  WHO, 1999, Toxic Cyanobacteria in Water : A guide to their public health consequences, monitoring and management, Chapter 13. Laboratory analysis of cyanotoxins

9.2  환경부, 조류예보제 운영 매뉴얼(2008), 제3장 마이크로시스틴 분석방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  마이크로시스틴의 고성능액체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼	ODS C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm)
컬럼 온도	40 ℃
이동상	50 mM 인산염완충용액 : 메탄올 = 48 : 52
유속	1.0 mL/min
파장	자외선 검출기 : 238 nm 광다이오드어레이 검출기 : 210 nm ∼ 400 nm
주입량	100 μL

15. 알라클러-기체크로마토그래프-전자포획검출법

(Alachlor-Gas Chromatograph-Electron Capture Detector)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 알라클러의 측정방법으로서, 시료 중 알라클러를 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 기체크로마토그래프로 분리하여 전자포획검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 알라클러의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  전자포획검출기

3.3  원심분리기

2500 rpm 이상 가능한 것을 사용한다.

3.4  구테루나 다니쉬 농축기

3.5  혼합기

Vortex 혼합기 또는 이와 동등한 기구를 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)

4.1.6  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.2  표준용액

4.2.1  알라클러 표준원액(100 mg/L)

알라클러 10 mg을 메탄올 100 mL에 녹인다.

4.2.2  알라클러 표준용액(10 mg/L)

알라클러 표준원액(100 mg/L)을 1 mL 취하여 10 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 표선까지 채운다.

4.3  내부표준용액

2,4-디클로로니트로벤젠(2,4-dichloronitrobenzene, C6H3Cl2NO2, 분자량 : 192.00)과 트리페닐포스페이트(triphenylphosphate, TPP, C18H15O4P, 분자량 : 326.29)를 각각 0.05 g과 0.01 g을 취하여 메탄올 100 mL에 녹인다. 이 용액을 메탄올로 100배 희석한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병과 TFE 재질의 마개를 사용하여 시료를 채취하고, 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거한 후 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다.

5.2  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 시료채취 후 72시간 내에 추출하지 않으면 시료는 수산화나트륨이나 황산으로 pH 5.0 ～ 9.0의 범위로 조절하여야 한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0005 mg/L ∼ 0.02 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 200 mL를 250 mL 분액깔때기에 취하고 내부표준용액 200 μL를 넣고 섞는다.

7.1.2  인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5 정도로 맞춘다.

7.1.3  염화나트륨 10 g을 넣은 후 잘 녹인다.

7.1.4  디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 격렬히 흔든다.

7.1.5  층 분리가 완전히 될 때까지 기다린 후 아래층의 디클로로메탄층을 시험관에 옮긴다.

7.1.6  이 추출용액에 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 섞어 수분을 제거한다.

7.1.7  2500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 추출액을 구테루나 다니쉬 농축기에 옮기고 1 mL까지 농축하여 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

알라클러 표준용액(10 mg/L)을 0.1 mL ～ 4 mL 씩을 단계적으로 수개의 10 mL 부피플라스크에 넣고 내부표준용액 2 mL를 넣은 후 각각에 메탄올로 전량을 10 mL로 하여 7.3과 같은 방법으로 시험하여 알라클러의 양과 크로마토그램의 피크 높이 또는 면적과의 관계를 구한다.

7.3  측정법

시험용액 1 μL ～ 10 μL를 기체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 실시하고 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 알라클러의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 505, 1995, Analysis Of Organohalide Pesticides And Commercial Polychlorinated Biphenyl (PCB) Products In Water By Microextraction And Gas Chromatography

9.2  US EPA Method 508.1, 1995, Determination of chlorinated pesticides, herbicides, and organohalides in water using liquid-solid extraction and electron capture gas chromatography

9.3  US EPA Method 551.1, 1995, Determination of chlorination disinfection byproducts, chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.0005 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  알라클러의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 ㎛, film thickness) 질소 1/20 250 ℃ 300 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 0 15.0 230 0 5.0 260 3.0 10.0 310 3.0

16. 알라클러-기체크로마토그래프-질량분석법

(Alachlor-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중에 알라클러의 측정방법으로서, 시료 중 알라클러를 디클로로메탄으로 추출하여 농축한 후 기체크로마토그래프로 분리하여 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 알라클러의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  원심분리기

2500 rpm 이상 가능한 것을 사용한다.

3.4  구테루나 다니쉬 농축기

3.5  혼합기

Vortex 혼합기 또는 이와 동등한 기구를 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄

디클로로메탄(methylene chloride, CH2Cl2, 분자량 : 84.93)은 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올

메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)

4.1.6  인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09)

4.2  표준용액

4.2.1  알라클러 표준원액(100 mg/L)

알라클러 10 mg을 메탄올 100 mL에 녹인다.

4.2.2  알라클러 표준용액(10 mg/L)

알라클러 표준원액(100 mg/L)을 1 mL 취하여 10 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 표선까지 채운다.

4.3  내부표준용액

2,4-디클로로니트로벤젠(2,4-dichloronitrobenzene, C6H3Cl2NO2, 분자량 : 192.00)과 트리페닐포스페이트(triphenylphosphate, TPP, C18H15O4P, 분자량 : 326.29)를 각각 0.05 g과 0.01 g을 취하여 메탄올 100 mL에 녹인다. 이 용액을 메탄올로 100배 희석한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병과 TFE 재질의 마개를 사용하여 시료를 채취하고, 아비산나트륨을 넣어 잔류염소를 제거한 후 밀봉하여 냉장고에 보관하고 신속히 시험한다.

5.2  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 시료채취 후 72시간 내에 추출하지 않으면 시료는 수산화나트륨이나 황산으로 pH 5.0 ～ 9.0의 범위로 조절하여야 한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.0005 mg/L ∼ 0.02 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 200 mL를 250 mL 분액깔때기에 취하고 내부표준용액 200 μL를 넣고 섞는다.

7.1.2  인산이수소칼륨 1 g을 넣어 pH 4.5 정도로 맞춘다.

7.1.3  염화나트륨 10 g을 넣은 후 잘 녹인다.

7.1.4  디클로로메탄 10 mL를 넣고 10분간 격렬히 흔든다.

7.1.5  층 분리가 완전히 될 때까지 기다린 후 아래층의 디클로로메탄층을 시험관에 옮긴다.

7.1.6  이 추출용액에 무수황산나트륨 2 g을 넣고 잘 섞어 수분을 제거한다.

7.1.7  2500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 추출액을 구테루나 다니쉬 농축기에 옮기고 1 mL까지 농축하여 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

알라클러 표준용액(10 mg/L)을 0.1 mL ～ 4 mL 씩을 단계적으로 수개의 10 mL 부피플라스크에 넣고 내부표준용액 2 mL를 넣은 후 각각에 메탄올로 전량을 10 mL로 하여 7.3과 같은 방법으로 시험하여 알라클러의 양과 크로마토그램의 피크 높이 또는 면적과의 관계를 구한다.

7.3  측정법

시험용액 1 μL ～ 10 μL를 기체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 실시하고 7.2에 따라 작성한 검정곡선으로부터 시험용액 중의 알라클러의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 505, 1995, Analysis Of Organohalide Pesticides And Commercial Polychlorinated Biphenyl (PCB) Products In Water By Microextraction And Gas Chromatography

9.2  US EPA Method 508.1, 1995, Determination of chlorinated pesticides, herbicides, and organohalides in water using liquid-solid extraction and electron capture gas chromatography

9.3  US EPA Method 551.1, 1995, Determination of chlorination disinfection byproducts, chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.0005 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  알라클러의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/20 250 ℃ 300 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 0 15.0 230 0 5.0 260 3.0 10.0 310 3.0

표 3.  알라클러의 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
알라클러	269	160	188, 237, 146

17. 브롬산염-이온크로마토그래피

(Bromate-Ion Chromatography)

이 시험방법은 먹는물 중 브롬산염의 분석방법으로 먹는물수질공정시험기준 ES 05358.1a와 같다.

18. 클로레이트-이온크로마토그래피

(Chlorate-Ion Chromatography)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 미량유해물질인 클로레이트를 전도도검출기(conductivity detector)가 장착된 이온크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 클로레이트의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  이온크로마토그래프

3.1.1  이온크로마토그래프 컬럼은 alkanol quaternary ammonium 작용기를 포함한 다공성 비드로 채워진 것으로 직경이 2 mm ～ 4 mm, 길이가 250 mm인 음이온 교환 컬럼 또는 동등한 분리성능을 가진 컬럼으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 사용한다.

3.1.2  이온크로마토그래프 컬럼에서 용리된 각 성분이 검출기에 들어가기 전에 용리액 자체의 전도도를 감소시키고 목적성분의 전도도를 증가시켜 높은 감도로 음이온을 분석하기 위해 제거장치(서프레서)를 사용한다. 고용량의 양이온 교환수지를 충전시킨 컬럼형과 양이온 교환막으로 구성된 격막형의 서프레서를 사용할 수 있다.

3.1.3  음이온 분석에 주로 사용되는 전기전도도검출기, UV검출기, 전기화학적검출기 (amperometry, AD) 또는 질량분석기를 사용할 수 있다.

3.1.4  용리액은 수산화칼륨 수용액을 적절한 농도(10 mM ～ 50 mM)로 사용하며 유량은 컬럼의 내경에 따라 0.2 mL/min ～ 1 mL/min로 조작하여 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 증류 또는 필터과정에 의해 각 이온을 제거하고 0.2 μm의 막을 통과시킨 물로서 18 MΩ 또는 그 이상의 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  용리액 (9.0 mM Na2CO3)

기기모델 및 부속품에 따라 카보네이트 용리액을 사용해야 할 경우, EPA method 300.1 및 EPA method 317.0 (ver. 2.0)에서 탄산나트륨을 사용하였으며, 조제방법은 다음과 같다.

탄산나트륨(sodium carbonate, Na2CO3, 분자량 : 105.99) 1.91 g을 물에 녹여 2 L로 한다. 용리액 준비에 사용하는 모든 정제수는 가스를 제거하여 사용하고 작동 중에는 헬륨을 불어넣어 공기의 유입을 막는 것이 좋다.

4.1.3  용리액 (50 mM KOH)

진한 수산화칼륨(potassium hydroxide, KOH, 분자량 : 56.10)용액을 정제수로 희석하여 50 mM 수산화칼륨 용리액을 조제한다. 수산화칼륨으로 조제할 경우 탄산이온이 용존되어 방해 작용을 일으키므로 가급적 진한 수산화칼륨용액을 사용하는 것이 바람직하다. 50 mM 수산화칼륨 용리액은 50 % 수산화칼륨용액 11.5 g을 정제수에 녹여 2 L로 하여 제조한다. 경우에 따라 적정한 농도로 희석하여 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  클로레이트 표준원액(1,000 mg/L)

데시케이터 안에서 건조된 염소산나트륨(sodium chlorate, NaClO3, 분자량 : 106.44) 127.5 mg을 정확히 달아 정제수에 녹여 100 mL로 하거나 시판용 표준용액을 사용한다. 이 용액 1 mL에는 클로레이트 1.0 mg을 함유한다. 제조 후 유리병에 넣어 2 ℃ ～ 6 ℃로 저장하면 한 달 동안 안정하다.

4.2.2  클로레이트 표준용액(100 mg/L)

클로레이트 표준원액(1,000 mg/L) 50 mL를 500 mL 부피플라스크에 넣어 정제수를 표선까지 가하여 제조한다. 이 용액 1 mL는 클로레이트 0.1 mg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  시료는 미리 정제수로 씻은 유리병이나 플라스틱병을 이용해 채취한다.

5.2  시료채취 후 즉시 분석하는 것이 좋으며 2일 이내에 분석할 때에는 4 ℃ 냉암소에서 보관한다.

6.0  정도보증/정도관리 (QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.03 mg/L ∼ 0.7 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정확도(accuracy) 및 정밀도(precision)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계의 1배 ～ 2배 농도가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료를 4개 이상 준비하고 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료와 표준용액을 냉장고에서 꺼내어 상온에서 방치한다.

7.1.2  시료의 전기전도도를 측정하여 간섭이온(염소이온, 황산이온, 탄산이온)의 영향을 확인한다.

7.1.3  시료 중에 존재하는 입자상물질을 0.2 μm 막 여과지를 사용하여 제거한다. 예비 농축이 필요한 경우 사전에 일정 비로 농축하여 여과한다.

7.1.4  전기전도도를 측정하여 간섭이온의 농도가 높을 경우 -Ba → -Ag → -H 순으로 카트리지를 사용하여 간섭이온(황산이온, 염소이온, 탄산 및 금속이온)을 제거한다. 카트리지로 여과할 때에는 미리 정제수 약 10 mL로 카트리지를 여과 후 시료를 여과한다. 이때 처음의 약 6 mL는 버린 후 여과액을 시료로 사용한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 50 mL를 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 클로레이트 표준용액(100 mg/L) 0.03 mL ～ 0.7 mL를 단계적으로 취하여 넣고 정제수로 눈금까지 채운다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 농도와 개수를 달리 할 수 있다. 표준시료 1 mL를 각 농도에 따라 이온크로마토그래프에 주입한다.

7.2.2  클로레이트의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 클로레이트의 피크 면적(Ax)을 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

[주 1]  피크의 면적 대신 피크의 높이를 사용할 수 있으나 피크 면적을 사용하는 것이 바람직하다.

7.3  측정법

7.3.1  이온크로마토그래프의 전체 시스템을 작동시킨 다음 용리액을 흘려보내면서 펌프의 압력 및 검출기의 전도도가 일정하게 유지될 때까지 기다린다.

7.3.2  펌프의 압력이 일정하게 유지되고 용리액의 전도도 및 기록계의 바탕선이 안정화되면 시료를 주입하여 크로마토그램을 작성하고 각 음이온들의 머무름 시간을 확인한다.

7.3.3  각 음이온에 해당하는 피크의 면적 또는 높이를 계산한다.

7.3.4  시료의 피크 면적 또는 높이가 검정곡선의 상한 값을 초과할 경우에는 시료 일정량을 취하여 적당한 농도로 정확히 희석한 다음 이 용액을 가지고 실험한다.

7.3.5  이온크로마토그래프의 실험 조건의 예는 표 2와 같다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA, Method 300.1 ver. 1.0, 1993, Determination of inorganic anions in drinking water by ion chromatography

9.2  US EPA, Method 317.0 ver. 2.0, 2001, Determination of inorganic oxyhalide disinfection by-products in drinking water using ion chromatography with the addition of a postcolumn reagent for trace bromate analysis

9.3  KS I ISO 10304-4, 2008, 수질-이온 액체 크로마토그래피에 의한 용존 음이온 측정방법-제 4부 : 오염이 낮은 물에 존재하는 염소산, 염소 및 아염소산의 측정

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.03 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  클로레이트의 이온크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
Sample loop	1000 μL
Eluent	10 mM ～ 50 mM KOH
Flow rate	1.0 mL/min
Column	IonPac AG19 4 mm x 50 mm AS19, 4 mm x 250 mm
Suppressor	ASRS ULTRAII, 4 mm (외부정제수 주입모드)
Detector	Suppressed conductivity detector
Total analytical time	30 min

그림 1. 클로레이트의 IC 크로마토그램(예) (클로레이트: 14.643 min)

19. 염소소독부산물-기체크로마토그래프-전자포획검출법

(Chlorine Disinfection By-Products-Gas Chromatograph-Electron Capture Detector)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 염소소독부산물의 측정방법으로서, 시료를 메틸삼차-부틸에테르로 추출하여 기체크로마토그래프로 분리한 다음 전자포획검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 브로모클로로아세토니트릴, 디브로모에틸렌의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  전자포획검출기

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 물을 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메틸삼차-부틸에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE, C5H12O, 분자량 : 88.15)

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  아세톤(acetone, C3H6O, 분자량 : 58.08)

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl, 분자량 : 53.49)

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.45)

4.1.6  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.2  표준용액

브로모클로로아세토니트릴, 디브로모에틸렌은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다.

4.2.1  염소소독부산물 표준원액

미리 희석하여 판매되는 표준원액을 사용하거나 각 물질별 표준물질을 다음과 같이 조제한다.

4.2.1.1  10 mL 부피플라스크에 아세톤 9.8 mL를 넣고 마개를 연 상태에서 부피플라스크의 표면에 묻은 아세톤이 마를 때까지 약 10분간 방치한 다음 0.1 mg 단위까지 무게를 잰다.

4.2.1.2  각각의 부피플라스크에 위의 표준물질을 취하여 플라스크의 내벽에 닿지 아니하도록 조심하면서 아세톤에 직접 2 방울 ～ 3 방울을 넣는다.

4.2.1.3  다시 무게를 잰다. 이어서 아세톤으로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다.

4.2.1.4  각각의 표준물질의 첨가량을 구하여 표준원액의 농도(μg/mL)를 구한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 ℃ 이하)에서 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.2.2  염소소독부산물 표준용액

25 mL 부피플라스크에 각각 25 μg에 상당하는 표준원액을 넣고 아세톤으로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고에 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 증류수로 잘 씻은 유리병에 10 mg의 염화암모늄을 첨가하고 염산(6 M)을 1 방울 ～ 2 방울을 가한 후 시료를 유리병에 기포가 없도록 채취한다.

5.2  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 14일 이내에 분석한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.00005 mg/L ∼ 0.005 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료와 표준용액을 냉장고에서 꺼내어 상온으로 한다.

7.1.2  시료 200 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣는다.

7.1.3  염화나트륨 50 g을 넣고 흔들어 녹인다.

7.1.4  메틸삼차-부틸에테르 25 mL를 넣은 후 4분간 격렬하게 흔들어 추출한다.

7.1.5  두 층이 분리되면 아래 물층은 버리고 위의 메틸삼차-부틸에테르층을 시험관에 취한다.

7.1.6  메틸삼차-부틸에테르층에 무수황산나트륨을 약 0.5 g 가하여 수분을 제거한 다음 0.5 mL까지 농축시켜 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

표준용액 0.2 mL ～ 10 mL를 사용하여 단계적으로 50 mL 부피플라스크에 취하고 각각에 아세톤을 넣어 50 mL로 한 다음 시린지로 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입하여 각 성분의 양과 피크 높이 또는 넓이와의 관계를 구한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 551.1, 1995, Determination of chlorination disinfection byproducts, chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection

9.2  Standard Method 6231, 2005, 1,2-Dibromoethane (EDB) and 1,2-dibromo-3-chloro propane (DBCP)

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.00005 ∼ 0.0005 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  염소소독부산물의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 질소 1/10 200 ℃ 280 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 7 10.0 70 0 20.0 200 3.0

20. 염소소독부산물-기체크로마토그래프-질량분석법

(Chlorine Disinfection By-Products-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 염소소독부산물의 측정방법으로서, 시료를 메틸삼차-부틸에테르로 추출하여 기체크로마토그래프로 분리한 다음 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 브로모클로로아세토니트릴, 디브로모에틸렌의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 물을 15분간 끓인 후 90 ℃를 유지하면서 불활성가스로 1시간 퍼지하여 휘발성 유기물질을 제거하고 병구멍이 작은 유리병에 넣은 다음 마개를 한다. 바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메틸삼차-부틸에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE, C5H12O, 분자량 : 88.15)

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  아세톤(acetone, C3H6O, 분자량 : 58.08)

바탕 시험할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl, 분자량 : 53.49)

4.1.5  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.45)

4.1.6  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.2  표준용액

브로모클로로아세토니트릴, 디브로모에틸렌은 표준시약 또는 특급이상을 사용하며, 표준물질의 순도가 96 % 이상이면 농도는 보정하지 아니한다.

4.2.1  염소소독부산물 표준원액

미리 희석하여 판매되는 표준원액을 사용하거나 각 물질별 표준물질을 다음과 같이 조제한다.

4.2.1.1  10 mL 부피플라스크에 아세톤 9.8 mL를 넣고 마개를 연 상태에서 부피플라스크의 표면에 묻은 아세톤이 마를 때까지 약 10분간 방치한 다음 0.1 mg 단위까지 무게를 잰다.

4.2.1.2  각각의 부피플라스크에 위의 표준물질을 취하여 플라스크의 내벽에 닿지 아니하도록 조심하면서 아세톤에 직접 2 방울 ～ 3 방울을 넣는다.

4.2.1.3  다시 무게를 잰다. 이어서 아세톤으로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다.

4.2.1.4  각각의 표준물질의 첨가량을 구하여 표준원액의 농도(μg/mL)를 구한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고(4 ℃ 이하)에서 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

4.2.2  염소소독부산물 표준용액

25 mL 부피플라스크에 각각 25 μg에 상당하는 표준원액을 넣고 아세톤으로 표선까지 채운 다음 마개를 하고 플라스크를 흔들어서 혼합한다. 이 용액은 될 수 있는 대로 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 아니하도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 냉장고에 보존하고, 4주 이내에 사용한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 증류수로 잘 씻은 유리병에 10 mg의 염화암모늄을 첨가하고 염산(6 M)을 1 방울 ～ 2 방울을 가한 후 시료를 유리병에 기포가 없도록 채취한다.

5.2  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관하고 14일 이내에 분석한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.00005 mg/L ∼ 0.005 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 실험절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료와 표준용액을 냉장고에서 꺼내어 상온으로 한다.

7.1.2  시료 200 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣는다.

7.1.3  염화나트륨 50 g을 넣고 흔들어 녹인다.

7.1.4  메틸삼차-부틸에테르 25 mL를 넣은 후 4분간 격렬하게 흔들어 추출한다.

7.1.5  두 층이 분리되면 아래 물층은 버리고 위의 메틸삼차-부틸에테르층을 시험관에 취한다.

7.1.6  메틸삼차-부틸에테르층에 무수황산나트륨을 약 0.5 g 가하여 수분을 제거한 다음 0.5 mL까지 농축시켜 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

표준용액 0.2 mL ～ 10 mL를 사용하여 단계적으로 50 mL 부피플라스크에 취하고 각각에 아세톤을 넣어 50 mL로 한 다음 시린지로 1 μL ～ 5 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입하여 각 성분의 양과 피크 높이 또는 넓이와의 관계를 구한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1   US EPA Method 551.1, 1995, Determination of chlorination disinfection byproducts, chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection

9.2   Standard Method 6231, 2005, 1,2-Dibromoethane (EDB) and 1,2-dibromo-3-chloropropane (DBCP)

9.3   환경부, 먹는물수질공정시험기준(2011, 3), ES 05551.1a 염소소독부산물-기체크로마토그래프-질량분석법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.00005 ∼ 0.0005 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  염소소독부산물의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/10 200 ℃ 280 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 7 10.0 70 0 20.0 200 3.0

표 3.  염소소독부산물의 각 물질별 선택이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
브로모클로로아세토니트릴 디브로모에틸렌(EDB)	153 186	74 107	76, 155 109, 79, 188

21. 2,4-D와 할로아세틱에시드

-기체크로마토그래프-전자포획검출법

(2,4-D and Haloacetic Acids-Gas Chromatograph-Electron Capture Detector)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 2,4-D와 할로아세틱에시드류의 측정방법으로서, 먹는물 시료를 pH 2 이하가 되도록 황산으로 조절한 후 2,4-D와 할로아세틱에시드류를 메틸삼차-부틸에테르로 추출하여 산성조건 하에 메탄올로 유도체화 시킨 후 기체크로마토그래프로 분리한 다음 전자포획검출기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  전자포획검출기

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메틸삼차-부틸에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE, C5H12O, 분자량 : 88.15)

바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.1.5  황산구리·5수화물(copper sulphate pentahydrate, CuSO4·5H2O, 분자량 : 249.68)

4.1.6  탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3, 분자량 : 84.01)

4.1.7  염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl, 분자량 : 53.49)

4.1.8  황산․메탄올용액(10 %)

황산(sulfuric acid, H2SO4, 분자량 : 98.08) 5 mL를 메탄올 45 mL에 녹인다.

4.1.9  탄산수소나트륨포화용액

정제수에 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3, 분자량 : 84.01)을 가하여 포화용액으로 만들어 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  2,4-D와 할로아세틱에시드 표준원액

2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드를 각각 50.0 mg 씩 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 시판되는 표준원액을 사용해도 좋다. 이 용액 1 mL는 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드 1 mg을 함유한다. -10 ℃의 어두운 곳에서 보관하며 2개월 이내에 사용한다.

4.2.2  2,4-D와 할로아세틱에시드 혼합표준용액

2,4-D 표준원액 5 mL, 모노클로로아세틱에시드 표준원액 5 mL, 모노브로모아세틱에시드 표준원액 4 mL를 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드 각각 0.05 mg, 모노브로모아세틱에시드 0.04 mg을 함유한다. -10 ℃의 어두운 곳에서 보관하며 2개월 이내에 사용한다.

4.3  내부표준용액

1,2,3-트리클로로프로판 50.0 mg을 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 이 용액을 메틸삼차-부틸에테르로 40배 희석한다. 이 용액 1 mL는 1,2,3-트리클로로프로판 0.025 mg을 함유한다.

4.4  대체표준용액

2,3-디브로모프로피온산 50.0 mg을 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 이 용액을 메틸삼차-부틸에테르로 100배 희석한다. 이 용액 1 mL는 2,3-디브로모프로피온산 0.01 mg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 증류수로 잘 씻은 갈색유리병과 TFE 재질의 마개를 사용하고 채취 전에 염화암모늄을 100 mg/L가 되도록 넣는다.

5.2  시료는 공간이 없도록 채취한다.

5.3  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관한다.

5.4  모든 시료는 채취 후 14일 이내에 추출하고 추출물을 4 ℃에서 보관 할 때에는 7일 이내에, -10 ℃에서 보관 할 때에는 14일 이내에 분석해야 한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 mg/L ∼ 0.06 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 40 mL를 테프론 마개가 부착된 100 mL 분액깔때기에 취한다.

7.1.2  대체표준용액 20 μL를 넣는다.

7.1.3  황산 2 mL를 넣어 pH를 0.5 이하로 조정한다.

7.1.4  황산구리 2 g 정도를 넣고 녹을 때까지 흔든다.

7.1.5  무수황산나트륨 16 g을 넣고 녹을 때까지 흔든다.

7.1.6  메틸삼차-부틸에테르 5 mL를 넣은 후 약 3분간 격렬히 흔든다.

7.1.7  층이 분리되면 메틸삼차-부틸에테르층을 취한다.

7.1.8  황산․메탄올용액 1 mL를 넣어 50 ℃에서 2시간 동안 반응시킨다.

7.1.9  반응이 끝나면 탄산수소나트륨포화용액 4 mL를 서서히 넣어 중화시킨다.

7.1.10  2분간 원심분리한 다음 메틸삼차-부틸에테르층을 취하여 내부표준용액 10 μL를 넣는다.

7.1.11  위의 용액을 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  2,4-D와 할로아세틱에시드 혼합표준용액을 정제수 40 mL에 농도가 0 μg/L ～ 50 μg/L이 되도록 단계적으로 분액깔때기에 취하고 시료와 같은 방법으로 조작하여 시험한다.

7.2.2  최종용액 2 μL를 주입하여 피크 높이 또는 면적과 각 분석물질의 농도와 내부표준용액과의 관계를 구한다.

7.3  측정법

전처리에서 얻은 시험용액 1 μL ～ 2 μL를 기체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 얻고 7.2의 검량선에서 시험용액 중 2,4-D, 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 522.3, 2003, Determination of haloacetic acids and dalapon in drinking water by liquid-liquid microextraction, derivatization and gas chromatography with electron capture detection

9.2  US EPA Method 551.1, 1995, Determination of chlorination disinfection byproducts, chlorinated solvents, and halogenated pesticides/herbicides in drinking water by liquid-liquid extraction and gas chromatography with electron-capture detection

9.3  Standard Method 6251, 2005, Disinfection by-products: Haloacetic acids and trichlorophenol

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.001 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  2,4-D와 할로아세틱에시드의 기체크로마토그래프 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 질소 1/10 200 ℃ 260 ℃ 각각의 표준물질이 최적조건으로 분리되도록 승온조작

22. 2,4-D와 할로아세틱에시드

-기체크로마토그래프-질량분석법

(2,4-D and Haloacetic Acids-Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 2,4-D와 할로아세틱에시드류의 측정방법으로서, 먹는물 시료를 pH 2 이하가 되도록 황산으로 조절한 후 2,4-D와 할로아세틱에시드류를 메틸삼차-부틸에테르로 추출하여 산성조건 하에 메탄올로 유도체화 시킨 후 기체크로마토그래프로 분리한 다음 질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 280 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 310 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메틸삼차-부틸에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE, C5H12O, 분자량 : 88.15)

바탕시험 할 때 표준물질의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate anhydrous, Na2SO4, 분자량 : 142.04)

4.1.5  황산구리(copper sulphate pentahydrate, CuSO4·5H2O, 분자량 : 249.68)

4.1.6  탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3, 분자량 : 84.01)

4.1.7  염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl, 분자량 : 53.49)

4.1.8  황산․메탄올용액(10%)

황산(sulfuric acid, H2SO4, 분자량 : 98.08) 5 mL를 메탄올 45 mL에 녹인다.

4.1.9  탄산수소나트륨포화용액

정제수에 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3, 분자량 : 84.01)을 가하여 포화용액으로 만들어 사용한다.

4.2  표준용액

4.2.1  2,4-D와 할로아세틱에시드 표준원액

2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드를 각각 50.0 mg 씩 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 시판되는 표준원액을 사용해도 좋다. 이 용액 1 mL는 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드 1 mg을 함유한다. -10 ℃의 어두운 곳에서 보관하며 2개월 이내에 사용한다.

4.2.2  2,4-D와 할로아세틱에시드 혼합표준용액

2,4-D 표준원액 5 mL, 모노클로로아세틱에시드 표준원액 5 mL, 모노브로모아세틱에시드 표준원액 4 mL를 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 100 mL로 한다. 이 용액 1 mL는 2,4-D와 모노클로로아세틱에시드 각각 0.05 mg, 모노브로모아세틱에시드 0.04 mg을 함유한다. -10 ℃의 어두운 곳에서 보관하며 2개월 이내에 사용한다.

4.3  내부표준용액

1,2,3-트리클로로프로판 50.0 mg을 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 이 용액을 메틸삼차-부틸에테르로 40배 희석한다. 이 용액 1 mL는 1,2,3-트리클로로프로판 0.025 mg을 함유한다.

4.4  대체표준용액

2,3-디브로모프로피온산 50.0 mg을 취하여 메틸삼차-부틸에테르에 녹여 50 mL로 한다. 이 용액을 메틸삼차-부틸에테르로 100배 희석한다. 이 용액 1 mL는 2,3-디브로모프로피온산 0.01 mg을 함유한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  미리 증류수로 잘 씻은 갈색유리병과 TFE 재질의 마개를 사용하고 채취 전에 염화암모늄을 100 mg/L가 되도록 넣는다.

5.2  시료는 공간이 없도록 채취한다.

5.3  모든 시료는 시료채취 후 추출하기 전까지 4 ℃ 냉암소에서 보관한다.

5.4  모든 시료는 채취 후 14일 이내에 추출하고 추출물을 4 ℃에서 보관 할 때에는 7일 이내에, -10 ℃에서 보관 할 때에는 14일 이내에 분석해야 한다.

6.0  정보보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 mg/L ∼ 0.06 mg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료 40 mL를 테프론 마개가 부착된 100 mL 분액깔때기에 취한다.

7.1.2  대체표준용액 20 μL를 넣는다.

7.1.3  황산 2 mL를 넣어 pH를 0.5 이하로 조정한다.

7.1.4  황산구리 2 g 정도를 넣고 녹을 때까지 흔든다.

7.1.5  무수황산나트륨 16 g을 넣고 녹을 때까지 흔든다.

7.1.6  메틸삼차-부틸에테르 5 mL를 넣은 후 약 3분간 격렬히 흔든다.

7.1.7  층이 분리되면 메틸삼차-부틸에테르층을 취한다.

7.1.8  황산․메탄올용액 1 mL를 넣어 50 ℃에서 2시간 동안 반응시킨다.

7.1.9  반응이 끝나면 탄산수소나트륨포화용액 4 mL를 서서히 넣어 중화시킨다.

7.1.10  2분간 원심분리한 다음 메틸삼차-부틸에테르층을 취하여 내부표준용액 10 μL를 넣는다.

7.1.11  위의 용액을 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  2,4-D와 할로아세틱에시드 혼합표준용액을 정제수 40 mL에 농도가 0 μg/L ～ 50 μg/L이 되도록 단계적으로 분액깔때기에 취하고 시료와 같은 방법으로 조작하여 시험한다.

7.2.2  최종용액 2 μL를 주입하여 피크 높이 또는 면적과 각 분석물질의 농도와 내부표준용액과의 관계를 구한다.

7.3  측정법

전처리에서 얻은 시험용액 1 μL ～ 2 μL를 기체크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 얻고 7.2의 검량선에서 시험용액 중 2,4-D, 모노클로로아세틱에시드, 모노브로모아세틱에시드의 양을 구하여 시료 중의 농도를 측정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  US EPA Method 552.3, 2003, Determination of haloacetic acids and dalapon in drinking water by liquid-liquid microextraction, derivatization, and gas chromatography with electron capture detection

9.2  Standard Method 6251, 2005, Disinfection by-products: Haloacetic acids and trichlorophenol

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.001 mg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  2,4-D와 할로아세틱에시드의 기체크로마토그래프-질량분석기 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 분획비 주입구 온도 인터페이스 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 1/10 200 ℃ 250 ℃ 각각의 표준물질이 최적조건으로 분리되도록 승온조작

표 3.  2,4-D와 할로아세틱에시드의 각 물질별 선택이온

물 질 명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 모노클로로아세틱에시드 모노브로모아세틱에시드	221.04 94.50 138.95	175 77 93	199, 236 59, 108 59, 95

14.1                 먹는물수질감시항목 시험방법

23. 지오스민 및 2-MIB

-용매추출/기체크로마토그래프-질량분석법

(Geosmin & 2-MIB-Liquid Extraction/Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 조류에 기인하여 발생하는 주요 냄새물질인 지오스민, 2-MIB를 n-Hexane으로 추출․농축한 후 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 250 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 280 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  무수황산나트륨(sodium sulfate, Na2SO4, 분자량 : 58.44)

순도 98 % 이상의 시약용을 사용하며 사용하기 전에 300 ℃에서 하루 밤 구워서 사용한다.

4.1.4  염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.5  n-헥산 : HPLC 급

n-헥산(n-Hexane, C6H14, 분자량 : 86.17)은 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.6  아스코르빈산나트륨(sodium L-ascorbate, C6H7NaO6, 분자량 : 198.10)

4.2  표준용액

4.2.1  지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L)

지오스민, 2-MIB 표준물질 10 mg을 정확히 취하여 메탄올 10 mL에 녹인다. 이 용액은 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 4 ℃에서 냉장보관하고, 4주일 이내에 사용한다. 시판하는 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  지오스민, 2-MIB 혼합표준용액(100 mg/L)

지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L) 1 mL를 10 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 표선까지 채운다.

4.2.3  내부표준용액(1 mg/L)

1,2-디클로로벤젠-d4 10 mg을 10 mL의 메탄올에 녹인 다음 1,000 배 희석하여 사용한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  시료는 미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 기포가 발생하지 않게 가득 채워서 밀봉하고 가능한 빨리 실험한다.

5.2  즉시 시험이 가능하지 않은 경우는 냉장 보관하여야 하며, 잔류염소를 포함하고 있는 경우는 아스코르빈산나트륨을 0.01 g ～ 0.02 g을 넣어 잔류염소를 제거하도록 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 μg/L ～ 0.02 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  시료와 표준용액을 냉장고에서 꺼내어 상온에서 방치한다.

7.1.2  시료 100 mL를 취하여 250 mL 분액 깔대기에 넣은 후 내부표준용액 10 μL를 넣는다.

7.1.3  염석효과를 위해 염화나트륨 40 g을 넣고 흔들어 녹인 후 n-헥산 5 mL를 넣고 약 2분간 격렬히 흔들어 두 층이 분리되면 물 층을 버리고 n-헥산 층을 취한다.

7.1.4  n-헥산에 무수황산나트륨 약 1 g을 넣어 수분을 제거한다.

7.1.5  회전증발농축기를 사용하여 500 μL까지 농축하여 이를 시험용액으로 한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 100 mL를 취하여 250 mL 분액 깔대기에 넣은 후 지오스민, 2-MIB 혼합표준용액(100 mg/L)을 0.002 μg/L ～ 0.02 μg/L까지 단계적으로 첨가하고, 내부표준용액(1 mg/L)을 정확히 10 μL를 취하여 첨가한다. 필요에 따라 사용하는 표준용액의 농도와 배수를 달리 할 수 있다.

7.2.2  이하추출 방법은 7.1.2 ～ 7.1.5에 따른다.

7.2.3  지오스민, 2-MIB 각각의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

[주 1]  피크의 면적 대신 피크의 높이를 사용할 수 있으나 피크 면적을 사용하는 것이 바람직하다.

7.3  측정법

7.3.1  추출액 2 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  기체크로마토그래프/질량분석기로부터 얻은 크로마토그램에서 각 분석성분 및 내부표준물질의 머무름 시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크의 면적을 구한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  국립환경과학원, 2006, 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 관리방안 연구 (Ⅰ)

9.2  서울시상수도사업본부, 2001, 맛․냄새 물질의 표준분석법 개발에 관한 연구

9.3  일본수도협회, 2002, 상수시험방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.001 μg/L ∼ 0.002 μg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  지오스민, 2-MIB의 기체크로마토그래피 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 (유속) 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 (0.9 mL/min) 5 : 1 280 ℃ 280 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 5 15 65 5 15 215 0 30 300 3

표 3.  지오스민, 2-MIB의 각 물질별 특성이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
Geosmin	182.31	112	125, 97
2-Methylisoborneol	168.00	95	108, 135

그림 1. 지오스민, 2-MIB의 GC-MS 크로마토그램(예)

표 4.  지오스민, 2-MIB의 머무름 시간(예)

물질명	분 (min)
지오스민	19.67
2-MIB	17.15
내부표준물질	14.59

지오스민

2-MIB

그림 2. 지오스민, 2-MIB의 질량스펙트럼

24. 지오스민 및 2-MIB

-고상추출/기체크로마토그래프-질량분석법

(Geosmin & 2-MIB-Solid Phase Extraction/Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 먹는물 중 조류에 기인하여 발생하는 주요 냄새물질인 지오스민, 2-MIB를 고상으로 충진 된 흡착제에 흡착시킨 후 적절한 추출용매를 사용하여 성분을 용출하고 불순성분들을 제거하여 용출․농축 한 후 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석하는 방법이다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 200 ℃ ～ 250 ℃, 컬럼온도는 40 ℃ ～ 280 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.1.3  기체크로마토그래프의 조건은 표 2와 같이 수행할 수 있다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  고상분리관

Sep-Pack C18(옥타데실기를 화학결합 시킨 실리카겔 충진, 500 mg) 고상분리관 또는 이와 동등 이상의 성능을 지닌 것을 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2, 분자량 : 84.94)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  아스코르빈산나트륨(sodium L-ascorbate, C6H7NaO6, 분자량 : 198.10)

4.2  표준용액

4.2.1  지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L)

지오스민, 2-MIB 표준물질 10 mg을 정확히 취하여 메탄올 10 mL에 녹인다. 이 용액은 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 4 ℃에서 냉장보관하고, 4주일 이내에 사용한다. 시판하는 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  지오스민, 2-MIB 혼합표준용액(100 mg/L)

지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L) 1 mL를 10 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 표선까지 채운다.

4.2.3  내부표준용액(1 mg/L)

1,2-디클로로벤젠-d4 10 mg을 10 mL의 메탄올에 녹인 다음 1,000 배 희석하여 사용한다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  시료는 미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 기포가 발생하지 않게 가득 채워서 밀봉하고 가능한 빨리 실험한다.

5.2  즉시 시험이 가능하지 않은 경우는 냉장 보관하여야 하며, 잔류염소를 포함하고 있는 경우는 아스코르빈산나트륨을 0.01 g ～ 0.02 g을 넣어 잔류염소를 제거하도록 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 μg/L ～ 0.02 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  고상분리관에 디클로로메탄 5 mL, 메탄올 5 mL와 증류수 5 mL를 순차적으로 가압․주입하여 고상분리관을 활성화 시킨다.

7.1.2  시료 500 mL에 내부표준용액(1 mg/L) 50 μL를 주입한 다음 매분 10 mL ～ 20 mL의 유속으로 흘려보낸 후, 원심분리에 의해 남아있는 고상컬럼의 수분을 제거한다.

7.1.3  고상분리관 건조 후 디클로로메탄 2 mL를 사용하여 목적성분을 추출한 다음 질소가스로 서서히 0.5 mL 이하까지 농축하여 시험용액으로 사용한다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  지오스민과 2-MIB 혼합표준용액(100 mg/L)을 증류수 500 mL에 0.002 μg/L ～ 0.02 μg/L까지 단계적으로 첨가하고, 내부표준용액(1 mg/L)을 50 μL 첨가하여 7.1.2 ～ 7.1.3의 방법으로 분석한다.

7.2.2  지오스민, 2-MIB 각각의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

[주 1]  피크의 면적 대신 피크의 높이를 사용할 수 있으나 피크 면적을 사용하는 것이 바람직하다.

7.3  측정법

7.3.1  추출액 2 μL를 취하여 기체크로마토그래프에 주입하여 분석한다.

7.3.2  기체크로마토그래프/질량분석기로부터 얻은 크로마토그램에서 각 분석성분 및 내부표준물질의 머무름 시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크의 면적을 구한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  국립환경과학원, 2006, 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 관리방안 연구 (Ⅰ)

9.2  서울시상수도사업본부, 2001, 맛․냄새 물질의 표준분석법 개발에 관한 연구

9.3  일본수도협회, 2002, 상수시험방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.001 μg/L ∼ 0.002 μg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  지오스민, 2-MIB의 기체크로마토그래피 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 (유속) 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 (0.9 mL/min) 5 : 1 280 ℃ 280 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 5 15 65 5 15 215 0 30 300 3

표 3.  지오스민, 2-MIB의 각 물질별 특성이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
Geosmin	182.31	112	125, 97
2-Methylisoborneol	168.00	95	108, 135

그림 1. 지오스민, 2-MIB의 GC-MS 크로마토그램(예)

표 4.  지오스민, 2-MIB의 머무름 시간(예)

물질명	분 (min)
지오스민	19.67
2-MIB	17.15
내부표준물질	14.59

지오스민

2-MIB

그림 2. 지오스민, 2-MIB의 질량스펙트럼

25. 지오스민 및 2-MIB

-HS-SPME/기체크로마토그래프-질량분석법

(Geosmin & 2-MIB-Headspace-Solid Phase Micro Extraction/Gas Chromatograph-Mass Spectrometry)

1.0  개요

이 시험방법은 HS-SPME법을 사용하여 시료를 추출하고 화이버를 직접 기체크로마토그래프에 주입하여 열 탈착시켜 분석하는 방법이다. 즉, 시료 추출, 정제와 농축이 동시에 이루어지고 직접 기체크로마토그래프로 주입되기 때문에 자동화가 용이하여 기존의 전처리방법에 비해 상대적으로 높은 감도와 분석 조작이 간단한 특징이 있다.

2.0  적용범위

이 시험방법은 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 측정에 적용한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  기체크로마토그래프

3.1.1  컬럼은 안지름 0.20 mm ～ 0.35 mm, 필름두께 0.1 μm ～ 0.50 μm, 길이 15 m ～ 60 m의 cross-linked methylsilicon (DB-1, HP-1 등) 또는 cross-linked 5 % phenylmethylsilicon (DB-5, HP-5 등) 등의 모세관이나 동등한 분리성능을 가진 모세관으로 대상 분석 물질의 분리가 양호한 것을 택하여 시험한다.

3.1.2  운반기체는 부피백분율 99.999 % 이상의 헬륨 또는 질소로서 유량은 0.5 mL/min ～ 4 mL/min, 시료도입부 온도는 120 ℃ ～ 250 ℃, 컬럼온도는 30 ℃ ～ 250 ℃로 승온조작하여 사용한다.

3.2  질량분석기(mass spectrometer)

3.2.1  이온화방식은 전자충격법(EI, electron impact)을 사용하며 이온화에너지는 35 eV ～ 70 eV를 사용한다.

3.2.2  질량분석기는 자기장형(magnetic sector), 사중극자형(quardrupole) 및 이온트랩형(ion trap) 등의 성능을 가진 것을 사용한다.

3.2.3  정량분석에는 선택이온검출법(SIM, selected ion monitoring)을 이용하는 것이 바람직하다. 선택하는 이온들은 표 3의 이온을 사용할 수 있다.

3.3  SPME (Solid Phase Micro Extraction)

화이버는 2 cm - 50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS 또는 이와 동등 이상의 성능을 지닌 것을 사용한다.

4.0  시약 및 표준용액

4.1  시약

4.1.1  정제수

시약용 정제수를 사용하거나, 순수제조장치로 정제된 물을 사용한다. 단, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.2  메탄올(methanol, CH3OH, 분자량 : 32.04)

바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.3  염화나트륨

염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.44)은 450 ℃ 전기로에서 4 시간 ～ 5 시간 구운 것을 사용하며, 바탕시험 할 때 분석화합물의 피크 부근에 불순물 피크가 없는 것을 사용한다.

4.1.4  아스코르빈산나트륨(sodium L-ascorbate, C6H7NaO6, 분자량 : 198.10)

4.2  표준용액

4.2.1  지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L)

지오스민, 2-MIB 표준물질 10 mg을 정확히 취하여 메탄올 10 mL에 녹인다. 이 용액은 여러 개의 바이알에 공기층이 남지 않도록 나누어 넣은 다음 밀봉하여 4 ℃에서 냉장보관하고, 4주일 이내에 사용한다. 시판하는 표준용액을 사용할 수 있다.

4.2.2  지오스민, 2-MIB 혼합표준용액(10 mg/L)

지오스민, 2-MIB 혼합표준원액(1,000 mg/L) 1 mL를 100 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올로 표선까지 채운다.

4.2.3  내부표준용액 (0.01 mg/L)

1,2-디클로로벤젠-d4 10 mg을 10 mL의 메탄올에 녹여 1,000 mg/L의 내부표준용액을 만든 다음 단계적으로 희석하여 0.01 mg/L가 되도록 내부표준용액을 만든다.

5.0  시료채취 및 관리

5.1  시료는 미리 질산 및 증류수로 씻은 유리병에 기포가 발생하지 않게 가득 채워서 밀봉하고 가능한 빨리 실험한다.

5.2  즉시 시험이 가능하지 않은 경우는 냉장 보관하여야 하며, 잔류염소를 포함하고 있는 경우는 아스코르빈산나트륨을 0.01 g ～ 0.02 g을 넣어 잔류염소를 제거하도록 한다.

6.0  정도보증/정도관리(QA/QC)

6.1  방법검출한계 및 정량한계

6.1.1  방법검출한계(method detection limit) 및 정량한계(minimum quantitation limit)는 정제수에 정량한계 부근의 농도가 되도록 첨가한 7개의 시료를 준비하고 7.0항의 실험절차와 동일하게 분석하여 표준편차를 구한다.

6.1.2  표준편차에 3.14를 곱한 값을 방법검출한계로, 10을 곱한 값을 정량한계로 나타낸다. 측정한 방법검출한계는 시험방법에서 제시한 정량한계 이하이어야 한다.

6.2  방법바탕시료의 측정

시료군마다 1개의 방법바탕시료(method blank)를 측정한다. 방법바탕시료는 정제수를 사용하여 7.0항의 실험절차와 동일하게 전처리․측정하며 측정값은 방법검출한계 이하이어야 한다.

6.3  검정곡선의 작성 및 검증

6.3.1  정량범위 내 5개의 농도에 대해 검정곡선을 작성하고 얻어진 검정곡선의 결정계수(R2)가 0.98 이상 또는 감응계수의 상대표준편차가 25 % 이내이어야 하며 결정계수나 감응계수의 상대표준편차가 허용범위를 벗어나면 재작성한다.

6.3.2  검정곡선의 직선성을 검증하기 위하여 검정곡선을 작성할 때에는 정량범위를 0.001 μg/L ～ 0.02 μg/L로 한다. 그러나 측정값이 이 농도범위를 벗어날 경우에는 시료를 묽혀서 다시 분석한다.

6.3.3  검정곡선의 감응계수를 검증하기 위하여 검정곡선의 중간 농도에서 한 농도를 선택하여 감응계수를 구하여 그 값의 변화가 25 % 이내에서 일치하여야 한다. 만약 이 범위를 넘는 경우, 검정곡선을 재작성한다.

6.4  정확도 및 정밀도

6.4.1  정밀도(precision) 및 정확도(accuracy)의 측정은 먹는물수질공정시험기준 ES 05001.a 정도보증/정도관리에 따른다. 정제수에 정량한계 농도의 10배가 되도록 동일하게 표준물질을 첨가한 시료 4개 이상 준비하고, 7.0항의 절차와 동일하게 측정하여 평균값과 표준편차를 구한다.

6.4.2  정확도는 인증시료를 확보할 수 있는 경우 인증표준물질을 분석한 결과값과 인증값과의 상대백분율로 나타내고, 인증시료를 확보할 수 없는 경우 이를 정확한 농도로 첨가한 시료로 대체한다. 이 때 정확도는 첨가시료를 분석한 농도와 첨가하지 않은 시료를 분석한 농도와의 차이에 대한 첨가농도의 상대백분율로서 나타내며 그 값이 75 % ～ 125 % 이내이어야 한다.

6.4.3  정밀도는 측정값의 상대표준편차(RSD)로 계산하며 측정값이 25 % 이내이어야 한다.

6.5  현장 이중시료의 측정

현장 이중시료(field duplicate sample)는 동일한 장소에서 동일한 조건으로 중복 채취한 시료로서 한 조사팀이 하루에 20개 이하를 채취할 경우에는 1개를 그리고 그 이상을 채취할 때에는 시료 20개당 1개를 추가로 채취한다. 동일한 조건의 두 시료간의 측정값의 편차는 25 % 이하이어야 한다.

6.6  내부정도관리 주기 및 목표

6.6.1  방법검출한계, 정량한계, 정밀도 및 정확도는 연 1회 이상 산정하는 것을 원칙으로 하며, 분석자의 교체, 분석 장비의 수리 및 이동 등의 주요 변동사항이 생길 경우에는 다시 실시한다. 단, 장비의 청소, 컬럼 교체 시와 측정 장비의 감도가 의심될 때에는 언제든지 측정하여 확인하여야 한다.

6.6.2  검정곡선 검증 및 시약바탕시료의 분석은 각 시료군마다 실시하며, 고농도의 시료 다음에는 시약바탕시료를 측정하여 오염여부를 점검한다.

6.6.3  각 정도관리 항목에 대한 정도관리 목표 값은 표 1과 같다.

7.0  분석절차

7.1  전처리

7.1.1  화이버를 270 ℃에서 1 시간 이상 헬륨가스를 흘려 활성화한다.

7.1.2  20 mL 바이알에 시료 10 mL와 정제된 염화나트륨 3 g을 넣는다.

7.1.3  시료에 내부표준용액(0.01 mg/L) 50 μL를 첨가한 후 70 ℃, 400 rpm으로 교반하면서 SPME 화이버에 30분간 흡착시킨다.

7.2  검정곡선의 작성

7.2.1  정제수 10 mL에 지오스민과 2-MIB 혼합표준용액(10 mg/L)을 0.002 μg/L ～ 0.02 μg/L까지 단계적으로 첨가하고 내부표준용액(0.01 mg/L) 50 μL를 첨가한다.

7.2.2  이하 추출방법은 7.1.1～7.1.3에 따른다.

7.2.3  지오스민, 2-MIB 각각의 농도(Cx)를 취하여 가로축(x 축)에, 각 분석화합물의 피크 면적(Ax)과 내부표준물질의 피크면적(Ai)과의 비(Ax/Ai)를 세로축(y 축)에 취하여 검정곡선을 작성한다.

[주 1]  피크의 면적 대신 피크의 높이를 사용할 수 있으나 피크 면적을 사용하는 것이 바람직하다.

7.3  측정법

7.3.1  흡착시킨 시료를 270 ℃, 4분간 탈착시켜 기체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

7.3.2  기체크로마토그래프/질량분석기로부터 얻은 크로마토그램에서 각 분석성분 및 내부표준물질의 머무름 시간에 해당하는 위치의 피크들로부터 피크의 면적을 구한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  참고자료

9.1  Steven W. Lloyd et al. “Rapid analysis of Geosmin and 2-methylisobonral in water using solid phase micro extraction procedures”, Water Research vol 32, NO.7(1998), 2140-2146

9.2  Tsair-Fuh Lin et al. “Effect of residual chlorine on the analysis of Geosmin, 2-MIB and MTBE in drinking water using the SPME technique”, Water Research vol 37 (2003) 21-26.

9.3  국립환경과학원, 2006, 먹는물 중 지오스민, 2-MIB의 관리방안 연구 (Ⅰ)

9.4  서울시상수도사업본부, 2001, 맛․냄새 물질의 표준분석법 개발에 관한 연구

9.5  일본수도협회, 2002, 상수시험방법

10.0  부록

표 1.  정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계	0.001 μg/L ∼ 0.002 μg/L
검정곡선	결정계수(R2) ≥ 0.98 또는 감응계수(RF)의 상대표준편자 ≤ 25 %
정밀도	상대표준편차가 ± 25 % 이내
정확도	75 % ∼ 125 %
현장이중시료	상대편차백분율이 ± 25 % 이내

표 2.  지오스민, 2-MIB의 기체크로마토그래피 실험조건(예)

항 목	조 건
컬럼 운반기체 (유속) 분획비 주입구 온도 검출기 온도 오븐 온도	Ultra-2 (Cross-linked 5 % Phenylmethylsilicon, 25 m × 0.2 mm I.D × 0.33 μm, film thickness) 헬륨 (0.9 mL/min) 10 : 1 270 ℃ 280 ℃ 초기온도 초기시간 승온속도 최종온도 시간 (℃) (min) (℃/min) (℃) (min) 40 5 15 65 5 15 215 0 30 300 3

표 3.  지오스민, 2-MIB의 각 물질별 특성이온

물질명	분자량	제1선택이온 (m/z)	제2선택이온 (m/z)
Geosmin	182.31	112	125, 97
2-Methylisoborneol	168.00	95	108, 135

그림 1. 지오스민, 2-MIB의 GC-MS 크로마토그램(예)

표 4.  지오스민, 2-MIB의 머무름 시간(예)

물질명	분 (min)
지오스민	19.67
2-MIB	17.15
내부표준물질	14.59

지오스민

2-MIB

그림 2. 지오스민, 2-MIB의 질량스펙트럼

26. 부식성지수-랑게리아지수(LI)

(Corrosion Index-Langelier Index, LI)

1.0  개요

1.1  목적

랑게리아지수는 일반적으로 물에서 스케일 형성과 스케일 용해를 평가하기 위하여 탄산칼슘 침전이나 용해 경향을 나타내는 지수이다. 물이 CaCO3에 대하여 과포화, 포화 또는 불포화인지를 결정하며 수도관에 대한 수돗물 부식성 지표로 사용되어 관의 부식제어에 유용하고 관과 부식제어 프로그램에 활용된다.

1.2  제한

일반적으로 CaCO3은 과포화된 물에서 침전하며 불포화된 물에서는 침전할 수 없고 과포화된 물의 경우에도 인산염(특히 다인산염)이나 자연적기원의 유기물 및 마그네슘 등의 존재 시 CaCO3 침전이 방해될 수 있다. 탄산칼슘 포화지수 계산에 포함되지 않으나 용존산소, 완충능력, 염소이온, 황산이온, 유속과 같은 수질 특성도 부식에 영향을 미칠 수 있다.

1.3  적용범위

이 시험방법은 먹는물의 원수나 처리수 중에 랑게리아 지수 분석에 적용한다. 최소 분석항목은 총알칼리도, 칼슘, pH와 온도이다. 이온강도는 전기전도도 또는 총용존고형물 측정으로 평가할 수 있다. 본 시험방법에서는 전기전도도를 이용한 방법을 적용하였다.

2.0  랑게리아지수 결정인자 시험방법

2.1  수소이온농도

먹는물수질공정시험기준 ES 05306.1a 수소이온농도-유리전극법에 따른다.

2.2  알칼리도

KS I ISO 9963-1 수질-알칼리도 측정방법(합성알칼리도 및 총알칼리도 측정방법) 중 총알칼리도 측정방법에 따른다.

2.3  칼슘

KS I ISO 7980 수질-칼슘 및 마그네슘 측정방법-원자흡광광도법 또는 KS I ISO 11885 수질-유도결합플라즈마 원자발광분광법(ICP-OES)에 의한 선택 원소 측정방법에 따른다.

2.4  전기전도도

수질오염공정시험기준 ES 04310.1 전기전도도 또는 KS I ISO 7888 수질-전기전도도 측정방법에 따른다.

2.5  랑게리아지수(LI) 계산

2.5.1  계산식

탄산칼슘 포화지수 LI는 식 (1)과 같이 계산된다.

LI = pH -pHs                               (식 1)

여기서 pH = 측정값

pHs = 칼슘이온과 중탄산이온 존재하에 CaCO3평형일때 pH

2.5.2  세부인자 계산

pHs는 식 (2)와 같이 계산한다.

pHs = pK2 - pKs + p[Ca2+] + p[HCO3-] + 5 pfm              (식 2)

[HCO3-]는 다음 식 (3)과 같이 계산한다.

[eqn: [HCO _{3} ^{-} ]````=` {Alk _{t``} -Alk _{o} ``+``10 ^{(pf _{m} -pH)} ``-``10 ^{(pH`+pf _{m} -pK _{w} )}} over {1``+``0.5``` TIMES ``10 ^{(pH-pK _{2} )}}]               (식 3)

여기서, Alkt = 탄산의 종말 적정점에 의해 결정되는 총알칼리도, g-equivalents/L

Kw = 수온에 따른 물의 해리상수

Alko = NH30, H3SiO4-, HPO42-, B(OH)4-, CH3COO-, HS-, CaHCO3+와 MgOH+ 같은 이온쌍에 의한 알칼리도를 말한다. 이들은 보통 HCO3-, CO32-, OH-, H+ 성분들보다 작은 값을 나타낸다.

보통 알칼리도가 50 mg/L 이상으로 대략 중성(pH 6.0에서 8.5)의 물에서 식 (3)의 [eqn: 10 ^{(pH+pf _{m} -pK _{w} )}]는 무시할 수 있으며 Alko는 보통 계산에서 무시한다. 따라서 식 (2)를 단순화하면 식 (4)와 같이 정리할 수 있다.

pHs = pK2 - pKs + p[Cat] + p[Alkt] + 5 pfm                (식 4)

여기서, K2 = 각 수온에서 탄산에 대한 두 번째 해리 상수

Ks = 각 수온에서 CaCO3에 대한 용해 생성물 상수

[Cat] = 칼슘이온 농도, g-moles/L

[Alkt] = 알칼리도, g-equivalents/L

fm = 특정 온도에서 1가 물질에 대한 활성계수

각 식에서 p는 -log10을 나타낸다. pK2, pKs와 pfm의 값은 표 1을 참조한다. 온도 조건에 따라 pK2와 pKs값은 표 2를 참고할 수 있다. 방해석(Calcite), 알고나이트(Argonite), 바테라이트(Vaterite) 각각은 다소 다른 용해도를 가지고 있다. 담수에서 가장 많이 발견되는 일반적인 탄산칼슘의 형태는 방해석이다.

3.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

4.0  참고자료

4.1  Standard Methods 2330, 2005, Calcium carbonate saturation

5.0  부록

표 1.  평형상수와 활동계수 평가

계 산 식			온도범위	비 고
I (이온 강도)	I=1.6×10-5 C (C: 전기전도도) or I=TDS/40000			전기전도도 측정법
pfm = A] (I < 0.5일 때)
A = 1.82×10-6(ET)-1.5
E =
pK2 = 107.8871+0.03252849T-5151.79/T-38.92561log10T + 563713.9/T2			273-373
pKw = 4471/T+0.01706T-6.0875			280-338
pKsc = 171.9065+0.077993T-2839.319/T-71.595 log10T			273-363
pKsa = 171.9773+0.077993T-2903.293/T-71.595 log10T			273-363
pKsv = 172.1295+0.077993T-3074.688/T-71.595 log10T			273-363
※ C= conductivity p= -log10 of the value of any factor fm = activity coefficient for monovalent species E = dielectric constant T = temperature, oK(℃+273.2)		K2= second dissociation constant for carbonic acid Kw= dissociation constant for water Ksa= solubility product constant for calcite Ksa= solubility product constant for aragonite Ksv=solubility product constant for vaterite

표 2.  특정 온도에서 pK와 AT의 예상 값

수온(℃)		pKs
	pK2	Calcite	Argonite	Vaterite	pKw	A
5	10.55	8.39	8.24	7.77	14.73	0.494
10	10.49	8.41	8.26	7.80	14.53	0.498
15	10.43	8.43	8.28	7.84	14.34	0.502
20	10.38	8.45	8.31	7.87	14.16	0.506
25	10.33	8.48	8.34	7.91	13.99	0.511
30	10.29	8.51	8.37	7.96	13.83	0.515
35	10.25	8.54	8.41	8.00	13.68	0.520
40	10.22	8.58	8.45	8.05	13.53	0.526
45	10.20	8.62	8.49	8.10	13.39	0.531
50	10.17	8.66	8.54	8.16	13.26	0.537
60	10.14	8.76	8.64	8.28	13.02	0.549
70	10.13	8.87	8.75	8.40	-	0.562
80	10.13	8.99	8.88	8.55	-	0.576
90	10.14	9.12	9.02	8.70	-	0.591
참고 : 모든 값은 표 1의 공식으로 계산한 결과이다. A는 pfm을 계산하는데 이용된다(표 1). pfm은 25℃일 때 TDS값으로 구할 수 있으며 다음과 같다.
		TDS		pfm
		100		0.024
		200		0.033
		400		0.044
		800		0.060
		1000		0.066

부식성지수 계산(예)

부식성지수를 계산하기 위해서 시료의 pH, 수온, 알칼리도, 전기전도도 및 Ca2+ 측정값이 필요하며, 그 값이 아래와 같을 때 부식성지수의 계산 과정은 다음과 같다.

pH 7.3, 수온 23.7 ℃, 알칼리도 35.2 mg/L, 전기전도도 120.9 μS/cm, Ca2+ 13.3 mg/L

LI = pH - pHs

LI = pH - (pK2 - pKsc + p[Cat] + p[Alkt] + 5 pfm)

① pK2 = 107.8871+0.03252849T-5151.79/T-38.92561log10T + 563713.9/T2

= 107.8871+(0.03252849*296.85)-(5151.79/296.85)-(38.92562*2.47)+(563713.9/296.852)

= 10.34

T(K) = 수온 + 273.15 = 296.85

② pKsc =  171.9065+0.077993T-2839.319/T-71.595 log10T

= 171.9065+(0.077993*296.85)-(2839.319/296.85)-71.595*2.47)

= 8.47

③ p[Cat] = -log10(Ca2+)

= -log10(13.3/40000)

= 3.48

④ p[Alkt] = -log10(Alkalinity)

= log10(35.2/50000)

= 3.15

⑤ pfm = A ]

A = 1820000*(EK)-1.5

= 1820000×(E×296.85)-1.5

= 0.509639

E =

=

= 78.705

I = 1.6×10-5×C

= 1.6×10-5×120.9

= 0.0019

5pfm = 5 × [0.509639×(0.00190.5/ (1+0.00190.5)

-0.3×0.0019)]

= 5 × 0.021

= 0.10

LI = pH - (pK2 - pKs + p[Cat] + p[Alkt] + 5 pfm)

= 7.34 - (10.34 - 8.47 + 3.48 + 3.15 + 0.10)

= 7.34 - 8.60

= -1.26

27. 노로바이러스

(Method for norovirus in groundwater)

1.0  개요

1.1  목적

이 시험방법은 지하수나 하천수 등 물에 존재하는 노로바이러스를 분석함에 있어 정확하고 통일성 있는 검사결과를 기하기 위해 필요한 제반사항에 대하여 규정함을 목적으로 한다.

1.2  적용범위

본 시험방법은 지하수, 하천수, 호소수 등 환경수에 대한 노로바이러스 시험에 적용한다.

1.3  주의사항

본 시험방법에 의해 채취된 시료는 10 ℃ 이하의 냉장보관상태로 운반되어져야 하며, 시료채취 시간부터 48시간 이내에 전처리(탈리 및 농축)를 수행하여야 한다. 전처리된 시료는 냉동상태에서 장기간 보관이 가능하나 가급적 72시간 이내에 유전자 분석을 실시하여야 한다. 또한 본 실험방법의 결과는 유전자분석에 기초한 것으로 노로바이러스가 검출되더라도 감염성 여부는 판단 할 수 없다.

시료채취 도구 준비 시 주의사항으로는 시료채취에 사용되는 도구들은 각 부품의 재질에 따라 시료채취 작업 이전에 미리 소독 또는 고압멸균 하여야한다. 특히 반복되어 사용되는 부품들로부터 노로바이러스 유전자 조각의 오염방지를 위하여 가급적 고압멸균을 하는 것이 바람직하며, 이를 위해 각 부품을 고압증기멸균이 가능한 스테인레스 재질 등으로 대체할 수 있다. 또한 채취에 사용되는 튜브 등은 멸균 가능한 재질이나 일회용을 사용하는 것을 권장한다.

시료전처리 및 유전자분석 시 주의사항은 탈리와 농축과정에 사용되는 비커, 플라스크, 원심분리관, 주사기, 시료보관용기 등은 반드시 고압증기멸균하여 노로바이러스 오염을 방지하고 고압증기멸균을 할 수 없는 재질은 멸균된 일회용품을 사용하는 등 실험조작 및 사용되는 용기에 의한 노로바이러스 유전자 오염에 주의하여야한다.

유전자분석에 사용되는 피펫 팁은 오염을 방지하기 위하여 필터가 부착된 멸균된 1회용 팁을 사용한다. 또한 위양성 및 위음성 여부를 판단하기 위해 대조군을 함께 분석하여야한다.

기타 실험에 의한 오염을 방지하기 위하여 유전자 증폭과 전기영동 실험 공간을 분리하고, 생물안전캐비넷 등 장비 등을 갖추어야 한다.

2.0  용어정의

2.1  노로바이러스란 사람감염성 노로바이러스(human norovirus)로 물속에 존재하는 감염성 바이러스 입자 및 비감염성 입자 또는 유전자를 의미한다.

2.2  시료채취란 지하수, 하천수, 호소수 등에서 여과장치를 이용하여 시료(물)를 여과하는 것을 말한다.

2.3  전처리란 시료채취된 여과지로부터 노로바이러스를 탈리하고 탈리된 시료를 농축시료로 만드는 과정을 말한다.

2.4  유전자분석이란 농축시료로부터 노로바이러스 유전자를 추출하여 PCR 등의 유전자 증폭방법으로 노로바이러스 유전자를 특이적으로 증폭하여 검출하고, 서열분석을 통해 확인하는 과정을 말한다.

3.0  분석기기 및 기구

3.1  시료채취를 위한 장비 및 기구

3.1.1  표준필터장치 조립용 부품

표준필터장치(standard filter apparatus)는 전필터(prefilter), 탈염소화 또는 pH의 조정이 필요할 때 이외에는 모든 시료채취에 사용된다.

3.1.1.1  BR 1개 - Backflow Regulator

3.1.1.2  SF 1개 - Swivel Female insert with garden hose thread

3.1.1.3  BT 3 조각 - Braided Tubing, 1/2" clear

3.1.1.4  HC1 6개 - Hose Clamp

3.1.1.5  HF1 1개 - Hose Fitting, nylon, 3/8" male NPT x 1/2" tubing ID

3.1.1.6  PR 1개 - Pressure Regulator

3.1.1.7  PN 1개 - PVC Nipple, 3/8" male NPT (263A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다.)

3.1.1.8  TE 1개 - PVC TEE with 3/8" female NPT ports (63A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다.)

3.1.1.9  RB1 1개 - Reducing Bushing, 3/8" NPT(M) × 1/4" NPT(F) (63A regulator를 사용할 때는 이 부품이 필요하지 않다.)

3.1.1.10  PG 1개 - Pressure Gauge, 0-30 pound per square inch (263A regulator를 사용할 때는 이 부품을 1/4" gauge port에 연결한다.)

3.1.1.11  RA 1개 - Reducing Adaptor, 1/2" female NPT × 3/8" male NPT

3.1.1.12  MQ1 1개 - Male Quick Connect, 1/2" NPT (hose fittings와 braided tubing의 연결이 적절하면 quick connects를 사용하지 않아도 좋다.)

3.1.1.13  FQ1 2개 - Female Quick Connects,  1/2" female NPT

3.1.1.14  RN1 2개 - Reducing Nipples, 3/4" male NPT × 1/2" male NPT

3.1.1.15  CH 1개 - Cartridge Housing with wench

3.1.1.16  FC 1개 - Filter Cartridge, positively charged virus filter

3.1.1.17  MQ2 1개 - Male Quick Connect, 1/2" female NPT

3.1.1.18  HF2 1개 - Hose Fitting, 1/2" male NPT × 1/2" tubing ID

3.1.1.19  WM 1개 - Water Meter. 유량계는 수평의 위치에서 사용되어야 하며 추위에 의해 동파되지 않도록 잘 보호해야 한다. 실험자는 유량계의 눈금이 나타내는 계량 단위를 정확히 알아야 한다.  (1 gal=0.1337 ft3 or 3.7854 L ; 1ft3 = 7.481 gal 또는 28.316 L)

3.1.1.20  HF3 1개 - Hose Fitting, nylon, 3/4" male NPT × 1/2" tubing ID

3.1.1.21  FV 1개 - Flow Control Valve

3.1.2  전필터(prefilter) 모듈 조립용 부품

탁도가 75 NTU (nephelometry turbidity unit)를 초과하거나 여하한 이유로 인해 시료의 최소량을 채취할 수 없을 경우에 표준필터장치의 앞부분에 설치하여 사용한다.

3.1.2.1  PC 1개 - 10 μm 폴리프로필렌 전필터 카트리지(Prefilter Cartridge : PC)

3.1.2.2  female quick connect (FQ1) 1개

3.1.2.3  reducing nipple (RN1) 2개

3.1.2.4  male quick connect (MQ2) 1개

3.1.2.5  cartridge housing (CH) 1개

3.1.3  단일주입기 모듈 조립용 부품

pH 저감이 요구되는 원수 또는 처리수와 탈염소화가 필요한 처리수를 위한 장치이다.

3.1.3.1  FQ2 2개 - Female Quick Connects, 1/2" male NPT

3.1.3.2  ME 4개 - Male Elbows, 3/8" male NPT

3.1.3.3  RN2 2개 - Reducing Nipples, 3/8" male NPT × 1/2" male NPT

3.1.3.4  RB2 2개 - Reducing Bushings, 3/8" female NPT × 1/2" male NPT

3.1.3.5  IN 3개 - In-line INjectors(계량펌프(metering pump)와 적절한 connector로 injector를 대체할 수 있다.)

3.1.3.6  HC 3개 - hose clamp

3.1.3.7  표준장치를 조립할 때와 마찬가지로 reducing adaptors (RA) 4개,  PVC T자관 (TE) 4개, reducing bushings (RB1) 2개, 압력계(pressure gauge : PG) 2개, female quick connects (FQ1) 2개, male quick connects (MQ1) 2개, male quick connects 2개가 추가적으로 필요하다.

3.1.4  장치의 조합

표준여과장치는 조절기(regulator)모듈, 필터하우징(filter housing)모듈, 배출기(discharge) 모듈로 구성되며 ‘모듈'이란 여러 부품이 모여 구성하는 하나의 기능단위를 말하는 것으로 필요한 경우 채수장치 전체로부터 간단한 조작으로 분리해낼 수 있어야 한다. 채수장치의 조립은 수중바이러스 검출 및 분석연구에 대해 국가로부터 지정받은 분석실험실에서 수행한다. 모든 비압착식 나사형 연결부위(threaded & non-compression fitting)에는 테프론 테이프를 사용하여야 한다.

3.1.4.1  조절기 모듈 - 그림 1에서와 같이, 역류조절기(backflow regulator : BR)와 swivel female insert (SF)를 차례로 연결한다. 적당한 길이의 압력호스(braided tubing : BT) 한 조각을 호스 클램프(hose clamp)를 이용하여 swivel female insert의 tubing connector (HC1)에 연결한다. Tubing의 다른 한쪽 끝은 3/8 × 1/2" hose fitting (HF1)에 클램프로 연결한다. Hose fitting을 돌려 압력조절기(pressure regulator : PR)의 유입구에 연결한다. 압력조절기의 배출구는 PVC nipple (PN)을 이용하여 PVC T자관(TEE : TE)과 연결한다. 압력계(pressure gauge : PG)는 reducing bushing (RB)을 이용하여 PVC T자관의 꼭대기에 연결한다. Reducing adaptor (RA)를 PVC T자관의 마지막 남은 연결부위에 부착한다. Reducing adaptor에는 male quick connect (MQ1)를 부착한다.

3.1.4.2  필터하우징 모듈 - Reducing nipple (RN1)에 female quick connect (FQ1)을 부착한다. Reducing nipple은 카트리지 하우징(cartridge housing : CH)의 유입구에 연결한다. 다른 하나의 reducing nipple을 하우징의 배출구에 연결한다. Reducing adaptor에 male quick connect (MQ2)를 부착한다.

3.1.4.3  배출기 모듈 - Hose fitting (HF2)에 female quick connect (FQ1)를 부착한다. 적당한 길이의 압력호스를 호스 클램프(HC1)를 사용하여 hose fitting에 연결한다. 관의 다른 한쪽 끝은 새 호스 클램프(HC1)를 사용하여 swivel female insert에 부착한다. Swivel female insert를 유량계(water meter : WM)의 유입구에 부착한다. 또 하나의 swivel female insert를 유량계(WM)의 배출구에 부착하고 호스 클램프(HC1)를 사용하여 압력호스(BT) 한 조각과 연결한다. 관의 다른 한쪽 끝은 호스 클램프(HC1)를 사용하여 hose fitting (HF3)에 부착한다. Hose fitting을 돌려 유속조절밸브(flow control valve)의 유입구에 끼워 넣는다. 배수구까지 충분한 길이의 튜브를 연결하기 위해 여분의 hose fitting을 유속조절밸브에 부착할 수 있다. 배출기 모듈을 멸균할 필요는 없다.

3.1.4.4  Quick connect를 사용하여 필터하우징 모듈을 조절기 모듈과 연결한다. 연결된 조절기 및 필터하우징 모듈은 '부록 C'에서 서술한 바대로 염소로 멸균하여야 한다. 1MDS 필터 카트리지(filter cartridge : FC)는 부록 C에서 설명한 대로 전멸균하고 무균 조작하여 카트리지 하우징에 넣는다. 카트리지하우징의 덮개를 다시 덮고 카트리지하우징 렌치(wrench)를 사용하여 완전히 조인다. 하우징을 흔들어 필터가 빈틈없이 장착되었는지 확인한다. 제대로 장착된 필터는 흔들리지 않는다. 수송과정의 편의를 위해 조절기 모듈과 필터하우징 모듈을 분리해도 무방하다. 단, 모듈과 연결되는 모든 개구부(openings)는 멸균된 알루미늄 호일로 빈틈없이 싸주어야 한다.

3.1.4.5  전필터 모듈의 조립 - 그림 2와 같이, female quick connect (FQ1)를 reducing nipple (RN1)에 차례로 연결한다. Reducing nipple을 카트리지하우징(CH)의 유입구와 연결한다. 다른 하나의 reducing nipple은 하우징의 배출구에 연결한다. Male quick connect (MQ2)는 reducing adaptor에 부착한다.

조합된 장치는 염소로 멸균소독하고 미리 멸균소독된 폴리프로필렌 전필터 카트리지를 무균조작하여 하우징에 장착한다. 양 말단은 멸균된 알루미늄 호일로 덮는다. 전필터 모듈은 사용 전까지 깨끗한 장소에 보관한다.

3.1.4.6  단일 주입기(single injector) 모듈 - 그림 2와 같이 순서대로 각 부품을 조립한다. Reducing adaptor (RA)에 female quick connect를 부착한다. Adaptor를 주입기(injector : IN)의 유입구에 연결한다. 주입기의 배출구를 PVC nipple (PN)를 경유하여 PVC T자관(TE)에 연결한다. Reducing bushing (RB1)을 사용하여 압력계(pressure gauge : PG)를 PVC T자관의 꼭대기 부분과 연결한다. Reducing adaptor (RA) 다른 하나는 PVC T자관의 남은 연결부위에 부착한다. Reducing adaptor에는 male quick connect (MQ1)을 부착한다.

단일 및 이중 주입기 모듈을 염소로 멸균한다. 주입기의 개구부를 포함, 각 말단을 멸균된 알루미늄 호일로 씌운다. 주입기 연결관(Injector Tubing : IT)의 안쪽 및 바깥쪽 표면 모두 멸균한다. 조작 중에 오염시키지 않고도 양 말단을 떼어낼 수 있도록 연결관은 멸균된 플라스틱 주머니나 랩으로 싼다. 주입기 모듈은 사용 전까지 깨끗한 장소에 보관한다.

3.1.4.7  이중 주입기(double injector) 모듈 - 그림 2와 같이 순서대로 각 부품을 조립한다. Reducing adaptor (RA)에 female quick connect (FQ2)를 부착함으로써 중심부분을 조립한다. Adaptor는 PVC T자관(TE)의 상부 연결부에 연결한다. PVC T자관 연결부 중 하나에 male elbow (ME)를 부착한다. 다른 연결부에는 reducing nipple (RN2) 하나를 부착한다. 만약 quick connects 대신에 union ball joint를 사용할 경우에는 PVC nipple을 나머지 하나의 연결부에 부착한다. 주입기(IN)의 유입구 방향을 male elbow에 연결한다. 주입기의 배출구에도 male elbow 하나를 부착한다. Male elbow에는 새 PVC T자관을 연결한다. Reducing nipple (RN2 또는 PVC nipple)을 이 두 번째 PVC T자관의 다른 한쪽 끝에 연결한다. 마찬가지로 male quick connect (MQ2) 하나를 위의 reducing nipple에 부착한다(또는 두 번째 union ball joint의 한 부분을 PVC nipple에 부착한다). 두 번째 PVC T자관의 top connector를 PVC nipple을 이용하여 세 번째 PVC T자관에 연결한다. Reducing bushing (RB1)을 사용하여 압력계를 세 번째 PVC T자관의 머리부분에 연결한다. Reducing adaptor는 세 번째 PVC T자관의 남은 connector에 부착한다. Reducing adaptor에 male quick connect를 부착한다. 두 개의 male elbow (ME)를 두 번째 주입기의 유입구와 배출구에 각각 부착한다. 두 개의 reducing bushings (RB2)(또는 union ball joint를 사용할 경우, 바닥부분)를 male elbow에 연결한다. 각 reducing bushing에 female quick connect (FQ1)를 연결한다. 흐름의 방향이 첫 번째 주입기와 동일하도록 두 번째 주입기의 위치를 조정한다(주입기상의 화살표가 모두 조립품의 압력계 방향을 향해야 한다). 조립품의 완성을 위해 2개의 female quick connects를 주요 부분의 male quick connects와 연결하거나 또는 union ball joint를 사용할 경우, union ball joints의 두 부분을 연결한다.

3.1.5  기타

3.1.5.1  휴대용 pH 측정계

3.1.5.2  휴대용 온도 측정계

3.1.5.3  상업용 얼음팩

3.1.5.4  입구가 넓은 1 L 용량의 폴리프로필렌병

3.1.5.5  휴대용 아이스(단열)박스

3.1.5.6  알루미늄 호일, 기록용지, hosecock clamp, 수술용 장갑, 클램프 조절용 드라이버 혹은 플라이어, 유성펜

3.1.5.7  30 PSI에서 11.4 L/min을 공급할 수 있는 화학약품내성 펌프와 적당한 connector(원수나 처리수를 채취하는데 필요한 적정한 수압이 발생되는 수도꼭지를 사용할 수 없을 경우, 또는 정도관리 시료를 조작할 경우에 사용한다), 펌프의 초기화는 펌프제조사의 권고에 따라 수행한다.

그림 1.  표준필터장치

그림 2.  표준여과장치에 부착되는 추가 모듈

3.2  전처리를 위한 장비 및 기구

3.2.1  바이러스 탈리과정

3.2.1.1  압력계가 장치된 양압(positive pressure)의 공기 혹은 질소 압력원(pressure souce)이 실험실의 공기 호스나 펌프라면, 반드시 오일필터나 공기필터가 장착되어 있어야 한다.

3.2.1.2  5 L ∼ 20 L 용량 압력용기(dispensing pressure vessels)

3.2.1.3  복합 전극을 사용하는 pH 측정기 : 최소 0.1 pH 단위의 정밀도

3.2.1.4  나사형 클램프가 달린 멸균 가능한 압력호스(inner-braided tubing)

3.2.1.5  교반기(magnetic stirrer)와 교반막대(magnetic stir bar)

3.2.2  유기응집 농축과정

3.2.2.1  냉장이 가능한 원심분리기 (2,500 ∼ 10,000 x g)

3.2.2.2  나사형 뚜껑이 부착된 원심분리용 용기 (100 mL ∼ 1000 mL 용량)

3.2.2.3  전필터가 장착된 1회용 Acrodisc 멸균용 필터 (0.22 μm)  (필터를 사용하기 직전에는 항상 pH 7.0 ∼ pH 7.5의 소고기엑스 완충액 10 mL ∼ 20 mL를 여과시킨다. 이 과정은 시료를 여과하는 사이에 필터에 바이러스가 흡착되는 것을 방지한다.)

판매용 필터가 막힐 정도의 시료는 멸균 필터를 많이 겹쳐서 여과에 사용할 수 있다. 0.22 μm 필터(Millipore Corp. Product No. GSWP 4700)를 유리섬유 전필터(fiber glass prefilter : Millipore Corp. AP15 4700과 AP20 4700)와 여러 장 겹쳐서 멸균된 필터묶음을 만든다. 위쪽에 AP20 전단계필터를, 아래쪽엔 0.22μm 필터가 놓이도록 디스크필터 홀더(Millipore Corp. Product No. SX00 4700)에 쌓는다. 필터묶음은 각각 사용된 뒤에는 해체하여 0.22 μm 필터에 이상이 없는지 검사한다. 필터에 흠이 있거나 파손된 필터로 여과한 배지는 새로운 필터로 재여과한다.

3.3  유전자분석을 위한 장비 및 기구

3.3.1  무균작업대(laminar flow microbiological safety cabinet)

3.3.2  원심분리기 (6,000 ∼ 20,000 x g)

3.3.3  유전자증폭기(thermal cycler)

3.3.4  전자렌지

3.3.5  전기영동장치 (electrophoresis for nucleic acid)

3.3.6  gel 이미지 분석시스템

4.0  시약 및 표준용액

4.1  일반시약

4.1.1  시료채취과정

4.1.1.1  2 % 티오황산나트륨용액

티오황산나트륨(sodium thiosulfate, Na2S2O3, 분자량 : 158.10) 100 g을 증류수에 녹여 최종적으로 5000 mL의 저장용액(stock solution)을 제조하고 121 ℃에서 30분간 고압증기 멸균한다.

4.1.1.2  염산용액

5 M의 염산(hydrochloric acid, HCl, 분자량 : 36.46)용액을 각각 5 L, 1 L, 그리고 100 mL 만든다. 용액은 물시료의 pH를 조정하는데 사용하며 적어도 사용하기 24시간 이전에 준비한다.

4.1.2  시료 전처리과정

4.1.2.1  수산화나트륨용액

각각 4 g과 20 g의 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH, 분자량 : 40.00)을 최종 부피 100 mL의 증류수에 녹여 1 M 및 5 M 수산화나트륨용액을 준비한다. 수산화나트륨용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

4.1.2.2  소고기엑스완충액

소고기엑스 V 분말(Difco Laboratories Product No. 0115-17이나 동급 제품) 30 g과 글리신(glycine) 7.5 g(글리신의 최종농도 = 0.05 M)을 1.9 L의 증류수에 녹여 1.5 %의 소고기엑스 완충액을 준비한다. 1 M 혹은 5 M 수산화나트륨용액을 사용하여 pH를 9.5로 맞춘 다음, 0.01 %(w/w) tween 80 1 mL를 넣고 증류수로 최종 부피 2 L가 되도록 조절한다. 121 ℃에서 15분간 고압증기 멸균하여 실온에서 사용한다. 소고기엑스용액은 4 ℃에서 일주일간 혹은 -20 ℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

0.01 %(w/w) Tween 80은 원액 1 mL를 증류수 100 mL에 희석하여 만든다.

4.1.2.3  인산1수소나트륨·7수화물

0.15 M 40.2 g의 인산1수소나트륨(sodium phosphate dibasic, Na2HPO4․7H2O, 분자량 : 268.06)을 최종 부피 1,000 mL의 증류수에 녹인 다음, 수산화나트륨용액을 사용하여 pH를 9.0 ～ 9.5 사이로 조절하고, 121 ℃에서 15 분간 고압증기 멸균한다.

4.2  유전자분석 시약

4.2.1  유전자추출 과정

96 % ∼ 100 % 에탄올(ethanol, C2H5OH, 분자량 : 46.07) 용액

4.2.2  유전자증폭 과정

0.1 % Diethyl Pirocarbonate (DEPC) 처리된 증류수

4.2.3  전기영동 과정

4.2.3.1  1.5 % agarose gel

1.5 g의 agarose를 100 mL의 1 X TAE buffer에 첨가하여 전자렌지를 이용하여 용해한다. gel 덩어리가 보이지 않을 때까지 가열하여 용해한 후 60 ℃ 정도가 될 때까지 방치한 후 gel tray에 comb을 set하고 두께가 3 mm ∼ 5 mm가 되도록 gel을 붓는다. 30분 정도 실온에 방치하여 gel을 고정시킨다.

4.2.3.2  1 X TAE buffer

4.2.3.3  6 X loading buffer

4.2.3.4  DNA marker - 100bp DNA ladder

4.2.3.5  0.5 μg/μL의 Ethidium bromide

1 X TAE buffer 또는 증류수에 용해하여 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다. Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용하고, 사용 후에는 정화한 후 버려야한다.

4.3  표준용액

4.3.1  유전자증폭 과정

4.3.1.1  음성대조군 - 0.1 % Diethyl Pirocarbonate (DEPC) 처리된 증류수

4.3.1.2  양성대조군 - 노로바이러스 환자 가검물

5.0  시료채취 및 관리

5.1  시료채취

채수자는 반드시 멸균된 수술용 장갑을 착용해야하며, 장갑을 착용한 손이 사람의 피부나 오염되었을 수 있는 부품에 닿았을 경우 새 장갑으로 바꿔 착용해야 한다.

5.1.1  수도꼭지가 있는 경우

5.1.1.1  채취할 수도꼭지 또는 배출구에 수도꼭지 → 조절기 모듈 → 배출기 모듈 → 1 L 용량 플라스틱병 순서대로 연결 한다.

그림 3.  장치 연결 순서

5.1.1.2  수도꼭지 수압이 30 PSI 정도가 되도록 한다. 만일 최고 수압이 30 PSI를 넘지 못하면 압력조절기(pressure regulator) 등으로 최대압력까지 조절한다.

5.1.1.3  이후 약 70 L 정도의 물을 흘려보낸 후 시료채취기록부(sample data sheet)에 시료번호, 채취위치, 채취자의 이름 등을 기록하고 플라스틱 병에 담긴 물시료의 pH, 온도, 탁도, 잔류염소를 측정하여 기록한다.

5.1.1.4  수도꼭지를 잠그고 시료가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

5.1.1.4.1  pH가 8 이상일 때

5.1.1.4.1.1  pH 조절과 잔류염소의 제거를 위해 이중주입기 모듈을 조절기 모듈 → 이중주입기 모듈 → 배출기 모듈 순서대로 연결한다.

5.1.1.4.1.2  멸균된 튜브로 주입기와 0.1 M 염산용액이 담긴 매스실린더를 연결하고, 1 L 플라스틱병에 담긴 물시료의 pH가 6.5 ∼ 7.5가 되도록 조절한 후 pH를 시료채취기록부에 기록한다.

5.1.1.4.1.3  이중주입기의 나머지 한쪽 튜브는 2 % 티오황산나트륨용액이 담긴 다른 매스실린더에 넣고 2 % 티오황산나트륨용액을 물 1 gal (3.8 L) 당 10 mL가 주입되도록 다음 식을 이용하여 주입율을 조정한다(시료 중 잔류염소가 없을 경우 티오황산나트륨을 주입할 필요가 없으며, 단일주입기 모듈을 사용한다.).

water    Liter          10 mL thiosulfate        thiosulfate      mL

flow    □□□□□□□   X     □□□□□□□□□□□□□□□    =    injection   ․ □□□□

rate       min            Liter water              rate        min

5.1.1.4.2  pH가 8 이하일 때

잔류염소 제거를 위해 단일주입기를 연결하여 위와 같이 물 1 gal (3.8 L) 당 2 % 티오황산나트륨용액 10 mL가 주입되도록 한다(시료 중 잔류염소가 없을 경우 티오황산나트륨을 주입할 필요가 없으며, 단일주입기 모듈을 사용한다.).

5.1.1.5  바이러스시료채취기록부에 시료채취일, 시작 시간, 유량계의 처음 수치를 기록하고, 필터하우징 모듈을 배출기 모듈 앞에 조절기 모듈 → 주입기 모듈 → 필터하우징 모듈 → 배출기 모듈 순서로 연결한다.

5.1.1.5.1  필터하우징 모듈

양전하를 띄고 있는 바이러스여과용 필터를(필요시 고압증기멸균(121 ℃, 30분)) 별도로 염소 소독한 필터하우징에 넣어 조립한 후 멸균한 알루미늄 호일로 유출 및 유입부가 달린 마개를 잘 포장하여 시료채취 전에 미리 준비한다.

그림 4.  수도꼭지 및 원수펌프에서 시료채취 모습

5.1.1.6  천천히 물을 흐르게 하면서 필터하우징 상단의 감압단추(vent button)를 눌러 필터하우징 내부의 공기가 완전히 빠지도록 한 후 감압단추를 놓고 수도꼭지를 완전히 연다.

5.1.1.7  조절기의 압력은 30 PSI 이하, 주입기의 압력은 조절기 압력보다 35 % 낮게 조정하고 500 L 이상을 통과시킨 후 수도꼭지를 잠근다.

5.1.1.8  바이러스시료채취기록부에 시료채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치를 기록한다.

5.1.1.9  필터하우징을 플라스틱백에 넣어 아이스박스에 담고 냉장상태로 즉시 실험실로 운반한다.

5.1.2  수도꼭지를 이용할 수 없는 경우

5.1.2.1  채취할 수도꼭지 또는 배출구에 양압펌프 → 조절기 모듈 → 배출기 모듈 → 1 L 용량 플라스틱병 순서대로 연결 한다.

5.1.2.2  조절기 모듈의 수압이 30 PSI 정도가 되도록 한다. 만일 최고 수압이 30 PSI를 넘지 못하면 압력조절기(pressure regulator) 등으로 최대압력까지 조절한다.

5.1.2.3  이후 약 70 L 정도의 물을 흘려보낸 후 시료채취기록부(sample data sheet)에 시료번호, 채취위치, 채취자의 이름 등을 기록하고 플라스틱병에 담긴 물시료의 pH, 온도, 탁도, 잔류염소를 측정하여 기록한다.

5.1.2.4  양압펌프의 밸브를 잠그고 시료가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한 후 “가” 항의 순서와 동일하게 시료채취를 한다.

그림 5.  양압펌프를 이용한 시료채취 모습

6.0  전처리(탈리 및 농축)

6.1  노로바이러스 탈리

6.1.1  냉장된 상태로 도착한 필터는 시료채취 시작시간으로부터 72시간 이내에 탈리 과정을 시작해야 한다.

6.1.2  필터가 들어 있는 필터하우징의 유입구와 배출구를 튜브로 연결하고 유입구는 공기나 질소압력원에, 배출구는 멸균된 유리 비커 순으로 각각 연결한다. (오일필터가 장착된 튜브 → 압력원(양압)-멸균된 압력용기 → 튜브 → 필터하우징-튜브 → 2 L 용량 비커)

그림 6.  바이러스 탈리 모습

6.1.3  0.01 %(w/w) tween 80 1 mL 포함된 1.5 % beef extract완충액(pH 9.5) 1 L를 압력용기에 넣고 뚜껑을 닫은 후 압력조절밸브를 닫는다.

6.1.4  필터하우징의 감압단추(vent button)를 누른 상태로 압력용기의 압력조절밸브를 서서히 열어 beef extract 완충액이 필터하우징 내에 완전히 차도록 한 다음 감압 단추를 통해 용액이 넘쳐흘러 나오기 시작하면 감압 단추에서 손을 떼고 압력조절밸브를 닫은 후 1분 ～ 5분간 방치하여 필터에 흡착된 바이러스를 탈리시킨다. 거품 발생을 방지하기 위해 압력조절밸브를 천천히 열어 멸균된 비커에 탈리액을 수집한다. 감압 단추(vent button)에서 넘쳐 나온 완충액은 수술용 장갑을 착용한 후 염소계 소독액을 사용하여 소독한다.

6.1.5  비커에 수집된 beef extract완충액을 압력용기로 다시 옮겨 담고 1, 2 단계의 과정을 3회 반복한다.

6.1.6  1 M 염산용액으로 최종 탈리용액의 pH를 7.0 ∼ 7.5 사이로 조절하고 최종 탈리량을 기록한다. 향후 재실험 등을 위해 필요에 따라 최종 탈리 시료 중 10 % 이내에서 보관할 수 있다.

6.2  탈리시료의 농축

6.2.1  탈리액이 담긴 비커에 교반막대를 넣고 교반기로 잘 섞으면서  1 M 염산용액으로 서서히 pH를 3.5 ± 0.1로 맞춘 다음 30분 이상 천천히 섞는다.

그림 7.  탈리액의 유기응집

6.2.2  침전물이 생기면 beef extract 탈리액을 원심분리용 용기에 옮겨 담아 원심분리한다. (2,500 x g, 15분, 4 ℃)

6.2.3  원심분리 후, 상층액을 버리고 바닥의 침전물을 0.15 M 인산1수소나트륨용액 20 mL ～30 mL (pH 9.0 ～ pH 9.5)로 녹여 완전히 재부유시킨다.

6.2.4  재부유된 용액을 다시 원심분리한다(4,000 ～ 10,000 x g, 10분, 4 ℃).

6.2.5  침전물은 버리고 상층액을 모아 pH를 7.0 ～ 7.5로 맞춘다.

6.2.6  미생물오염을 방지하기 위해 50 mL 주사기를 이용하여 상층액을 멸균용 필터로 여과한다. 사전에 10 mL ～ 20 mL의 1.5 % beef extract완충액(pH 7.0 ～ pH 7.5)을 멸균용 필터에 통과시켜 시료 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지한다.

그림 8.  최종 농축액의 멸균필터 여과장면

6.2.7  최종 농축 시료량(FCSV = final concentrated sample volume)을 기록하고 시료를 24시간 이내에 분석할 경우는 4 ℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70 ℃에 보관한다.

7.0  유전자분석

7.1  RNA 분리

Viral RNA Mini kits (QIAGEN) 또는 동등한 기능을 갖는 제품을 사용한다. RNA 분리용 kit에 포함된 방법 등 적절한 실험법에 따라서 노로바이러스 RNA를 추출한다.

7.1.1  Buffer AVL (carrier RNA포함) 560 μL를 1.5 mL tube에 넣는다.

7.1.2  시료 140 μL를 넣고 15초 동안 혼합(pulse-vortex)한다.

7.1.3  실온에서 10분 동안 정치한 후 가볍게 spin-down한다.

7.1.4  Ethanol (96 % ∼ 100 %) 560 μL를 넣고 15초 동안 혼합한 후 spin-down한다.

7.1.5  혼합된 시료 630 μL를 QIAamp Mini spin column (2 mL tube 포함)에 넣는다.

7.1.6  6,000 x g에서 1분 동안 원심분리 한다(RNA 흡착단계).

7.1.7  필터된 액과 tube는 버린다.

7.1.8  QIAamp spin column을 새로운 2 mL tube에 옮긴다.

7.1.9  Buffer AW1 500 μL를 QIAamp spin column에 넣는다.

7.1.10  6,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다(1번째 wash단계).

7.1.11  QIAamp spin column을 새로운 2 mL tube에 옮긴다.

7.1.12  Buffer AW2 500 μL를 QIAamp spin column에 넣는다.

7.1.13  20,000 x g에서 3분 동안 원심분리 한다(2번째 wash 단계).

7.1.14  QIAamp spin column을 최대속도로 1분간 원심분리 한다.

7.1.15  1.5 mL tube에 QIAamp spin column을 장착한다.

7.1.16  Buffer AVE 약 60 μL를 column에 주입하고 1분 동안 정치한다.

7.1.17  6,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다.

7.1.18  즉시 사용하지 않을 시 -70 ℃에 보관하여 사용한다.

7.2  역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, Reverse transcription-PCR)

7.2.1  1차 PCR (one step RT-PCR, 질병관리본부 간염폴리오팀)

7.2.1.1  Norovirus GI 검출/ viral RNA 5 μL와 RT-PCR pre-mix 20 μL (GI-F1M, GI-R1M primer set 20 pmol) 혼합한다.

7.2.1.2  Norovirus GII 검출/ viral RNA 5 μL와 RT-PCR pre-mix 20 μL (GII-F1M, GII-R1M primer set 20 pmol) 혼합한다.

7.2.1.3  양성대조군으로 노로바이러스 RNA를 사용하고, 음성대조군으로 멸균된 증류수를 사용한다.

표 1.  1차 PCR (one step RT-PCR) 반응조건

반응 종류	조 건	반응 반복수
역전사 반응	45 ℃ 30 min	1 cycle
1차 PCR	94 ℃ 5 min	1 cycle
	94 ℃ 30 sec	35 cycles
	55 ℃ 30 sec
	72 ℃ 1 min 30 sec
	72 ℃ 7 min	1 cycle

7.2.2  2차 PCR (nested PCR)

7.2.2.1  Norovirus GI 검출/ 1차 PCR product 2 μL와 2차 PCR Mix (GI-F2, GI-R1M primer set 20 pmol) 48 μL 혼합

7.2.2.2  Norovirus GII 검출/ 1차 PCR product 2 μL와 2차 PCR Mix (GII-F3M, GII-R1M primer set 20 pmol) 48 μL 혼합

표 2.  2차 PCR (nested PCR) 반응조건

반응 종류	조 건	반응 반복수
2차 PCR	94 ℃ 5 min	1 cycle
	94 ℃ 30 sec	25 cycles
	55 ℃ 30 sec
	72 ℃ 1 min 30 sec
	72 ℃ 7 min	1 cycle

표 3.  노로바이러스 Genogroup I, II 검출을 위한 primer*

Virus	Primer	Sequences (5'→3')	polarity	size (bp)
Norovirus Genogroup-I	GI-F1M	CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT	sense	313
	GI-F2	ATG ATG ATG GCG TCT AAG GAC GC	sense
	GI-R1M	CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG	antisense
Norovirus Genogroup-II	GII-F3M	TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART	sense	310
	GII-F1M	GGG AGG GCG ATC GCA ATC T	sense
	GII-R1M	CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT	antisense
* 질병관리본부 간염폴리오팀 제작 (Y=C/T, R=A/G, I=C/G/A/T)

7.3  결과확인 및 판정

7.3.1  전기영동(electrophoresis)

7.3.1.1  전기영동은 1.0 x TAE buffer에 1.5 % agarose gel 사용한다.

7.3.1.2  PCR 생산물 약 5 μL와 6 x loading buffer 1 μL를 혼합하여 전기영동 실시한다.

7.3.1.3  전기영동 결과 PCR 생산물의 크기가 313 bp이면 Norovirus genogroup I 양성으로 판단한다.

7.3.1.4  310 bp이면 Norovirus genogroup II 양성으로 판단한다. PCR band가 나타나지 않을 경우 음성으로 판단한다.

7.3.2  판정 : 유전자 염기서열분석(sequencing)

7.3.2.1  전기영동 후 PCR 산물은 염기서열분석에 의해 Norovirus genogroup 및 genotype을 최종 판정한다. 염기서열분석은 정제한 PCR 산물로 수행하고, 필요에 따라 유전자를 cloning하여 염기서열을 분석한다.

7.3.2.2  유전자염기서열 수행을 위하여 전기영동에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 타입 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2/GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M/GII-R1M의 primer를 사용하여 수행한다. 유전자염기서열 분석 PCR 반응 조건은 96 ℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96 ℃에서 10초간, 50 ℃에서 5초간, 60 ℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 후 60 ℃에서 10분간 연장반응을 시킨다. 유전자 염기서열 분석장비가 없는 경우 서열분석 전문 업체에 의뢰하여 분석할 수 있다.

7.3.2.3  유전자염기서열 실시 후 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 등에 등록된 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 노로바이러스 양성으로 최종 판정한다.

8.0  결과보고

행정사항과 관련된 항목별 시험결과의 표시는 [별표2]에 따른다.

9.0  부록

시료채취 기록부

1. 채수시료번호 :

2. 일반사항

ㅇ 지점명 :

ㅇ 채수지점 및 주소 :

ㅇ 수온(℃) :

ㅇ 탁도(NTU) :

ㅇ 수소이온농도 : 조절전;           조절후;

ㅇ 치오황산염 첨가유무 :  □첨가,   □ 미첨가

ㅇ 시설규모 등 개요 :

3. 채취사항

ㅇ 총 채수량 :

ㅇ 유량계에 나타난 수(L) : 채수직전;      채수직후;

ㅇ 채수일자 : 채수직전(일, 시간);       채수직후(일, 시간);

4. 특이사항

ㅇ 채수한 시료 이동 날짜 :

ㅇ 채수시료 보관상태(냉동 혹은 냉장) :

ㅇ 기타사항 :

시료전처리 및 유전자분석 기록부
채수시료 번호:
분석 실험실 명:
시료를 탈리한 날짜:		시간:
최종 탈리량(Elute): mL
보관할 탈리 시료량1): mL
농축한 날짜:		시간:
최종농축시료량(FCSV)2): mL
RNA 추출 일시 :	시료량 :		RNA 추출량:
1차 PCR 일시 :		2차 PCR 일시 :
전기영동 일시 :		염기서열분석일 :
전기영동 결과 사진			전기영동 결과판독 Norovirus GⅠ: Norovirus GⅡ:
염기서열결과 : (genotype)
분석자: (서명)
참고: 1) 재실험 등을 위해 최종 탈리 시료 중 10 % 이내에서 자율적으로 보관할 수 있다. 2) 최종농축량(Final concentrated sample volume)